楊 豐, 張明均, 陳 超, 郝云飛, 陸忠杰, 董 瑞

(1.貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站, 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州省畜禽遺傳資源管理站, 貴陽(yáng) 550001;3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025)

裂莢是指莢果在成熟期時(shí),沿著莢皮背縫線和腹縫線開裂使種子撒播的現(xiàn)象[1-4]。裂莢特性廣泛存在于豆科(Leguminosae)、禾本科(Poaceae)和十字花科(Brassicaceae)等植物中[5-7],這是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化、演變過(guò)程中形成的重要生理特性。裂莢對(duì)植物的繁衍生息、種子的傳播以及保持物種的多樣性具有十分重要的意義[8],但對(duì)種子的收獲和生產(chǎn)卻造成了嚴(yán)重的障礙和損失[9]。吳建禹等[10]研究發(fā)現(xiàn),扁蓿豆(Melissilusruthenicus)單株在自然條件下的平均裂莢率為76.50%。胡立成[11]研究了大豆品種北娘和豐鈴,發(fā)現(xiàn)其裂莢率分別為95%和81%。孫東鳳和康玉凡[2]研究表明,中度裂莢的大豆品種產(chǎn)量減少約112.5 kg/hm2。由高裂莢率造成的“種子收獲難、買不到、用不起”的現(xiàn)象十分嚴(yán)重[12]。因此,對(duì)裂莢果的研究具有重大意義。

箭筈豌豆(Viciasativa)是一年生、自花授粉豆科植物[13],具有生育周期短、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)、固氮及改善土壤結(jié)構(gòu)的能力,主要用作飼草和綠肥[14]。現(xiàn)有的箭筈豌豆品種大部分都具有裂莢的生理特性,造成種子在收獲期前大量脫落,并在下一個(gè)生長(zhǎng)季作為雜草出現(xiàn),對(duì)種子生產(chǎn)及下一季作物的種植造成了嚴(yán)重影響,成為限制箭筈豌豆進(jìn)一步大面積推廣使用的重要因素[15-16]。目前豆科植物裂莢的生理機(jī)制主要有兩種[17],一是裂莢與莢果內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)存在密切聯(lián)系,在自然或外部機(jī)械壓力下,造成了莢果背或腹縫線上的某一位點(diǎn)開裂,且腹縫線是莢果開裂的首要部位[18];二是酶調(diào)控裂莢,即通過(guò)細(xì)胞壁修飾酶對(duì)莢果離區(qū)細(xì)胞進(jìn)行降解,如多聚半乳糖醛酸酶,纖維素酶等,導(dǎo)致離區(qū)細(xì)胞分離,產(chǎn)生裂莢。以上兩種機(jī)制相互聯(lián)系,共同作用導(dǎo)致莢果開裂。

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PGs)是一種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白[19],通過(guò)水解反應(yīng)切斷果膠分子主鏈糖苷鍵的解聚酶[20],也稱為果膠酶(Pectic enzyme)、果膠解聚酶(Pectin depolymerase)[21]。在目前已明確的10個(gè)多聚半乳糖醛酸酶的晶體結(jié)構(gòu)中,有8個(gè)是內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶,只有2個(gè)屬于外切多聚半乳糖醛酸酶[22]。內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶可隨機(jī)水解豆科植物莢果離區(qū)組織內(nèi)果膠分子中的α-1,4-糖苷鍵,促進(jìn)胞間層分解及細(xì)胞壁破裂,是調(diào)控裂莢的必要因子[21]。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,篩選出了5份抗裂莢種質(zhì)和5份易裂莢種質(zhì)作為材料,對(duì)箭筈豌豆莢果含水量、莢果裂莢機(jī)械力和內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因(VSPG1)表達(dá)量與莢果裂莢率的關(guān)系進(jìn)行探討,以期了解其裂莢特性,為抗裂莢與高種子產(chǎn)量品種選育提供材料和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的箭筈豌豆材料是通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)從75份種質(zhì)中篩選出來(lái)的5份抗裂莢種質(zhì)和5份易裂莢種質(zhì),種質(zhì)詳細(xì)信息見表1。

