蔣含偉，解秀梅*，祁天榮，李雪梅

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源 812100；2.佰匯緣寵物醫(yī)院，青海西寧 810001；3.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016)

貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus,FPV)主要感染貓科、鼬科等多種動(dòng)物，該病毒是肉食獸細(xì)小病毒屬中感染范圍最廣、致病性最強(qiáng)的病原，其病死率和感染率均較高，1984年我國(guó)首次分離得FPV后，隨后在我國(guó)不斷發(fā)生與流行，該病嚴(yán)重威脅我國(guó)寵物及野生貓科動(dòng)物的健康[1-3]。貓細(xì)小病毒可以感染不同階段的貓，以3月齡～5月齡的幼貓易感，被感染的動(dòng)物以高熱、嘔吐、腹瀉、急性腸炎、泛白細(xì)胞減少癥為主要臨床癥狀，該病毒又稱為貓泛白細(xì)胞減少癥病毒。寵物貓主要通過(guò)注射五聯(lián)、六聯(lián)等多聯(lián)疫苗進(jìn)行預(yù)防，寵物貓的感染率可達(dá)70%以上，其病死率為50%以上，對(duì)寵物貓的健康養(yǎng)殖帶來(lái)了嚴(yán)重的影響[4-6]。FPV為單股的DNA病毒，且無(wú)囊膜，其病毒粒子直徑約在20 nm～24 nm之間，呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。FPV基因組中主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白(capsid protein 1,VP1)、(capsid protein 2，VP2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein 1,NS1)、(nonstructural protein 2,NS2)，其中結(jié)構(gòu)蛋白中的VP2蛋白主要決定FPV病毒的血凝活性，同時(shí)該蛋白可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，起到自我保護(hù)作用，具有裝配病毒樣顆粒的能力，VP2蛋白對(duì)該病毒的復(fù)制及感染宿主的范圍具有一定的決定作用[7-8]。因此，分析VP2基因的遺傳變異具有一定意義。

2020年4月，從佰匯緣寵物醫(yī)院就診的疑似寵物貓F(tuán)PV感染病例，采集患病寵物的糞便、血清等病料進(jìn)行FPV分離，得到1株FPV，命名為XNF-1株，用PCR對(duì)分離的FPV流行株的VP2基因進(jìn)行克隆、測(cè)序并分析其序列遺傳變異情況，為寵物貓F(tuán)PV的防控及疫苗研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 2020年4月，佰匯緣寵物醫(yī)院就診的疑似寵物貓F(tuán)PV感染病例，該病寵物貓未經(jīng)FPV疫苗免疫，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等現(xiàn)象，F(xiàn)PV膠體金試紙條檢測(cè)為陽(yáng)性，采集糞便、血清等病料經(jīng)處理接種貓腎傳代細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離。

1.1.2 主要試劑 貓腎傳代細(xì)胞(CRFK)、貓F(tuán)PV陽(yáng)性血清、FITC標(biāo)記山羊抗鼠抗體均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;CRFK由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疾病檢測(cè)中心傳代保存；病毒DNA提取試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；18T載體、ExTaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，北京中科瑞泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫水浴鍋(LHH-4型)，常州金壇良友儀器有限公司產(chǎn)品；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9092),上海恒一儀器制造有限公司產(chǎn)品；梯度PCR儀(G5150),美國(guó) Agilent Technologie 公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-8C型)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡(4342型)，西尼科光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 采集疑似寵物貓F(tuán)PV糞便、血清等病料加入無(wú)菌的適量的PBS制成混懸液，置-80℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清過(guò)濾除菌，加入雙抗后，置-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離培養(yǎng) 從液氮中取出CRFK細(xì)胞后，37℃室溫解凍，加入細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)后，分到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，將上述病料處理的上清按照1/10的比例接種到CRFK置 于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，未經(jīng)接種上清的病料細(xì)胞為空白對(duì)照，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)。盲傳至4代～5代，接毒CRFK細(xì)胞3 d出現(xiàn)80%的細(xì)胞病變后收毒，反復(fù)凍融后3次，置-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 參考文獻(xiàn)[9]方法，取出現(xiàn)典型細(xì)胞病變的CRFK細(xì)胞進(jìn)行收毒，離心取上清，用20 g/L的磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀察其形態(tài)學(xué)。

