馬春麗，王 利，王羚鴻，董 超，潘海婷，包玉龍

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是廣泛使用的非處方鎮(zhèn)痛藥和退熱藥的常見(jiàn)成分［1］。 盡管APAP 給藥劑量（4 g/d）對(duì)健康成人是安全的，但當(dāng)劑量超過(guò)10～12 g/d 時(shí)，APAP 可能導(dǎo)致急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）［2］。APAP 過(guò)量是導(dǎo)致ALF 的主要原因， 在美國(guó)占所有ALF 的46%，在歐洲占40%～70%［3］。此外，慢性肝病患者或兒童對(duì)APAP 治療劑量的反應(yīng)可發(fā)展為一系列臨床相關(guān)肝病， 使得有意或無(wú)意的APAP 過(guò)量成為西方國(guó)家藥物誘導(dǎo)肝損傷（DILI）最常見(jiàn)的原因［4］。近年來(lái)，對(duì)乙酰氨基酚肝毒性的分子機(jī)制得到了廣泛研究，但對(duì)APAP 誘導(dǎo)的ALF 的具體分子機(jī)制尚不清楚［5-6］。 該研究建立了APAP 誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型， 并對(duì)損傷后第2 天的損傷肝臟組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行RNA-seq， 試圖探究在急性肝損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相關(guān)基因和信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J 小鼠6 只， 隨機(jī)分為2 組，每組3 只，分別為正常小鼠組（對(duì)照）、APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天模型組。 實(shí)驗(yàn)用小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

APAP（Sigma，美國(guó)），Trizol RNA 提取試劑盒（Invitrogen，美國(guó)），NEBNextUltraTMRNA 文庫(kù)制備試劑盒（BioLabs，英國(guó)），UltraPure 瓊脂糖（Invitrogen，美國(guó)）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立 選擇6 周齡雄性C57BL/6J野生型小鼠經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)環(huán)境的飼養(yǎng)， 模型組腹膜內(nèi)注射200 mg/kg APAP 溶液，建立急性肝損傷模型。 建模后第2 天，對(duì)小鼠進(jìn)行異氟烷麻醉，解剖肝臟。 解剖前，小鼠停止進(jìn)食12 h，自由飲水。

1.3.2 組織RNA 提取 小鼠肝臟組織在液氮中研碎。 按照TRIzol RNA 提取試劑盒說(shuō)明書，提取RNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。為監(jiān)測(cè)RNA 降解和污染，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。 使用NanoPhotometer分光光度計(jì) （I MPLEN，CA，USA） 和QubitRNA Assay Kit in Qubit2.0 Flurometer（Life Technologies，CA，USA）分別檢測(cè)RNA 的純度和濃度。使用RNA Nano 6000 Assay Kit in Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，CA，USA）評(píng)估RNA 完整性。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)建立 使用3 μg RNA 作為模板，按照NEBNext UltraTMRNA 文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建用于Illumina系統(tǒng)的cDNA 文庫(kù)。用隨機(jī)六聚體引物、M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 （RNase H-）和DNA 聚合酶Ⅰ、RNase H 分別合成第一鏈和第二鏈cDNA，并進(jìn)行純化。 然后采用AMPure XP 系統(tǒng)（Beckman Coulter， 美國(guó)）， 優(yōu)先選擇長(zhǎng)度為150～200 bp 的cDNA 片段， 使用3 μL USER 酶（NEB，美國(guó)）將cDNA 進(jìn)行切割，將adapters 連接到DNA片段的平滑末端，進(jìn)行PCR。構(gòu)建正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組樣本和APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組樣本的2 個(gè)cDNA 文庫(kù)。 將cDNA 文庫(kù)保存在干冰中，送至北京諾禾致源基因生物有限公司利用Illumina Hiseq 平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 得到測(cè)序讀數(shù)的原始讀長(zhǎng)（Raw reads），經(jīng)過(guò)Raw reads 過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查（Q20 和Q30）后，使用TopHat 2.0.9 將clean reads 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，分別分析外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的定位率和總定位率。 使用HTSeq 0.6.1 計(jì)算每個(gè)基因的定位率。 使用RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）， 即每百萬(wàn)reads 中來(lái)自某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads 數(shù)，估計(jì)基因表達(dá)水平。使用DESeq R 包（1.10.0）分析具有生物學(xué)重復(fù)的差異基因的表達(dá)，以P<0.05 為顯著差異。 利用KOBAS 軟件確定KEGG（京都基因和基因組百科全書） 信號(hào)通路中差異表達(dá)基因的靜態(tài)富集。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與過(guò)濾結(jié)果

