尹詩恒，張紹勇，劉骕骦，吳酬飛2,，王俊偉，李 陽2,，張立欽2,

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 湖州師范學(xué)院 浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點實驗室，浙江 湖州 313000；3. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000；4. 煙臺市昆崳山林場，山東 煙臺 264100）

馬尾松Pinus massoniana為松科Pinaceae松屬Pinus的常綠大喬木，最高達45 m，樹皮呈紅褐色，多見于中國南方[1?2]。馬尾松是中國松屬中占比最大的一類樹種，因其速生和耐貧瘠的特點成為經(jīng)濟效益較大的用材樹種之一[3]。松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus病又稱松樹萎蔫病，其擴散途徑主要為人類行為傳播和松墨天牛Monochamus alternatus攜帶傳播2種[4]，且擴散速度快，危害程度極高，對林業(yè)經(jīng)濟和森林資源造成了極大損失[5]。因馬尾松侵染初期并不表現(xiàn)任何特征，一旦發(fā)病則植物開始枯萎且無法救治，最終死亡，所以松材線蟲病也被稱為“森林癌癥”[6]。松材線蟲病的早期研究主要集中于致病機制[7]；后隨科技和經(jīng)濟發(fā)展，化學(xué)和物理防治研究逐步取得進展[8]；近年來，由于環(huán)境問題日益突出，生防研究逐漸受到重視，尤其對植物體內(nèi)生防細菌的研究與應(yīng)用。談家金等[9]通過水培離體松枝得到1株堅強芽孢桿菌Bacillus firmus GD2，可影響松材線蟲病的侵染，首次證明莖部內(nèi)生細菌與松材線蟲病之間有密切聯(lián)系。袁文婷[10]從馬尾松與黑松Pinus thunbergii莖部分離到9株內(nèi)生細菌，其中3株對部分病原菌有一定拮抗作用。CARRELL等[11]、IZUMI等[12]在柔松Pinus flexilis、歐洲赤松Pinus densiflora的根部與根際發(fā)現(xiàn)了大量不同種類的內(nèi)生細菌。胡振亮等[13]從健康油松Pinus tabuliformis根部、木質(zhì)部、韌皮部及松針等7個部位分離到40株內(nèi)生細菌，其中1株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis可對松樹枯梢病Sphaeropsis sapinea起到抑制作用。李陽[14]對健康馬尾松接種清水處理與空白對照，證實了接種產(chǎn)生的機械損傷與野外條件變化對菌群結(jié)構(gòu)并無影響。綜上可知，自2000年以來，對松科植物內(nèi)生細菌相關(guān)的研究已取得一定進展，但對馬尾松不同部位內(nèi)生細菌的研究并不多，尤其缺乏高通量測序技術(shù)對松材線蟲病侵染后馬尾松內(nèi)生細菌菌群的研究?；诖?，本研究利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)與高通量測序技術(shù)，探究野外接種松材線蟲后馬尾松不同部位內(nèi)生細菌菌群的結(jié)構(gòu)變化，為松材線蟲病的早期診斷和后期生防菌株的挖掘提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從杭州四季春馬尾松苗圃(30°21′42″N，119°34′51″E)采集30株3年生健康馬尾松幼苗種植于湖州師范學(xué)院試驗田中，緩苗15 d后采用套管接蟲法接種24株馬尾松苗，每株接種松材線蟲1萬條。接種當(dāng)天取其中6株未接種苗作為空白對照，之后每隔15 d取6株接種苗作為試驗樣本，共取樣5次，時間為60 d，其間取侵染15 d的松干樣本進行鏡檢，確定松材線蟲已接種成功。其中3株馬尾松幼苗的松干、松針和根系樣本分開裝入自封袋，按順序編號并保存至?20 ℃冰箱，用于DGGE分析；另外3株試驗樣本分裝后按相同順序編號保存至?80 ℃冰箱中用于高通量測序。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲的培養(yǎng)與接種 松材線蟲與灰葡萄孢Botrytis cinerea均取自浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，將松材線蟲接種于布滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 d，挑選其中密封完好且取食干凈的培養(yǎng)基，采用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲[15]。將分離得到的松材線蟲液以3 500 r·min?1轉(zhuǎn)速下離心3 min，離心后松材線蟲沉積于離心管底部，棄上部液體并將剩余液體混勻，最后加入無菌水與松材線蟲，按比例配制成10 000條·mL?1的線蟲懸液，用于試驗田馬尾松苗接種。