表1 10份箭筈豌豆種質(zhì)信息

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)貴州大學(xué)實(shí)驗(yàn)田(106°07′E,26°11′N,海拔1 100 m),地處貴州高原中部。該區(qū)具有明顯的高原氣候特點(diǎn),屬于亞熱帶濕潤(rùn)溫和型氣候。年平均氣溫14.8 ℃,年均降雨量1 347.3 mm。試驗(yàn)期間貴陽(yáng)市花溪區(qū)月平均降水量與月平均氣溫見圖1。

圖1 2020年10月—2021年5月試驗(yàn)地氣象變化

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共進(jìn)行8個(gè)月,從2020年10月到2021年5月,每個(gè)種質(zhì)設(shè)3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)種植10個(gè)單株且種植在同一個(gè)花盆內(nèi)。施肥灌水等條件相同,莢果在黃熟期進(jìn)行取樣。取貴州大學(xué)西校區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)黃壤土過(guò)篩(2 mm)后作為種植土壤,每盆裝土約5 kg。土壤pH值為5.84,全氮655 mg/kg、全鉀26.13 g/kg、全磷0.76 g/kg、速效鉀293.33 mg/kg、有效磷4.74 mg/kg、有機(jī)碳5.68 g/kg。

1.4 莢果含水量測(cè)定

將采集到的莢果稱取30 g放入鋁盒中,3個(gè)重復(fù)。先置于干燥器中自然風(fēng)干7 d,之后將盛有樣品的鋁盒置于35 ℃ 熱風(fēng)干燥烘箱持續(xù)烘干6 h后稱重,計(jì)算莢果含水量[11,23]。

1.5 莢果裂莢率測(cè)定

莢果干燥方式與測(cè)定莢果含水量的干燥方法相同,將干燥后的莢果置于2 m高處,使莢果自由掉落。清點(diǎn)摔裂的箭筈豌豆莢果數(shù)。摔裂的莢果數(shù)除以測(cè)量的莢果總數(shù)乘以百分之百為種質(zhì)裂莢率,每份種質(zhì)每個(gè)重復(fù)測(cè)量50個(gè)莢果,3次重復(fù)。詳細(xì)方法請(qǐng)見董瑞等[24]專利。

1.6 莢果裂莢機(jī)械力測(cè)定

利用艾德堡HP-50數(shù)顯推拉力計(jì)(樂(lè)清市艾德堡儀器有限公司)測(cè)定莢果開裂時(shí)所受機(jī)械力大小。測(cè)定莢果垂直裂莢機(jī)械力時(shí),用夾子夾住莢果中部將莢果垂直固定于推拉力計(jì),后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)顯推拉力計(jì)直至莢果開裂,當(dāng)莢果開裂時(shí)推拉力計(jì)可瞬時(shí)自動(dòng)記錄受力的最大值。測(cè)定莢果水平裂莢機(jī)械力時(shí)將莢果水平固定于推拉力測(cè)定儀,其余操作步驟相同。每份種質(zhì)每個(gè)重復(fù)測(cè)量50個(gè)莢果,3次重復(fù)。

1.7 PG酶含量動(dòng)態(tài)變化分析

利用多聚半乳糖醛酸酶檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,BC2665)對(duì)各種質(zhì)開花后10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的莢果離區(qū)組織中的PG酶含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 VSPG1基因表達(dá)模式分析

采集開花后10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的莢果離區(qū)組織,采用Trizol法提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。利用課題組前期對(duì)箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出與裂莢相關(guān)的VSPG1基因,并將在箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜中表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定且功能尚未明確的Unigene68614作為內(nèi)參基因[13]。使用Primer Premier6軟件設(shè)計(jì)基因的特異引物,引物信息見表2。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因與目標(biāo)基因在每個(gè)樣品中進(jìn)行3次qRT-PCR,最后使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平。

表2 qRT-PCR分析的引物信息

1.9 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各種質(zhì)之間的機(jī)械裂莢力以及單個(gè)種質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)莢果離區(qū)組織中的PG酶含量進(jìn)行方差分析,對(duì)各種質(zhì)的裂莢機(jī)械力和裂莢率進(jìn)行相關(guān)性分析,并使用Excel2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 莢果含水量

通過(guò)烘干法對(duì)10份箭筈豌豆種質(zhì)的莢果含水量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),不同種質(zhì)之間的莢果含水量差異不顯著,其中,L461的莢果含水量最高,為5.170%,L29的莢果含水量最低,為4.944%(表3)。10份種質(zhì)的平均莢果含水量為5.116%。同時(shí),對(duì)不同類型箭筈豌豆的莢果裂莢率進(jìn)行方差分析,發(fā)現(xiàn)10份種質(zhì)之間的莢果裂莢率存在極顯著差異,其中L92和L29的莢果裂莢率最高,為100%,B17和B62的莢果裂莢率最低,為0(表3)。