1.2.4 病毒的PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[10]，參照GenBank中FPV基因組序列，設(shè)計(jì)FPV鑒定引物，F(xiàn):5′-GGATGGGTGGAAATCACAGC-3′，R:5′-ATAACCAACCTCAGCTGGTC-3′，擴(kuò)增片段大小為845 bp。用病毒DNA提取試劑盒提取CRFK細(xì)胞培養(yǎng)物基因組DNA，用鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，回收目的基因片段，連接到18T載體上，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定 參考文獻(xiàn)[11]方法，對(duì)PCR檢測(cè)FPV為陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定。

1.2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[12]方法，選擇4只60日齡的健康的試驗(yàn)貓(FPV膠體金試紙條、ELISA試劑盒檢測(cè)FPV為陰性)，攻毒組2只試驗(yàn)貓口服病毒混懸液2 mL，對(duì)照組給予等量的PBS，攻毒組2只試驗(yàn)貓隔離飼養(yǎng)，每日觀察試驗(yàn)貓的發(fā)病情況，攻毒后第4天開始收集糞便進(jìn)行病毒鑒定。

1.2.7 病毒的VP2基因PCR擴(kuò)增與序列分析 參考文獻(xiàn)[13]，參照GenBank中FPV基因序列，設(shè)計(jì)VP2基因引物，F(xiàn):5′-TGTAACTCAAATGGGAATGGAAATA-3′，R:5′-ATAACAACAACAATAGTTAG-3′，片段大小為1 078 bp。對(duì)XNF-1株進(jìn)行PCR鑒定，回收目的基因片段，連接到18T載體上，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。XNF-1株的測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的FPV參考株進(jìn)行同源比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，分析XNF-1株的VP2基因遺傳變異特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離鑒定結(jié)果

將采集的糞便、血清等病料組織經(jīng)處理后，接種于CRFK細(xì)胞中進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，感染組的CRFK細(xì)胞在盲傳6代時(shí)出現(xiàn)CPE，CRFK細(xì)胞出現(xiàn)了萎縮、聚堆、脫落、個(gè)別的細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變形等(圖1)，將分離毒株命名為XNF-1株。未感染組的CRFK細(xì)胞未見明顯的病變(圖2)，XNF-1株在電子顯微鏡下可見觀察無(wú)囊膜的、圓形的、直徑大約23 nm的病毒粒子(圖3)，與報(bào)道的FPV形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)基本相似。XNF-1株初步判定為FPV。

圖1 接毒XNF-1株后CRFK細(xì)胞形態(tài)(40×)

圖2 未接毒的CRFK細(xì)胞形態(tài)(40×)

圖3 XNF-1株負(fù)染病毒粒子形態(tài)

2.2 病毒PCR鑒定結(jié)果

用病毒DNA提取試劑盒提取CRFK細(xì)胞培養(yǎng)物基因組DNA，用FPV鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，XNF-1株的細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)增出大約為845 bp目的條帶(圖4)。 XNF-1株的測(cè)序結(jié)果與與GenBank中登錄的FPV參考株同源性在97.5%～99.8%之間。XNF-1株P(guān)CR鑒定為FPV。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～7.XNF-1株的細(xì)胞培養(yǎng)物; 8.空白對(duì)照

2.3 病毒間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)結(jié)果

將XNF-1株的細(xì)胞培養(yǎng)物按4%的比例接種到CRFK細(xì)胞，設(shè)立對(duì)照組，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h～48 h進(jìn)行進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，用倒置熒光顯微鏡可以觀察接種XNF-1株的CRFK細(xì)胞。結(jié)果顯示， 感染組的CRFK細(xì)胞呈現(xiàn)特異性綠色熒光(圖5)，對(duì)照組的CRFK細(xì)胞未見有特異性綠色熒光(圖6)。

圖5 XNF-1株IFA檢測(cè)結(jié)果(200×)

圖6 對(duì)照組CRFK細(xì)胞(200×)

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

攻毒試驗(yàn)組的貓?jiān)诠ザ竞蟮牡?天開始出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退，嚴(yán)重腹瀉伴有嘔吐、排出惡臭的稀便、脫水，在試驗(yàn)的第10天，攻毒試驗(yàn)組的2只試驗(yàn)貓死亡，經(jīng)FPV膠體金試紙條檢測(cè)血清為陽(yáng)性，PCR檢測(cè)感染組貓糞便FPV陽(yáng)性。對(duì)照組貓中未見任何異常，說(shuō)明XNF-1株對(duì)貓具有致病性。