1.2.2 DGGE技術(shù) 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增：采用磁珠法細菌基因組DNA抽提試劑盒分別提取松干、松針與根系總細菌的DNA后，選用BIO-RAD的T100TM Thermal Cycler PCR儀對細菌DNA的16S V3區(qū)序列進行擴增，擴增選擇帶有 GC 夾的細菌特異性引物 GC-341(cgc ccg ccg cgc gcg gcg ggc ggg gcg ggg gcg cgg ggg gcc tac ggg agg cag cag)與 518R(att acc gcg gct gg)進行，其產(chǎn)物經(jīng)體積分數(shù)為 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后存至?20 ℃冰箱備用。

DGGE凝膠電泳：首先，分別吸取9.6 mL體積分數(shù)100%與6.4 mL體積分數(shù)0的變性膠、6.4 mL體積分數(shù)100%與9.6 mL體積分數(shù)0的變性膠于2個錐形瓶中，再次吸取80 μL的過硫酸銨(AP)與16 μL的四甲基乙二胺(Temed)均加至上述2個錐形瓶中，配制成體積分數(shù)為60%與40%的梯度膠，分別倒入梯度膠電動生成器進行灌膠，梯度膠凝固后吸取10 μL PCR擴增產(chǎn)物與5 μL loading buffer混合后進行點樣。其次，將點樣完成的凝膠放入已預(yù)熱至60 ℃的電泳儀中，80 V電泳13 h。最后待電泳完畢向凝膠倒入0.5 μL染色劑避光染色，用BIO-RAD凝膠橙色系統(tǒng)獲取DGGE電泳條帶圖。將DGGE電泳條帶圖導(dǎo)入Quantity One軟件中進行DGGE圖譜分析，并利用PAST生物統(tǒng)計軟件與WPS軟件處理數(shù)據(jù)圖表，分析不同部位受松材線蟲侵染后內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)的差異。

1.2.3 高通量測序技術(shù) 委托諾禾致源生物科技有限公司對樣本細菌的DNA進行測序，測序平臺為Illumina NovaSeq。首先，采用CTAB法對樣本的細菌DNA進行提取，選擇帶有Barcode的特異引物515F與806R對樣本16S V4區(qū)進行擴增，使用體積分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后對目的條帶進行回收。其次，使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，經(jīng)Qubit和Q-PCR定量后使用NovaSeq6000進行上機測序得到數(shù)據(jù)。最后，使用FLASH對下機數(shù)據(jù)進行拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列后，在97%的相似性水平上，使用Uparse軟件進行操作分類單元(OTU)聚類，通過Qiime軟件和R軟件對樣本進行群落多樣性分析，同時對比DGGE數(shù)據(jù)，定性定量對內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)的差異變化進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松不同部位內(nèi)生細菌菌群的DGGE分析

2.1.1 不同部位內(nèi)生細菌菌群的DGGE電泳條帶分析 如圖1所示：松針部位空白對照組(即侵染0 d)和侵染15 d的樣品條帶數(shù)量和亮度基本不變，侵染30 d后條帶數(shù)量增多且亮度加深，侵染45 d后條帶的亮度和數(shù)量進一步增加，但侵染60 d后，條帶的數(shù)量減少且亮度減弱。松干部位不同侵染期樣品的條帶數(shù)量和亮度差異最大，侵染15 d后樣品條帶即開始變化，侵染30 d后其數(shù)量與亮度明顯增加且到達高峰；至侵染后期，條帶整體變化不明顯，但條帶數(shù)量有一定的減少，且部分條帶明顯增亮或減弱。相比松干與松針，根系的變化非常小，不同侵染期條帶的數(shù)目與亮度均無明顯變化，整體相對穩(wěn)定。

