潘麗娟 王 冕 蘇茂文 陳明娜 王 通 許 靜 楊 珍孫 偉鄒宗峰禹山林陳 娜*遲曉元*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100；2.青島海關(guān),山東 青島 266001；3.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 臨沂 276012；4.煙臺市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,山東 煙臺 264001)

LEC1(LEAFYCOTYLEDON1) 是編碼CCAAT-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HAP3(Heme-activated protein 3)亞單位的基因,在植物種子胚發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,而且是種子成熟、儲藏物質(zhì)積累的重要調(diào)控因子[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),LEC1在擬南芥葉片中異位表達能誘導(dǎo)胚特異基因在葉中的表達[3]。擬南芥lec1突變體出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常且不耐干燥[4]、部分種子成熟特異基因的表達受到抑制和種子貯藏蛋白的表達量降低等現(xiàn)象[5-6]。同時,LEC1影響植物脂肪酸生物合成基因的表達,對脂肪酸生物合成進行調(diào)控[7]。研究表明,在擬南芥中過表達擬南芥或甘藍型油菜LEC1 基因,可促進脂肪酸代謝途徑上多個基因表達量的增加,從而提高植物組織中脂肪酸的含量[8]。Elahi等研究發(fā)現(xiàn),在油菜中過量表達LEC1 基因,使得種子油脂含量增加7%～16%,LEC1能促進在種子發(fā)育過程中與脂肪酸合成相關(guān)基因的表達[9]。在玉米中過量表達ZmLEC1基因時,提高了其種子的油脂含量[10]。這些試驗結(jié)果表明LEC1是植物脂肪酸合成過程中的正調(diào)控因子。因此,對LEC1 基因的發(fā)掘,為油料作物種子品質(zhì)改良研究提供了新的思路。

本研究前期從花生中分離克隆了2個AhLEC1基因(AhLEC1A,GenBank登錄號KP 090434；AhLEC1B,GenBank登錄號KP090435),在此基礎(chǔ)上進行原核表達分析,并初步分析了AhLEC1基因在花生生長發(fā)育過程中的表達以及對非生物脅迫的應(yīng)答情況,為深入研究AhLEC1基因在花生中的生物學(xué)功能提供參考信息,也為利用基因工程手段改良花生品質(zhì)提供新的候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

組織表達分析選用不同含油量的花生品種花育17號(粗脂肪含量44.6%)、白沙1016(粗脂肪含量56.0%)和徐花9號(粗脂肪含量60.9%)。參照潘麗娟等[11]的方法進行花生組織取樣,略有修改?；ㄉ⒒ㄆ诓杉?花生開花下針后采集果針和花后15、25、35、45、55、65和75 d的莢果以及花后35、45、55、65和75 d的種子,樣品經(jīng)液氮速凍后立即放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

非生物脅迫表達分析所用花生材料為花育33號,參照潘麗娟等[12]的方法進行品種前處理。花生生長至三葉期后進行非生物脅迫處理試驗。低溫處理是將生長于土中的花生幼苗置于光照培養(yǎng)箱中,溫度設(shè)定為4℃。用NaCl和PEG6000進行處理時,將花生幼苗從土中小心拔出,用清水沖洗根部后直接浸泡于200 mmol/L NaCl或20%PEG6000溶液中。所有處理均在處理的0、4、8、12、24和72 h分別取葉片,液氮冷凍保存,作為后續(xù)試驗材料。

1.2 試驗試劑

總RNA 提取試劑盒和E.coliBL21感受態(tài)購自天根生化科技有限公司,M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega,載體p ET-28b購自Novagen,T4 DNA 連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司,凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司,Super GelRed購自US Everbright Inc,熒光定量PCR 用SYBR Green PreMix試劑盒購自MDBio臺灣生工。

