王楠楠，董 彬，楊麗媛，趙宏波

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3. 浙江農(nóng)林大學(xué) 南方園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

梅花Prunus mume是中國十大傳統(tǒng)名花，在中國有3 000多年栽培歷史，江南地區(qū)花期為2月左右[1]。梅花適應(yīng)性較強(qiáng)，耐高溫、較耐低溫和干旱。在年均氣溫為16～23 ℃的地區(qū)生長最好，根系不耐?8 ℃以下的低溫[2?3]。梅花適栽范圍介于自然分布區(qū)和歷史分布區(qū)之間，北界為西藏經(jīng)四川至甘肅天水，陜西寶雞、西安，河南洛陽，最后到山東煙臺，通過海岸線與自然分布區(qū)相接，以長江流域?yàn)榧匈p梅地帶[2, 4]。在華北、東北和西北等北方地區(qū)不能露地越冬，在江南地區(qū)，春季的極端低溫(低于?3 ℃)則會對花(蕾)造成傷害，極大地影響觀賞價(jià)值。因此，抗寒育種一直是梅花育種的重要方向[4?6]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類主要存在于植物中的鋅指型轉(zhuǎn)錄因子，在植物響應(yīng)生物脅迫與非生物脅迫的過程中起著重要作用。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特征，WRKY家族可分為3類：I類包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和 1個(gè) CX4?5CX22?23HXH (C2H2)型鋅指結(jié)構(gòu)；Ⅱ類包含 1個(gè) WRKY 結(jié)構(gòu)域和 1個(gè) CX4?5CX22?23HXH(C2H2)型鋅指結(jié)構(gòu)；Ⅲ類包含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CX7CX23HXC (C2HC)型鋅指結(jié)構(gòu)[7]。WRKY家族參與了廣泛的生物過程，包括種子萌發(fā)、植物發(fā)育和植物激素信號傳遞等[8]。研究表明：WRKYs最重要的功能之一是參與防御非生物脅迫[9]，可顯著提高小麥Triticicum aestivum[10]、水稻Oryza sativa[11]等的耐寒性和香蕉Musa acuminate[12]、棉花Gossypium hirsutum[13]等的抗旱性。近年來，隨著梅花基因組正式公布[14]，關(guān)于梅花抗寒和抗旱基因的挖掘和研究逐漸展開，這為深入研究梅花抗寒、抗旱等機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)。梅花中共鑒定出58個(gè)WRKY成員，PmWRKYs在梅花的不同組織(根、莖、葉、花和果實(shí))中有不同程度的表達(dá)，其中17個(gè)PmWRKYs可能是調(diào)控梅花抗寒性的潛在轉(zhuǎn)錄因子[15]。本研究以梅花品種‘骨紅朱砂’‘Guhong Zhusha’為材料，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)克隆獲得了2個(gè)PmWRKY2轉(zhuǎn)錄因子，通過生物信息學(xué)分析和同源基因序列比對，檢測PmWRKY2基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式，以期為后續(xù)開展WRKY轉(zhuǎn)錄因子在梅花抗寒和抗旱方面的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

梅花‘骨紅朱砂’來自浙江農(nóng)林大學(xué)梅花種質(zhì)資源圃。采集生長勢一致，無病蟲害的1年生枝條，插于加入清水的培養(yǎng)瓶中，參照PENG等方法[16]處理，濕度為50%，光周期為16 h/8 h。低溫(2 ℃)處理組取樣時(shí)間為 0(ck)、1、2、4、6、12、24、48、72 h。采用 200 mmol·L?1的甘露醇溶液模擬干旱處理，取樣時(shí)間為 0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。采用 100 μmol·L?1脫落酸 (ABA)處理，取樣時(shí)間為0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。所有新鮮樣品采集后立即用液氮速凍，保存于?80 ℃，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取及 cDNA 合成 RNA 的提取采用購自天津諾禾致源公司的 UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit，方法參照試劑盒的提取說明書。cDNA 的合成根據(jù) TAKARA PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)說明書在冰上進(jìn)行。

1.2.2 基因的克隆 通過梅花基因組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲得PmWRKY2-1和PmWRKY2-2序列，利用 Prime 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以‘骨紅朱砂’葉片cDNA為模板，利用r-TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性 30 s，54 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收試劑盒回收后連接到pMD18-T載體(Takara公司，大連)中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑取陽性克隆，經(jīng)PCR驗(yàn)證后送往杭州有康科技有限公司測序。