圖1 不同時期馬尾松內(nèi)生細菌菌群變化的DGGE分析圖Figure 1 DGGE analysis chart of changes in the endophytic bacterial flora of P. massoniana in different periods

2.1.2 不同部位內(nèi)生細菌菌群的差異顯著性分析 如圖2所示：松干部位侵染0與60 d樣本數(shù)據(jù)的離散程度最小，中位數(shù)約20；侵染30 d數(shù)據(jù)最大值可達80，數(shù)據(jù)離散程度極大，中位數(shù)約60；侵染15與45 d的樣本數(shù)據(jù)離散程度中等，中位數(shù)約30，其中P=0.000 8，小于0.05。松針部位各組數(shù)據(jù)的離散程度相近，除侵染0與45 d樣本的中位數(shù)接近70，剩余3組數(shù)據(jù)中位數(shù)約20，其P=0.089 8，大于0.05。根系部位數(shù)據(jù)的離散程度最小，除空白對照外，不同侵染期樣本中位數(shù)均接近60，且P=0.714 4，大于0.05。

圖2 不同時期馬尾松內(nèi)生細菌菌群的差異箱式圖Figure 2 Box diagram of differences in endophytic bacterial flora of P. massoniana in different infection stages

綜上可知：根系部位物種多樣性整體離散程度最小，差異不顯著(P＞0.05)；松干部位整體離散程度最大，且各組數(shù)據(jù)間的離散程度差異也較大，差異顯著(P＜0.05)；松針部位整體離散度介于松干與根系之間，但各組數(shù)據(jù)間的離散程度基本一致，差異顯著(P＜0.05)。

2.1.3 不同部位內(nèi)生細菌菌群的多樣性指數(shù)分析 利用PAST軟件對條帶數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到不同侵染時期馬尾松內(nèi)生細菌菌群的多樣性指數(shù)，即香農(nóng)威納指數(shù)(Shannon-Wiener)、均勻度指數(shù)(Pielou)以及豐富度指數(shù)(Margalef)。如表1所示：隨侵染時間延長，松干的Shannon-Wiener指數(shù)由1.93上升到3.12，Margalef指數(shù)由1.01到3.27；松針的Shannon-Wiener指數(shù)從2.06到2.73，Margalef指數(shù)由1.02到1.85，與松干部位變化趨勢一致；根系部位的多樣性數(shù)值遠大于松針與松干部位，但數(shù)值間的差值極小。由此可知，隨侵染時間延長，松干和松針部位內(nèi)生細菌菌群的多樣性都呈先增加后減少的變化趨勢；根系部位的菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化極小，但多樣性最豐富。

表1 不同時期馬尾松內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of diversity index of the endophytic bacterial community structure of P. massoniana in different periods

2.2 馬尾松不同部位內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)的高通量測序分析

2.2.1 不同部位內(nèi)生細菌菌群的 OUTs聚類分析

由OTUs維恩圖(圖3)可知：根系部位菌群的OTU數(shù)最多，為4 523，且隨侵染時間延長，OTU數(shù)無明顯變化趨勢；松針與松干菌群的OTU總數(shù)分別為3 833和3 823，且隨侵染時間延長表現(xiàn)為持續(xù)增長的變化趨勢，其中侵染15 d的松干部位特有OTU數(shù)由48突增至154，變化最大。這與DGGE圖譜分析結(jié)果相同，即松干與松針條帶數(shù)目在空白對照組極少，且隨侵染時間延長逐漸增多；菌群多樣性變化與條帶數(shù)目相同，即松干被侵染15 d菌群結(jié)構(gòu)多樣性明顯增多，而松針部位菌群則隨侵染時間變化逐漸增多?？梢?，在長期侵染過程中，松材線蟲的侵染確實對不同部位細菌菌群結(jié)構(gòu)的變化有較大影響，其中松干部位對松材線蟲病的侵染敏感性最強，響應(yīng)速度最快；松針次之，根系則基本不受侵染影響。