表1 包含了APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天和正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組參數(shù)， 包括原始讀長(zhǎng)（raw reads）、可用讀長(zhǎng)（clean reads）及可用讀長(zhǎng)與參考基因組的定位率。 從表1 可以看出，在APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組 （共3 個(gè)樣品， 樣品名稱分別為AP2_1、AP2_2、AP2_3） 中共得到原始讀長(zhǎng)193 132 256條，正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組（共3 個(gè)樣品，樣品名稱分別為C1、C2、C3） 中共得到的原始讀長(zhǎng)177 777 906 條。 在APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織和正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中，經(jīng)過(guò)過(guò)濾篩選的可用讀長(zhǎng)分別為185 223 780 條和170 601 288 條。 APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織和正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組的質(zhì)量值≥20 的堿基占比（Q20）、質(zhì)量值≥30 的堿基占比（Q30）、外顯子定位率、內(nèi)含子定位率和總定位率的平均值分別為97.78%、93.75%、95.99%、2.14%和95.50%（見(jiàn)表1）。

表1 小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與過(guò)濾結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因的鑒定與分析

對(duì)正常小鼠、APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組分別進(jìn)行測(cè)序、組裝、分析和注釋，使用DESeq R 包確定DEGs。 對(duì)肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 結(jié)果顯示，APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天與正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組相比，共有7 270 個(gè)DEGs，包括3 707 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因和3 563 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因，P<0.05，F(xiàn)DR<0.01（見(jiàn)圖1）。

圖1 APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因火山圖

在所有顯著上調(diào)表達(dá)基因中，Col3a1 基因在肝損傷組織中的表達(dá)水平最高 （7 611.243 RPKM），是正常小鼠肝臟組織表達(dá)量的10 倍， 其次是Apoa4 基 因， 再 次 是Lcn2、Col1a2、Col1a1 和Anxa2 基因。這些DEGs 在肝損傷組織中相對(duì)表達(dá)水平高于4 000，在正常肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)水平低于600。 表2、表3 列出了APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天顯著上調(diào)、顯著下調(diào)表達(dá)基因中前20 個(gè)基因的名稱、基因ID、表達(dá)變化量、顯著性等信息。 顯著上調(diào)表達(dá)基因中表達(dá)量變化最大的是Col1a1 基因（log2FoldChange 為5.324 9）和Gsta1 基因（log2FoldChange 為5.239 1），上調(diào)表達(dá)約40 倍， 其次是S100a6 基因 （log2FoldChange 為5.090 7），上調(diào)表達(dá)約34 倍，再次是Col1a2、Ccr2、Lgals3、Anxa2 基因，這些基因表達(dá)量在10 倍以上（見(jiàn)表2）。

表2 APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中前20 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因

顯著下調(diào)表達(dá)基因中，差異表達(dá)量位于前10的 基 因 是Slc1a2、Glul、Acaa1b、Aldh3a2、Hsd3b5、Aadac、Mup3、Cyp8b1、Ces1f 和Gch1， 這些基因被下調(diào)表達(dá)2.4～184 倍。其中Slc1a2 和Hsd3b5 基因在小鼠肝損傷組織中的表達(dá)分別是正常小鼠肝臟組織的-184 倍和-26 倍（見(jiàn)表3）。

表3 APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中前20 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因