1.3 原核表達分析

根據(jù)AhLEC1基因的CDS序列和原核表達載體pET-28b,設(shè)計特異性引物,5'端引物加了EcoRI酶切位點:5'-GAATTCATGGAAACTGGAGGAGGCTTT-3',3'端引物加了XhoI酶切位點:5'-CTCGAGTCATTTGTATTGAGTATTTGG-3'。進行基因擴增,分別構(gòu)建p ET-28b-AhLEC1A和p ET-28b-AhLEC1B原核表達載體。將p ET-28b-AhLEC1A和p ET-28b-AhLEC1B原核表達載體分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細胞中,進行蛋白誘導(dǎo)及SDS-PAGE 分析。具體流程參照潘麗娟等[12]的方法進行。含重組質(zhì)粒的菌液培養(yǎng)至OD600約為0.6 時,加入0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達。分別于誘導(dǎo)后0、2、6、10、16 h收集菌液進行SDS-PAGE電泳,分析蛋白表達結(jié)果。

1.4 qRT-PCR 分析

qRT-PCR反應(yīng)的方法和條件參照陳娜等[13-14],內(nèi)參基因為Actin11,每樣品重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt法[15]分析數(shù)據(jù)。qRT-PCR分析所用引物如下:Actin11引物為5'-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3'和5'-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3'；AhLEC1引物為5'-CTTTCCTACCACTACCTCTG-3'和5'-ATCTTGCTCCCTCACAGTG-3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ah LEC 1蛋白的原核表達

將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒p ET-28b-AhLEC1A和p ET-28b-AhLEC1B分別轉(zhuǎn)化至表達菌株BL21 中,用0.5 mmol/L 的IPTG 誘 導(dǎo) 表達,于誘導(dǎo)后0、2、6、10、16 h分別收集菌液,菌液分上清和沉淀兩部分單獨收集,進行SDS-PAGE電泳 檢 測。由 于AhLEC1A和AhLEC1B的CDS序列僅有27個堿基差異,因此兩者目的蛋白的預(yù)測值差異不大,AhLEC1A 蛋白預(yù)測值為25.4 k D,AhLEC1B 蛋白預(yù)測值為25.3 k D。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明,在分子量25 k D和35 kD之間出現(xiàn)明顯的特異性目的條帶(圖1),分別與Ah LEC1A 和Ah LEC1B的蛋白分子量預(yù)測值一致。

2.2 Ah LEC 1基因在花生發(fā)育過程中的表達

由圖2 可知,分別在3 個花生品種中檢測AhLEC1基因在花生莢果發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄表達情況。AhLEC1基因在花育17號的花和果針中表達量低,隨著莢果發(fā)育,AhLEC1 基因表達量逐漸升高,在莢果發(fā)育的第4個時期AhLEC1基因表達量達到峰值,隨后又出現(xiàn)降低。AhLEC1基因在白沙1016和徐花9號的花和果針中也是微量表達,隨著莢果發(fā)育,AhLEC1 基因表達量逐漸升高,分別在莢果發(fā)育的第5個時期和第6個時期達到峰值,隨后逐漸降低。AhLEC1基因在3個花生品種的莢果發(fā)育過程中都出現(xiàn)先增后降的趨勢,但基因的表達量在花生不同品種間存在差異,其表達峰值出現(xiàn)的時期也有所不同,這種表達差異可能由品種間差異引起。

圖2 Ah LEC 1基因在花生不同組織及種子不同發(fā)育時期的表達分析Fig.2 Analysis on expression of AhLEC 1 in different tissues and seed development stages of peanut

AhLEC1基因在3 個花生品種種子發(fā)育過程中的表達模式略有不同,其基因表達峰值都出現(xiàn)在種子發(fā)育的第一個時期(花后35 d),發(fā)育的后期(花后45、55、65、75 d)出現(xiàn)逐漸降低的趨勢。上述結(jié)果表明,AhLEC1基因參與了花生莢果和種子的發(fā)育過程,可能是種胚形成、種子成熟、儲藏物質(zhì)積累的調(diào)控因子。