圖3 不同部位內(nèi)生細菌的 OTUs維恩圖Figure 3 Venn diagram of OUTs of endophytic bacteria in different parts

2.2.2 不同部位內(nèi)生細菌菌群的物種組成分析 綜上可知，DGGE與高通量測序結(jié)果一致，DGGE分析能夠直觀地比較和分析馬尾松不同部位細菌群的結(jié)構(gòu)差異，可對菌群進行定性分析，但無法直接檢測到菌群的種類，仍需配合其他實驗方法如T克隆。高通量測序技術(shù)則憑借其大量、速度、準確的特點可直接檢測到較全面的馬尾松菌群信息。本研究檢測到馬尾松體內(nèi)細菌共442屬，隸屬于35門49綱110目210科。

由圖4可知：在門水平上，相對豐度排名前10的細菌分別為藍藻細菌門Cyanobacteria、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉菌門Planctomycetes、綠彎菌門Chloroflexi、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、疣微菌門Verrucomicrobia及裝甲菌門Armatimonadetes，其中分布最廣、種類最多的是放線菌門與變形菌門。

圖4 門水平上排名前 10的物種相對豐度Figure 4 Relative abundance of the top 10 species at the phylum level

由圖5可知：在屬水平上，松干部位侵染0與15 d菌群的種類相差非常大，如Bryobacter屬、Pseudolabrys屬、類諾卡氏屬Nocardioides、分枝桿菌屬Mycobacterium與弗萊德門菌屬Friedmanniella，在侵染0 d時，上述菌群幾乎沒有，侵染15 d后才出現(xiàn)；侵染15～60 d相對豐度整體變化減弱，但部分菌種如甲基桿菌屬Methylobacterium、假平胞菌屬Sphingomonas與薄層菌屬Hymenobacter在侵染后期相對豐度有所增加。與松干相比，松針部位內(nèi)生細菌菌群種類變化并不明顯，但菌群豐度變化較明顯，如泛菌屬Pantoea與假平胞菌屬隨侵染時間延長其相對豐度整體呈先增加后減少的趨勢，甲基桿菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas、短小桿菌屬Curtobacterium則表現(xiàn)為持續(xù)減少的趨勢。其余菌屬如藍藻菌屬Cyanobacteria、伯克氏菌屬Burkholderia、放線菌屬Amnibacterium、變形桿菌屬Gammaproteobacteria、羅思河小桿菌屬Rhodanobacter、拜葉林克氏菌屬Beijerinckiaceae、酸桿菌屬Acidobacteria、嗜麥芽窄食單胞菌屬Stenotrophomonas、溶桿菌屬Lysobacter、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium和節(jié)桿菌屬Arthrobacter則并無明顯豐度變化。根部內(nèi)生細菌菌群的種類與相對豐度則始終維持在一定水平。

圖5 屬水平上排名前 30的物種相對豐度Figure 5 Relative abundance of the top 30 species at the genus level