表1 基因克隆及表達(dá)所用引物序列Table 1 Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR

1.2.3 序列的生物信息學(xué)分析 采用在線軟件 BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行基因序列比對分析，用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線分析開放閱讀框，運(yùn)用ProtParam 在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的分子量、理論等電點(diǎn)；利用SOPMA 在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析PmWRKY2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成；利用WOLFPSORT在線軟件(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)預(yù)測基因的亞細(xì)胞定位；利用DNAMAN 9.0軟件對梅花PmWRKY2蛋白質(zhì)與其他物種WRKY蛋白質(zhì)進(jìn)行比對分析；使用ClutsalX-v1.83程序進(jìn)行多序列比對，然后將比對結(jié)果輸入到MEGA 6.0軟件中，利用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值取1 000次。

1.2.4 基因表達(dá)分析 以不同處理的葉片為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用Prime 5.0設(shè)計(jì)PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的特異性引物，以梅花PmEF1α為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為SYBR Premix ExTaq酶 (Takara，大連)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物 (10 μm·L?1)各 0.8 μL，雙蒸水 6.4 μL，每個(gè)樣品設(shè)置 3次重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒ǎ?5 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 復(fù)性30 s，共 40個(gè)循環(huán)；然后以 95 ℃ 持續(xù) 5 s，60 ℃ 持續(xù) 1 min，95 ℃ 持續(xù) 15 s作為溶解曲線分析程序，最后根據(jù) 2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、測序后獲得編碼序列(CDS)。測序結(jié)果顯示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的 CDS 長度分別為 2 223和 2 220 bp(圖1)，編碼的氨基酸數(shù)目分別為740和739個(gè)，蛋白質(zhì)分子量分別為79.94和80.98 kD，理論等電點(diǎn)分別為5.65和5.82。不穩(wěn)定系數(shù)分別為53.93和53.82，脂肪指數(shù)分別為54.18和59.53，預(yù)測它們?yōu)椴环€(wěn)定蛋白質(zhì)?？偲骄H水系數(shù)(GRAVY)分別為?0.774和?0.743，屬于親水性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均位于細(xì)胞核。

圖1 2個(gè) PmWRKY2基因的擴(kuò)增Figure 1 PCR amplification of 2 PmWRKY2 genes in P. mume

氨基酸序列比對結(jié)果顯示(圖2)：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的同源性僅為45.87%，與擬南芥Arabidopsis thaliana的AtWRKY2相似性分別為51.26%和32.07%；其中PmWRKY2-1與歐洲甜櫻桃P. avium(XP_021826759.1)、桃P. persica(XP_007206427.1)的WRKY2同源性分別為98.65%，98.78%；PmWRKY2-2與甜李P. dulcis(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY2同源性分別為98.51%，98.11%，與月季Rosa chinensis(XP_024188041.1)WRKY2同源性為77.97%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列與其他植物氨基酸序列一樣，均包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè) CX4?5CX22?23HXH(C2H2)型 鋅 指 結(jié) 構(gòu) ， 屬 于Group Ⅰ (圖 3)。

圖2 梅花與其他物種 WRKY 氨基酸序列的比對Figure 2 Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species

圖3 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2的 WRKY 結(jié)構(gòu)域Figure 3 WRKY domain displays of PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2

2.2 梅花 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(圖4)：PmWRKY2-1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中包含75.68%的無規(guī)則卷曲、10.81%的α螺旋、10.41%的擴(kuò)展長鏈和3.11%的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；PmWRKY2-2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中包含74.02%的無規(guī)則卷曲、13.80%的α螺旋、8.80%的擴(kuò)展長鏈和3.38%的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

圖4 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)Figure 4 Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示：梅花PmWRKY2-1與PmWRKY2-2的相似性較低，但與一些薔薇科Rosaceae植物的親緣關(guān)系都較近；其中PmWRKY2-1與桃(XP_007206427.1)、歐洲甜櫻桃(XP_021826759.1)的WRKY親緣關(guān)系較近，PmWRKY2-2與甜李(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY氨基酸聚為一類，與麻瘋樹Jatropha curcas (XP_021629940.1)、酸棗Ziziphus jujube(XP_015875770.1)、蔓花生Arachis duranensis(XP_015962000.1)等 SUSIBA2-Like(sugar signaling in barley)基因的氨基酸序列也有一定的相似性。

