李亮亮雷 高李 磊杜志敏甄 靜王繼雯劉德海楊文玲

(河南省科學院生物研究所有限責任公司/河南省微生物工程重點實驗室,河南 鄭州 450008)

花生(ArachishypogaeaL.)是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物[1]。據(jù)統(tǒng)計,我國每年的花生產(chǎn)量達16 000 kt以上,占世界花生年產(chǎn)量的40%左右[2]。由于花生連作現(xiàn)象及種植面積的擴大,目前我國花生種植面臨的問題主要有病蟲害嚴重、土壤微生物種群失衡、單產(chǎn)量低等[3-5],給我國花生產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的破壞和巨大的經(jīng)濟損失。植物內(nèi)生細菌是指定殖在健康植物的器官內(nèi),與宿主植物形成共生關系,且不會引起植物侵染性病害的一類微生物[6]。研究表明,植物內(nèi)生細菌具有豐富的種群多樣性,對寄主植物具有促生[7]、防病[8]、內(nèi)生固氮[9]等多種生物學作用,同時內(nèi)生細菌還能降解環(huán)境中的污染物,具有生物修復能力[10-11]。

目前對花生內(nèi)生細菌多樣性的研究一般采用培養(yǎng)法,即先從花生植株體內(nèi)分離獲得純培養(yǎng)后,再對分離菌株進行鑒定得到生物多樣性信息。方揚等[12]通過培養(yǎng)法從四川省3個花生品種天府11號、天府12號、天府13號的不同部位中共分離到220株內(nèi)生細菌,采用傳統(tǒng)分類法共鑒定出17個屬。王善林[13]通過平板稀釋涂布從山東省花生品種大白沙的不同生育期共純化分離得到94株內(nèi)生細菌。根據(jù)聚類分析圖,選擇其中31株代表性菌株進行了16S rRNA 序列測定,將94株內(nèi)生細菌分為14個屬。但由于自然界中只有不到1%的微生物可以進行體外培養(yǎng)[14],所以通過培養(yǎng)法分離得到植物內(nèi)生細菌具有很大的局限性。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展,植物內(nèi)生細菌多樣性研究迎來了新的契機。高通量測序技術(shù)不需要對內(nèi)生細菌進行分離培養(yǎng),直接從DNA 層面對內(nèi)生細菌進行種群組成分析,可提供更加豐富、準確的植物內(nèi)生細菌多樣性信息[15]。本文以花生根、莖、葉、花不同器官為研究對象,通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對花生內(nèi)生細菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)進行分析,旨在獲得更加全面、準確的花生內(nèi)生細菌多樣性信息,為以后開發(fā)和利用花生內(nèi)生細菌這種有益生防資源奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

花生樣本采自河南省汝南縣小麥原種場(114°21'51''E,32°49'43''N),花生品種為豫花37號。多位點隨機選取5株長勢良好的盛花期花生植株放入自封袋,置于冰盒中帶回實驗室?；ㄉ仓瓯砻娴哪嗤劣脽o菌水洗凈后,無菌紙吸干,按根(R)、莖(S)、葉(L)、花(F)不同器官分開并混合均勻。

1.2 植物器官表面消毒

將花生根、莖、葉、花不同器官用無菌水沖洗30 s,接著用75%的乙醇溶液處理2 min,轉(zhuǎn)移到2.5%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min,最后再用無菌水洗滌各器官3次。最后一遍洗滌液經(jīng)涂板檢測無菌后進行基因組DNA 的提取。

1.3 樣本總DNA 提取和PCR 擴增測序

使用Fast DNA Spin Kit(MP Biomedicals)試劑盒對花生不同器官樣本進行總DNA 的提取。DNA 樣品經(jīng)檢測合格后,送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行PCR 擴增和高通量測序。選擇細菌16S r RNA 通用引物799F、1193R 對內(nèi)生細菌16S r RNA 序列的V5～V7 可變區(qū)進行擴增,該引物可以一定程度上避免寄主植物葉綠體和線粒體的污染[16]。引物序列為799F:5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3',1193R:5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'。20μL 反應體系:4μL 5×Fast Pfu Buffer,2μL d NTPs(2.5 mmol/L),

上下游引物(5μmol/L)各0.8μL,0.4μL FastPfu Polymerase,1μL DNA 模 板(10 ng/μL),0.2μL BSA,補dd H2O 至20μL。PCR 反應條件:95℃、3 min；95℃、30 s,55℃、30 s,72℃、45 s,27個循環(huán)；72℃、10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測后,通過Illumina公司MiSeq測序平臺進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序完成后,根據(jù)PE reads之間的overlap使用Flash軟件進行序列拼接,然后經(jīng)過Tags 過濾和Tags去嵌合體后得到有效序列。使用Uparse軟件按照97%相似性對獲得的有效序列進行OTU 聚類和物種多樣性分析[17]。通過Mothur和Qiime軟件計算花生不同器官內(nèi)生細菌基于OTU 分類水平的生物多樣性指數(shù),主要包括Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)[18]。通過對花生器官樣本進行層級聚類分析和主成分分析,探索不同器官樣本間內(nèi)生細菌群落組成的相似性和差異性。最后通過PICRUSt軟件進行代謝功能預測分析,比較功能基因在生物代謝通路上的豐度差異,從而獲得花生不同器官內(nèi)生細菌群落功能預測信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生不同器官內(nèi)生細菌OTU 聚類及其多樣性分析