2.5 病毒的VP2基因與序列分析

用PCR方法對(duì)分離的XNF-1株的VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，XNF-1株增出大約為1 078 bp目的條帶，與預(yù)期大小相符(圖7)。XNF-1株的VP2基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的10株FPV/CPV及6株參考株序列核苷酸序列的同源性在98.1%～99.9%之間。利用DNA Star軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，并分析XNF-1株的VP2基因遺傳變異特點(diǎn)(圖8)。結(jié)果顯示，XNF-1株與FPV-C株、 FPV-D株、FPV-A株、FPV-B株、FPV-E株、FPV-USA株位于同一分支，遺傳距離較近，其同源性在99.2%～99.9%之間，與FPV-C株、 FPV-D株、FPV-A株位于同一分支，與FPV-A株位于同一分支，遺傳距離最近。XNF-1株與其他參考株相比同源性較遠(yuǎn)通過(guò)對(duì)分離的XNF-1株與16株參考毒株對(duì)比， XNF-1株的VP2基因序列中只是個(gè)別堿基發(fā)生變化，編碼的氨基酸未發(fā)生缺失，說(shuō)明分離的XNF-1株未發(fā)生明顯變異。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.XNF-1M.DNA Marker DL 2 000; 1.XNF-1 strain

圖8 XNF-1株的VP2基因基因序列的進(jìn)化樹結(jié)果

3 討論

貓細(xì)小病毒(FPV)是危害貓科、鼬科等多種動(dòng)物的主要病毒性疾病之一，該病對(duì)幼貓極易感，且具有發(fā)病急、傳播性快、病死率高的特點(diǎn)，對(duì)貓科及野生肉食動(dòng)物的健康養(yǎng)殖具有較大的威脅。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，F(xiàn)PV在世界各地區(qū)廣泛分布流行，在我國(guó)的多個(gè)省區(qū)廣泛流行，從死亡的貓、虎、浣熊等多種野生動(dòng)物分離到FPV[13-15]。因此，加強(qiáng)FPV流行監(jiān)測(cè)，減少該病的發(fā)生與流行具有重要的意義。貓細(xì)小病毒(FPV)損傷動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，破壞其單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，尤其是使白細(xì)胞減少，造成機(jī)體免疫力下降，引發(fā)其他相關(guān)疾病[16-17]。本試驗(yàn)從疑似寵物貓F(tuán)PV糞便、血清等病料中分離得到1株病毒，命名為XNF-1株，經(jīng)過(guò)鑒定為FPV，通過(guò)致病性試驗(yàn)對(duì)貓具有很強(qiáng)的致病。因此，對(duì)分離的XNF-1株的VP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析其遺傳變異情況。

本研究分離的XNF-1株的VP2基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的10 株FPV/CPV及 6 株VP2蛋白參考株序列核苷酸序列的同源性在 98.1%～99.9%之間。且與FPV-C株、 FPV-D株、FPV-A株位于同一支，與FPV-A株位于同一分支，遺傳距離最近。與其他參考株相比同源性較遠(yuǎn)。分離的XNF-1株VP2基因序列編碼的氨基酸未發(fā)生缺失，只是個(gè)別堿基發(fā)生變化，從而說(shuō)明分離的XNF-1株未發(fā)生明顯變異。張雪竹等[8]報(bào)道了從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院分離的FPV的VP2基因與分離株AB054226(日本)、KX900570(長(zhǎng)春)株親緣關(guān)系較近。劉琪等[9]分離的PLVBJO4株VP2基因與2017年意大利分離株位于同一分支,與其他分離株親緣性遠(yuǎn)。本試驗(yàn)與上述報(bào)道存在一定差異性，可能與地區(qū)有關(guān)。貓細(xì)小病毒目前沒(méi)有特效藥物進(jìn)行治療，主要通過(guò)多聯(lián)苗進(jìn)行免疫預(yù)防該病發(fā)生，臨床中經(jīng)常出現(xiàn)免疫失敗，引起動(dòng)物發(fā)病。因此，應(yīng)該注意該病防控，尤其是寵物貓制定出有效免疫程序，定期檢定，才能有效控制寵物FPV的發(fā)生與流行。本研究為寵物貓細(xì)小病毒病防控及疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。