圖5 梅花與其他物種WRKY氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species

2.4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2在非生物脅迫和脫落酸處理下的表達(dá)

低溫和干旱(甘露醇)處理后，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2表達(dá)均發(fā)生顯著變化(圖6)。在低溫處理下，PmWRKY2-1在2 和12 h時(shí)表達(dá)量最高，分別是對照的5.0和4.4倍，之后呈現(xiàn)下降的趨勢；PmWRKY2-2的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在6 h時(shí)達(dá)到最大值，是對照的2.4倍。在干旱處理下，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表達(dá)模式均為先上升后下降的趨勢，PmWRKY2-1的表達(dá)量在12 h達(dá)到最大且為對照的53.9倍，之后便呈現(xiàn)下降的趨勢；PmWRKY2-2的表達(dá)量在6 h處達(dá)到最大，為對照的9.7倍，之后呈現(xiàn)下降趨勢。在脫落酸(ABA)處理下，處理48 h前，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均顯著下調(diào)(P＜0.05)，說明其表達(dá)可被ABA抑制。

圖6 非生物和 ABA 處理下的 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2的表達(dá)Figure 6 Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA

3 討論

植物在生長發(fā)育的過程中會受到多種因素的影響，而低溫與干旱是常見的影響植物生長發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)以及地理分布的非生物脅迫因素，嚴(yán)重時(shí)可能會導(dǎo)致植物死亡。植物在長期適應(yīng)進(jìn)化的過程中逐漸形成了復(fù)雜而高效的應(yīng)答機(jī)制，從分子、生理、細(xì)胞和生化等多方面做出適應(yīng)性調(diào)整，以抵御和適應(yīng)低溫、干旱等脅迫。在植物響應(yīng)低溫、干旱脅迫過程中，普遍存在于植物中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要作用[17]，目前已在擬南芥[7]、番茄 Solanum lycopersicum[18]、玉米 Zea mays[19]、蘋果 Malus domestica[20]、水稻[21]等大多數(shù)物種中均有報(bào)道。

本研究克隆獲得的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因都含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，C端都為C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)；但2個(gè)蛋白質(zhì)序列的差異較大，相似性僅為45.87%；與一些薔薇科植物的親緣關(guān)系較近；PmWRKY2-1與擬南芥 AtWRKY2的相似性為51.26%，PmWRKY2-2為 32.07%。值得一提的是，PmWRKY2-2與麻風(fēng)樹(XP_021629940.1)、酸棗(XP_015875770.1)、蔓花生 (XP_015962000.1)等植物的SUSIBA2-Like氨基酸序列具有一定的相似性，有研究[22]報(bào)道SUSIBA2屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子超家族并參與碳水化合物合成代謝。

羅昌國等[23]發(fā)現(xiàn)：低溫處理下湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY40b基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；低溫處理下黃瓜Cucumis sativus CsWRKY46[24]和水稻OsWRKY76[11]也呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢，與本研究中梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)趨勢一致。干旱處理下PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表達(dá)量先顯著上升后下降，最高表達(dá)量分別上調(diào)了約50倍和10倍。ZHU等[25]發(fā)現(xiàn)：擬南芥中過表達(dá)甘薯Ipomoea batatas IbWRKY2和苦蕎[26]Fagopyrum tataricum FtWRKY10能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性；ZHANG等[27]發(fā)現(xiàn)：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)處理白車軸草Trifolium repens，其WRKY2作為干旱響應(yīng)基因可以提高白車軸草的耐旱性。JIANG等[28]發(fā)現(xiàn)：ABI5、ABI3、ABA2和ABA3等ABA途徑基因誘導(dǎo)擬南芥2個(gè)WRKY2的表達(dá)從而介導(dǎo)種子萌發(fā)和萌發(fā)后的發(fā)育停滯。本研究中，ABA處理下，梅花2個(gè)PmWRKY2基因的表達(dá)都被抑制，預(yù)測啟動子序列中的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2分別含有1個(gè)和7個(gè)ABA響應(yīng)元件ABRE，推測這2個(gè)基因可能通過ABA調(diào)控低溫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控梅花的耐寒性，但這些推論還需進(jìn)一步驗(yàn)證。