通過對花生根、莖、葉、花不同器官內(nèi)生細菌進行高通量測序,共得到有效序列條數(shù)61 396,其中根部為16 321、莖部為15 694、葉部為15 001、花部為14 380(表1)。在97%相似度水平下共得到468個OTU,根、莖、葉、花不同器官的OTU數(shù)量分別為303、246、207和92,花生根部內(nèi)生細菌在有效序列數(shù)和OTU 數(shù)量上都是最多的。選取OTU 列表,繪制韋恩圖(圖1)。從圖中可看出,花生不同器官共有的OTU 數(shù)量為49個,根、莖、葉、花不同器官特有的OTU 數(shù)量分別為119、65、59和7,其余OTU 為不同器官間共有。其中,根部和莖部共有的OTU 數(shù)量最多,為148,葉部和花部共有的OTU 數(shù)量最少,為56。

圖1 花生不同器官內(nèi)生細菌OTU 分布韋恩圖Fig.1 Venn OTUs analysis on endophytic bacteria in different organs of peanut

基于OTU 分類水平,對花生內(nèi)生細菌進行了Alpha多樣性指數(shù)分析。在Alpha多樣性分析中,Chao指數(shù)和Ace指數(shù)用來表示群落豐富度。Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)用來表示群落多樣性,Shannon指數(shù)值越高、Simpson指數(shù)值越低表明群落多樣性越高。表1可知,花生根部內(nèi)生細菌的豐富度和均勻度最高,莖部和葉部次之,花部最低。Sobs稀釋曲線(圖2)表明,隨抽樣數(shù)的增加,4個樣本的Sobs指數(shù)逐漸趨于平坦,說明繼續(xù)加大測序量會在一定程度上增加樣本的OTU 數(shù)量。但Shannon稀釋曲線(圖3)顯示,隨著抽樣數(shù)的增加,4個樣本的Shannon指數(shù)已趨于平緩,更多的測序量并不會對樣本的群落多樣性有顯著影響,所以基于現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)得到的分析結(jié)果準確可靠。

圖2 Sobs稀釋曲線Fig.2 Sobs rarefaction curve

圖3 Shannon稀釋曲線Fig.3 Shannon rarefaction curve

表1 花生不同器官內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)分析Table 1 Diversity index of endophytic bacterial community in different organs of peanut

2.2 花生不同器官內(nèi)生細菌群落組成和豐度分析

對花生根、莖、葉、花不同器官內(nèi)生細菌進行種群歸類分析,花生不同器官內(nèi)生細菌一共可歸類為21個細菌門、43 個細菌綱、107 個細菌目、177個細菌科和284個細菌屬。花生不同器官內(nèi)生細菌的分類階層總數(shù)有較大差別(表2),其中根部的內(nèi)生細菌多樣性最豐富,莖部和葉部次之,花部位所含的內(nèi)生細菌種類最少。

表2 花生不同器官內(nèi)生細菌物種分類階層統(tǒng)計Table 2 Taxonomic rank of endophytic bacteria in different organs of peanut

在門、綱和屬分類水平上對花生根、莖、葉、花不同器官內(nèi)生細菌群組成和相對豐度進行分析。樣本中的相對豐度＜0.01%的菌群歸為其他分類,相對豐度＞5.00%的菌群為優(yōu)勢菌群。

花生根部內(nèi)生細菌包含18個門,其中變形菌門(Proteobacteria)相對豐度最大,達到79.14%,其次是厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)和擬桿菌門(Bacteroidetes),相對豐度分別為13.61%、4.17%和1.94%。在綱分類水平上,包含31個綱,以γ-變形菌綱γ-proteobacteria(49.76%)、α-變形菌綱α-proteobacteria(29.32%)和芽孢桿菌綱Bacilli(12.95%)為主。在屬水平包含204個屬,優(yōu)勢菌屬有假單胞菌屬(Pseudomonas)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和魏斯氏菌屬(Weissella),相對豐度分別為37.67%、25.13%、7.38%。相對豐度＞1.00%的屬還有Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(4.26%)、Escherichia-Shigella(3.65%)、Enterococcus(2.93%)、Rhodococcus(2.38%)、Lactobacillus(2.08%)和Bacteroides(1.34%),另有Burkholderiaceae科下未知屬占1.50%(圖4a)。

花生莖部內(nèi)生細菌包含13個門,其中以變形菌門(Proteobacteria)為主,占總數(shù)的82.20%,其次是放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes),占比分別為10.58%、5.10%和1.12%。莖部內(nèi)生細菌包含30個綱,以γ-變形菌綱γ-proteobacteria(79.30%)、放線菌綱Actinobacteria(10.04%)、芽孢桿菌綱Bacilli(4.34%)、α-變形菌綱α-proteobacteria(2.91%)和擬桿菌綱Bacteroidia(1.10%)為主。在屬分類水平上,包含169個屬,優(yōu)勢屬有假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅球菌屬(Rhodococcus),相對豐度分別為73.12%和8.88%。相對豐度＞1.00%的屬還有Weissella(2.31%)、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(1.59%)、Escherichia-Shigella(1.45%)、Ralstonia(1.3%)和Ochrobactrum(1.3%)(圖4b)。