2.3 AhLEC1基因在非生物脅迫條件下的表達分析

圖3可看出,以0 h花生三葉期幼苗為對照,在4℃、NaCl和PEG6000 處理的花生葉片中AhLEC1基因均明顯誘導(dǎo)表達。AhLEC1 基因在低溫處理4h后表達量上調(diào),8 h后表達量約為對照的18倍,隨后表達量有所下降,但在24 h后表達量又達到最高,最高上調(diào)倍數(shù)約22倍。NaCl處理4h時AhLEC1基因表達無明顯變化,12 h后表達量最高,最高上調(diào)倍數(shù)約23倍,隨后表達量明顯下降。AhLEC1基因在PEG6000處理后表達量明顯上調(diào),4 h后表達量最高,為對照的12倍左右,之后表達量大幅下降。熒光定量PCR 結(jié)果表明,AhLEC1基因在轉(zhuǎn)錄水平上對低溫、高鹽及干旱三種非生物脅迫均有響應(yīng),說明該基因在花生對抗逆境脅迫中可能發(fā)揮了一定作用。

圖3 Ah LEC 1基因在非生物脅迫條件下的表達量分析Fig.3 Analysis on expression of Ah LEC 1 under abiotic stress

3 討論與結(jié)論

LEC1是真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子CBF 亞基HAP3的同源基因[16],HAP3基因可分為LEC1類型和非LEC1類型兩大類。在種子植物進化的早期,LEC1型基因參與到一個新的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,參與胚的形成以及種子發(fā)育后期物質(zhì)積累等過程[17-18]。本研究組織特異性表達分析顯示,AhLEC1基因在花生的花、果針、莢果及種子中均有不同水平的表達量。其中在花和果針中表達量低,在莢果和種子發(fā)育過程中分別出現(xiàn)了明顯的時序表達特性。AhLEC1 基因在參試的3個花生品種種子發(fā)育的第一個時期(花后35 d)表達量最高,發(fā)育的后期(花后45、55、65、75 d)出現(xiàn)逐漸降低的趨勢?；ㄉv果在花后30～60 d是快速增長階段,60 d后增長緩慢；籽仁發(fā)育相對滯后,花后40～70 d是快速增長階段[19]。因此,AhLEC1基因在花后35 d有較高的表達,說明其可能參與了花生種胚形成早期的調(diào)控。

研究表明,LEC1可能參與植物對非生物脅迫反應(yīng)的逆境信號通路。大麥根中HvLEC1基因受到鹽脅迫后快速上調(diào)表達,且在后續(xù)時間保持高表達水平,顯示HvLEC1可能在大麥對鹽脅迫的反應(yīng)中起作用[20]。劉豪等[21]研究結(jié)果表明,小麥TaLEC1基因參與ABA 依賴的脅迫響應(yīng),可能在小麥耐受高溫脅迫和滲透脅迫過程中發(fā)揮著重要的脫水保護功能。本研究通過實時熒光定量PCR 對AhLEC1 基因在低溫、高鹽及干旱脅迫下的表達模式分析發(fā)現(xiàn),AhLEC1基因?qū)θN非生物脅迫均有明顯響應(yīng),說明該基因在花生應(yīng)對逆境脅迫的反應(yīng)中可能發(fā)揮了一定的作用。

此外,前人報道,過表達LEC1基因能促進脂肪酸代謝途徑上的多個基因表達變化,從而影響植物脂肪酸合成,提高植物組織中脂肪酸含量,是植物脂肪酸代謝的重要調(diào)控因子[7,22]。因此,對AhLEC1基因的研究可進一步解析花生脂肪酸合成代謝途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為花生種子品質(zhì)改良提供研究新思路。目前對LEC1表達調(diào)控機制的研究還十分有限,LEC1與參與油脂合成途徑的其他調(diào)控因子的作用方式也有待研究[23],花生中對LEC1表達調(diào)控的研究更是鮮有報道。因此,本研究在前期試驗基礎(chǔ)上,對花生AhLEC1基因進行了原核表達分析,獲得了與理論分子量一致的目標蛋白；并對該基因在花生發(fā)育過程中的表達特性以及其對非生物脅迫的響應(yīng)進行分析,為后期深入了解AhLEC1的生物學(xué)功能和調(diào)控機制奠定重要基礎(chǔ)。