表3 10種箭筈豌豆種質(zhì)莢果含水量和莢果裂莢率

2.2 莢果裂莢機(jī)械力

莢果在水平放置狀態(tài)下莢果裂莢機(jī)械力測(cè)試方法如圖2A～圖2D所示。在抗裂莢種質(zhì)中,B62這一種質(zhì)的莢果裂莢機(jī)械力最大,為11.298 N,B302種質(zhì)的莢果裂莢機(jī)械力最小,為7.046 N(表4)。在易裂莢種質(zhì)中,L461這一種質(zhì)的莢果裂莢機(jī)械力最大,為2.545 N,L92種質(zhì)的莢果裂莢機(jī)械力最小,為1.708 N。值得注意的是,在水平放置狀態(tài)下莢果裂莢機(jī)械力最小的抗裂莢種質(zhì)(B302)與莢果裂莢機(jī)械力最大的易裂莢種質(zhì)之間(L461)裂莢機(jī)械力仍然存在極顯著差異。莢果在垂直放置狀態(tài)下莢果裂莢機(jī)械力測(cè)試方法如圖2E、F所示。在抗裂莢種質(zhì)中,B302的莢果裂莢機(jī)械力最大,為26.137 N,B62的莢果裂莢機(jī)械力最小,為21.282 N。在易裂莢種質(zhì)中,L461的莢果裂莢機(jī)械力最大,為8.888 N,L92種質(zhì)的莢果裂莢機(jī)械力最小,為5.201 N。另外,在垂直放置狀態(tài)下莢果裂莢機(jī)械力最小的抗裂莢種質(zhì)(B62)與莢果裂莢機(jī)械力最大的易裂莢種質(zhì)(L461)之間裂莢機(jī)械力也存在極顯著差異。

注:A和B為垂直裂莢機(jī)械力測(cè)量時(shí)莢果放置方式;C和D為垂直放置時(shí)莢果受力開裂直到完全裂開;E為水平裂莢機(jī)械力測(cè)量時(shí)莢果放置方式;F和G為水平放置時(shí)莢果受力開裂直到完全裂開;H為推拉力計(jì)操作界面;圖中莢果開裂位置均為腹縫線部位。

表4 箭筈豌豆種質(zhì)莢果水平和垂直狀態(tài)下裂莢機(jī)械力

由圖3也可以看出,無(wú)論是易裂莢還是抗裂莢種質(zhì),垂直放置時(shí)莢果裂莢機(jī)械力都顯著大于水平放置狀態(tài)時(shí)的莢果裂莢機(jī)械力,且隨著莢果裂莢率的逐漸升高,莢果裂莢機(jī)械力則呈逐漸降低的趨勢(shì)。

注;柱形上方的不同小寫字母表示存在顯著差異(p<0.05)。下同。

2.3 莢果裂莢率和莢果裂莢機(jī)械力的相關(guān)分析

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),箭筈豌豆的莢果水平裂莢機(jī)械力和垂直裂莢機(jī)械力都與箭筈豌豆的莢果裂莢率呈極顯著負(fù)相關(guān)。其中,垂直裂莢機(jī)械力與裂莢率之間的相關(guān)性系數(shù)為-0.986,水平裂莢機(jī)械力與裂莢率之間的相關(guān)性系數(shù)為-0.960(表5)。