2.3 KEGG 通路富集分析

KEGG 是系統(tǒng)分析基因功能的數(shù)據(jù)庫(kù)， 將基因組信息與功能信息聯(lián)系起來(lái)。 為鑒定APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中重要的KEGG 通路， 該研究對(duì)DEGs 進(jìn)行KEGG 富集分析。 分析結(jié)果顯示，APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組共有2 515 個(gè)DEGs在316 個(gè)不同的KEGG 通路中富集。 同時(shí)注釋了119 條顯著富集DEGs 的KEGG 通路 （50 條下調(diào)基因富集通路和69 條上調(diào)基因富集通路）。APAP急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組顯著上調(diào)表達(dá)基因富集的信號(hào)通路主要是趨化因子信號(hào)通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、ECM 受體相互作用信號(hào)通路等免疫和炎癥相關(guān)信號(hào)通路（見(jiàn)圖2A），顯著下調(diào)表達(dá)基因富集的信號(hào)通路主要是氧化磷酸化、脂肪酸降解、脂肪酸代謝、碳代謝等合成代謝信號(hào)通路（見(jiàn)圖2B）。

圖2 APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因富集信號(hào)通路

3 討論

該研究采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中DEGs 和富集信號(hào)通路進(jìn)行了比較分析，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中得到7 270 個(gè)DEGs。 有研究證實(shí)，在APAP 急性肝損傷肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中CCL2、CCR2、CCL5、Cx3cr1 等 基 因 上 調(diào) 表 達(dá)，Cyp2c29、LRH1、HNF4α、PPARα 和RXRα 等基因下調(diào)表達(dá)［7-8］。 該研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，CCL2、CCR2、CCL5、Cx3cr1 基因在APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分別上調(diào)16 倍、16 倍、2.27 倍 和31 倍， 而Cyp2c29、LRH1、HNF4α 和RXRα 基因表達(dá)量分別下調(diào)4.56 倍、1.5 倍、1.76倍和1.4 倍，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致［9-12］。另外， 在該研究中也得到了在APAP 急性肝損傷組織轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)的基因， 如血小板因子4（PF4）、S100a6、Gsta1、Cotl1 等，這些基因在急性肝損傷組織轉(zhuǎn)錄組中的作用有待進(jìn)一步探討。

該研究通過(guò)KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組共有2 515 個(gè)DEGs 在316 個(gè)不同的KEGG 通路中富集。 Wang 等［13］的研究中，對(duì)APAP 肝損傷模型小鼠在損傷6 h 時(shí)的組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的結(jié)果顯示，炎癥相關(guān)通路（包括NF-κB、MAPK、TNF、IL-17 信號(hào)通路）顯著上調(diào)。 而該研究中APAP 急性肝損傷小鼠在損傷后第2 天的肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中NF-κB、MAPK、TNF、IL-17 信號(hào)通路也出現(xiàn)顯著上調(diào)的結(jié)果。 在APAP 急性肝損傷小鼠損傷后第2 天肝臟組織轉(zhuǎn)錄組中的上調(diào)表達(dá)基因主要富集在趨化因子信號(hào)通路和ECM 受體交互作用信號(hào)通路，且在趨化因子信號(hào)通路和ECM 受體交互作用信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因Col1a2、Col1a1 等膠原蛋白基因的表達(dá)量均上調(diào)10 倍以上；Ccr2、Dock2、Cx3cr1 和Adcy7 等 基 因 分 別 上 調(diào)16、4、32、4 倍，因此，在小鼠APAP 急性肝損傷的急性損傷期中，與炎癥相關(guān)的趨化因子信號(hào)通路和ECM受體交互作用信號(hào)通路可能發(fā)揮重要作用， 但其相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

該研究通過(guò)對(duì)APAP 急性肝損傷小鼠肝臟組織和正常小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷過(guò)程中主要涉及免疫、 炎癥相關(guān)信號(hào)通路和合成代謝信號(hào)通路， 趨化因子信號(hào)通路和ECM 受體交互作用信號(hào)通路可能是參與APAP 急性肝損傷過(guò)程中急性損傷期中發(fā)揮主要作用的信號(hào)通路。