3 結(jié)論與討論

微生物的復(fù)雜培養(yǎng)條件使大部分微生物包括植物內(nèi)生細菌較難使用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法進行研究[16]。雖然松材線蟲病的生防研究已取得一定進展，如芽孢桿菌屬Bacillus、短小桿菌屬與區(qū)文氏菌屬Erwinia的生防菌株對松材線蟲病的侵染可起到一定作用，尤其是芽孢桿菌屬，但其野外生防效果普遍弱于室內(nèi)實驗效果[17?18]。本研究通過DGGE技術(shù)對不同部位的內(nèi)生細菌分析發(fā)現(xiàn)：松材線蟲的侵入明顯改變了馬尾松內(nèi)生細菌結(jié)構(gòu)，隨侵染時間推移菌群多樣性整體表現(xiàn)為先增加后穩(wěn)定的變化趨勢，但不同部位內(nèi)生細菌群的變化規(guī)律并不一致。松干部位內(nèi)生細菌群在侵染15 d時產(chǎn)生較大變化，至45 d時菌群差異達到顯著，到侵染60 d時菌群結(jié)構(gòu)與侵染45 d基本一致；而松針部位在侵染30 d才開始表現(xiàn)明顯的菌群變化，且多樣性指數(shù)增長趨勢較平緩；根系部位內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)在侵染全過程未表現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化，但內(nèi)生細菌的數(shù)量遠大于干部與針部。由此可知，內(nèi)生細菌菌群的物種數(shù)量與豐度從大到小依次為根系、松干、松針；內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)差異從大到小依次為松干、松針、根系。說明受侵染后松干部位對松材線蟲病的侵染敏感性最強，其次是松針，根系則基本不受松材線蟲病侵染的影響。

通過高通量測序技術(shù)對馬尾松不同部位內(nèi)生細菌定量分析發(fā)現(xiàn)：共檢測到細菌442屬，分布于35門49綱110目210科。由OTUs維恩圖分析可知：不同部位內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)的變化趨勢與上述結(jié)果一致，即松干部位內(nèi)生細菌對松材線蟲病的侵染響應(yīng)最迅速，部分內(nèi)生細菌的結(jié)構(gòu)在侵染15 d時已發(fā)生顯著變化。因此，在松材線蟲傳播的高峰期實時監(jiān)測馬尾松的菌群變化對松材線蟲病的早期檢測有一定的幫助。此外，松干與松針部位的部分內(nèi)生細菌相對豐度也產(chǎn)生了顯著變化，松干部甲基桿菌屬、假平胞菌屬與薄層菌屬隨侵染時間的增加其相對豐度顯著增多；而松針部的甲基桿菌屬、假單胞菌屬與短小桿菌屬相對豐度隨侵染時間的延長逐漸減少，泛菌屬與假平胞菌屬則隨侵染時間延長其相對豐度呈先增加后減少的變化趨勢；根部內(nèi)生細菌菌群的種類與相對豐度則整體保持穩(wěn)定。

接種植物內(nèi)生菌可刺激植物產(chǎn)生抗性酶，并促進植物體內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)的表達，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)防御反應(yīng)[19]。目前，甲基桿菌屬、假平胞菌屬、薄層菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬和短小桿菌屬的部分菌株已從廣泛的生境中分離得到，且已被發(fā)現(xiàn)對植物具有一定的促生或生防作用。KHAN等[20]研究發(fā)現(xiàn)：假平胞菌屬中的LK11菌株可通過產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)促進植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)，刺激植物對環(huán)境脅迫與病原體產(chǎn)生反應(yīng)，使植物啟動防御機制，提高植物抗性；甲基桿菌屬、泛菌屬也可促進植物分泌細胞分裂素(CK)、吲哚乙酸等植物激素以促進植物生長發(fā)育，并幫助植物抵擋生物和非生物因素的侵害[21?22]；薄層菌屬與假單胞菌屬也具有解磷酸鈣、產(chǎn)鐵載體等的生物特性，鐵作為植物存活和繁殖的必需微量營養(yǎng)素，當(dāng)達到一定含量即可促進植物生長，從而提高植物的抗性[22?24]。雖然上述細菌屬在馬尾松病害防治研究中報道較少，但已證實對其他植物的生長發(fā)育有一定的促進或阻礙作用，尤其是假單胞菌屬與泛菌屬的部分菌株對松材線蟲病具有生防效果[25]。綜上，推測上述細菌屬中的部分菌株可對松材線蟲病產(chǎn)生生防作用，為后期發(fā)掘新型生防菌株提供研究方向。