表5 箭筈豌豆裂莢機(jī)械力與裂莢率之間的相關(guān)性分析

2.4 PG含量動(dòng)態(tài)變化分析

在5種易裂莢種質(zhì)中,莢果離區(qū)組織中的PG酶含量隨著莢果成熟天數(shù)的增加而顯著上升,且都在22 d左右時(shí)PG酶含量達(dá)到最大,在26 d左右時(shí)略微下降,但下降差異均不顯著(圖4)。在5種抗裂莢種質(zhì)中,莢果離區(qū)組織中的PG酶含量同樣隨著莢果成熟天數(shù)的增加而顯著上升,且除了B17在26 d左右時(shí)PG酶含量達(dá)到最大外,其余種質(zhì)均在22 d左右時(shí)PG酶含量達(dá)到最大,之后在26 d左右時(shí)略微下降,但除了B302下降差異顯著外,其余種質(zhì)下降差異均不顯著(圖5)。雖然大部分抗裂莢種質(zhì)和易裂莢種質(zhì)莢果離區(qū)組織中的PG酶含量均是在22 d左右時(shí)達(dá)到最大,但5種抗裂莢種質(zhì)莢果離區(qū)組織中最大水平時(shí)的PG酶含量顯著小于5種易裂莢種質(zhì)最大水平時(shí)的PG酶含量(圖6),且僅相當(dāng)于5種易裂莢種質(zhì)莢果發(fā)育10～14 d時(shí)離區(qū)組織中的PG酶含量(圖4,圖5)。

圖4 5種易裂莢箭筈豌豆種質(zhì)莢果發(fā)育過(guò)程中PG酶含量動(dòng)態(tài)變化

圖5 5種抗裂莢箭筈豌豆種質(zhì)莢果發(fā)育過(guò)程中PG酶含量動(dòng)態(tài)變化

圖6 10份箭筈豌豆種質(zhì)莢果發(fā)育第22天時(shí)PG酶含量對(duì)比

2.5 VSPG1基因表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)箭筈豌豆種質(zhì)莢果發(fā)育10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的調(diào)控多聚半乳糖醛酸酶表達(dá)的VSPG1基因表達(dá)量。如圖7所示,10種種質(zhì)莢果離區(qū)組織中VSPG1基因表達(dá)量均在22 d左右時(shí)達(dá)到最大,在26 d左右時(shí)略微下降。這與箭筈豌豆莢果發(fā)育過(guò)程中離區(qū)組織中PG酶含量的變化趨勢(shì)一致。

圖7 10份箭筈豌豆種質(zhì)莢果發(fā)育過(guò)程中VSPG1基因表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化

3 討 論

胡立成[11]研究發(fā)現(xiàn),大豆的莢果含水量與裂莢率呈顯著負(fù)相關(guān),莢果的含水量越低裂莢率越高,且當(dāng)莢果的含水量小于5.00%時(shí),莢果的裂莢率達(dá)到最大。楊德旭等[25]對(duì)國(guó)內(nèi)的大豆品種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),只有當(dāng)大豆的含水量低于25.00%且豆殼的含水量在15.00%以下時(shí),大豆才能發(fā)生裂莢。在其他科植物中,莢果的含水量對(duì)裂莢也有一定的影響,如在花生品種中花生莢果含水量為12.0%～13.5%范圍時(shí),脫殼率最高[26]。綜上所述,在準(zhǔn)確評(píng)估箭筈豌豆以及其他相關(guān)植物的裂莢特性之前,應(yīng)先去除莢果含水量對(duì)其產(chǎn)生的影響。在本試驗(yàn)中,對(duì)10種所試箭筈豌豆莢果材料進(jìn)行自然風(fēng)干和烘箱烘干共同處理,莢果的含水量都降至5.12%左右,且各種質(zhì)之間的莢果含水量差異不顯著(表3),表明此時(shí)的莢果含水量已趨于穩(wěn)定,可以忽略其對(duì)裂莢率以及裂莢機(jī)械力的測(cè)量所產(chǎn)生的影響。

莢果的裂莢機(jī)械力也常作為相關(guān)物種品種改良的目的指標(biāo)之一。Davies等[27]對(duì)6個(gè)品種的油菜角果進(jìn)行裂莢測(cè)試,測(cè)得A品種與E品種角果的最大機(jī)械裂莢力分別為0.58 N和5.90 N,差異極顯著。因此,認(rèn)為通過(guò)育種的手段來(lái)改良油菜的裂莢特性是可行的。本實(shí)驗(yàn)中,利用數(shù)顯推拉力計(jì)對(duì)10種箭筈豌豆的垂直和水平方向的裂莢機(jī)械力進(jìn)行了測(cè)量。其中,當(dāng)莢果垂直放置時(shí),易裂莢種質(zhì)和抗裂莢種質(zhì)的平均裂莢機(jī)械力為6.79 N和24.04 N,差異顯著(表4)。當(dāng)莢果水平放置時(shí),易裂莢種質(zhì)和抗裂莢種質(zhì)的平均裂莢機(jī)械力為2.23 N和9.16 N,差異顯著(表4)。且通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),箭筈豌豆的莢果裂莢率與垂直裂莢機(jī)械力和水平裂莢機(jī)械力都呈極顯著負(fù)相關(guān)(表5)。本研究認(rèn)為,通過(guò)箭筈豌豆莢果的水平裂莢機(jī)械力以及垂直裂莢機(jī)械力的大小,可以準(zhǔn)確地反映出箭筈豌豆裂莢率的變化。因此,可以將箭筈豌豆裂莢機(jī)械力的大小作為評(píng)價(jià)其裂莢特性的方法之一,這也與Davies等[27]的研究結(jié)果相符。本研究表明,測(cè)量箭筈豌豆莢果的裂莢機(jī)械力時(shí),莢果的裂莢機(jī)械力大于抗裂莢種質(zhì)平均裂莢機(jī)械力的種質(zhì)應(yīng)定義為不易裂莢種質(zhì)。相反,裂莢機(jī)械力小于易裂莢種質(zhì)平均裂莢機(jī)械力的種質(zhì)則定義為易裂莢種質(zhì)。

Agrawal等[28]對(duì)大豆莢果中的纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶主要存于莢果離區(qū)中間層。Sander等[29]在十字花科植物油菜(Brassicanapus)中鑒定到了一個(gè)PG基因(RDPG1),其啟動(dòng)子活性分析結(jié)果表明,該基因主要在莢果和花藥的離區(qū)表達(dá)。Dong等[30]對(duì)大豆莢果的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),抗裂莢種質(zhì)莢果離區(qū)組織中的纖維帽細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞壁厚度遠(yuǎn)大于易裂莢種質(zhì),因此認(rèn)為莢果開裂與纖維帽細(xì)胞的發(fā)育有密切聯(lián)系。以上研究結(jié)果均表明,莢果的裂莢特性受莢果的離區(qū)組織結(jié)構(gòu)影響。由于莢果的水平裂莢機(jī)械力測(cè)量時(shí)的受力部位為莢果離區(qū)組織附近,而垂直裂莢機(jī)械力測(cè)量時(shí)的受力部位則為莢果表皮。因此,本研究認(rèn)為莢果的水平裂莢機(jī)械力比垂直裂莢機(jī)械力更為科學(xué)、精確。且抗裂莢種質(zhì)的平均水平裂莢機(jī)械力是易裂莢種質(zhì)的4.1倍,而平均垂直裂莢機(jī)械力是易裂莢種質(zhì)的3.5倍(表4),可見用水平裂莢機(jī)械力來(lái)評(píng)定裂莢等級(jí)更為準(zhǔn)確。

本研究對(duì)10份箭筈豌豆種質(zhì)莢果成熟過(guò)程中離區(qū)組織中的PG酶含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),大部分種質(zhì)腹縫線離區(qū)組織中的PG酶含量在22 d左右時(shí)達(dá)到最大,之后略微下降(圖4,圖5)。原因可能是莢果逐漸接近完全成熟狀態(tài)時(shí),水分和干物質(zhì)含量急劇下降導(dǎo)致部分PG酶發(fā)生降解。5種抗裂莢種質(zhì)腹縫線離區(qū)組織中最大水平時(shí)的PG酶含量?jī)H為5種抗裂莢種質(zhì)最大水平時(shí)PG酶含量的三分之一,差異顯著(圖6)。因此,莢果接近成熟狀態(tài)時(shí),腹縫線離區(qū)組織中的PG酶含量是決定其是否裂莢的重要因素,這也與Agrawal等[27]的研究結(jié)果一致。VSPG1通過(guò)在莢果離區(qū)細(xì)胞胞間層不斷積累致使其逐漸溶解,并最終導(dǎo)致胞間層的消失,其對(duì)細(xì)胞壁的修飾十分明顯[31]。除此之外,VSPG1還有葡萄糖酶協(xié)同作用來(lái)削弱莢果離區(qū)細(xì)胞的初生壁[31]。本研究中,10種種質(zhì)的VSPG1基因的表達(dá)模式基本相同(圖7),且分別與各自種質(zhì)莢果離區(qū)組織中的PG酶含量動(dòng)態(tài)變化一致。因此,本研究認(rèn)為VSPG1基因通過(guò)調(diào)控莢果離區(qū)組織中的PG酶表達(dá)從而導(dǎo)致裂莢。這為從基因水平出發(fā)改良和選育抗裂莢和高種子產(chǎn)量品種提供了新的思路。