花生葉部內(nèi)生細菌覆蓋14個門,其中以變形菌門(Proteobacteria)為主,相對豐度為86.27%,其次是放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes),占比分別為9.76%和2.73%。包含27個綱,以γ-變形菌綱γ-proteobacteria(83.15%)、放線菌綱Actinobacteria(9.50%)、α-變形菌綱α-proteobacteria(3.11%)、芽孢桿菌綱Bacilli(1.65%)和梭菌綱Clostridia(1.08%)為主。在屬分類水平上,包含141 個屬,優(yōu)勢屬有假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅球菌屬(Rhodococcus),相對豐度分別為78.65%和8.55%。相對豐度＞1.00%的屬還有Ralstonia(1.58%)和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(1.19%) (圖4c)。

圖4 基于屬水平的花生不同器官內(nèi)生細菌群落組成分析Fig.4 Community composition analysis on endophytic bacteria in peanut different organs based on genus level

花生花部內(nèi)生細菌覆蓋7個門,以變形菌門(Proteobacteria)為主,相對豐度達98.28%。包含13個綱,其中γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)占絕對優(yōu)勢,相對豐度達97.85%。在屬分類水平上,包含66個屬,優(yōu)勢細菌屬有歐文菌科(Erwiniaceae)下的未知屬和假單胞菌屬(Pseudomonas),相對豐度分別為80.56%和15.15%。相對豐度＞1.00%的屬還有Herbaspirillum(1.22%)(圖4d)。

2.3 花生不同器官樣本間分析比較

對花生不同器官內(nèi)生細菌的多樣性信息進行比較,發(fā)現(xiàn)在門和綱分類水平上,占比最多的均為變形菌門(Proteobacteria)和γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)。但在屬分類水平上,樣本之間差異明顯?？傮w來看,花生根部的內(nèi)生細菌種類最為豐富,相對豐度＞1.00%且能準確分類的屬有9個,其次是莖部、葉部和花部,分別為7個、4個和2個。從優(yōu)勢菌屬的組成來看,花生莖部和葉部內(nèi)生細菌多樣性最為相似,優(yōu)勢屬均為假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅球菌屬(Rhodococcus)。根部內(nèi)生細菌優(yōu)勢屬除了豐度最大的假單胞菌屬(Pseudomonas)外,還有其他器官沒有或豐度很低的慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)?；趯偎綐?gòu)建的層級聚類樹(圖5)表明,4個樣本器官聚成3個群,其中莖部和葉部聚在一塊,表明花生莖部和葉部內(nèi)生細菌具有較高的相似度。通過主成分分析(PCA)可知,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)貢獻率分別為84.78%和15.16%,合計為99.94%,是差異的主要來源?；ㄉo部和葉部內(nèi)生細菌相似性較高,兩者分布在第四象限并且有明顯的聚集。花生根部、花部與莖葉部內(nèi)生細菌差別較大,在PCA 圖上分離較大,分別分布在第一象限和第三象限(圖6)。

圖5 花生不同器官內(nèi)生細菌層級聚類分析Fig.5 The hierarchical clustering analysis on endophytic bacterial community in different organs of peanut

圖6 花生不同器官內(nèi)生細菌PCA 分析Fig.6 The PCA analysis on endophytic bacterial community in different organs of peanut

2.4 花生不同器官內(nèi)生細菌功能預測

采用PICRUSt軟件將測序所得的16S r RNA數(shù)據(jù)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進行對比,獲得花生不同器官內(nèi)生細菌在不同代謝通路上的豐度信息(表3)。由結(jié)果可知,花生內(nèi)生細菌所有菌群參與的生物代謝通路有6類,包括新陳代謝(Metabolism)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、細胞進程(Cellular Processes)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、人類疾病(Human Diseases)和生物體系統(tǒng)(Organismal Systems)。其中葉部參與各種功能活動的內(nèi)生細菌物種豐度最高,其次是莖部和根部,花部參與調(diào)控各種代謝的內(nèi)生細菌豐度最低。

表3 花生不同器官內(nèi)生細菌KEGG 功能豐度分析Table 3 KEGG metabolic pathway abundance of endophytic bacterial community in different organs of peanut

3 結(jié)論與討論

本文研究了豫花37號花生根、莖、葉、花不同器官內(nèi)生細菌多樣性,獲得了花生不同器官內(nèi)生細菌在不同分類水平上的優(yōu)勢菌群和豐度信息。結(jié)果表明,花生不同器官內(nèi)生細菌共包含21個細菌門和284個細菌屬,表現(xiàn)出了豐富的生物多樣性。在門分類水平上,變形菌門是花生體內(nèi)的優(yōu)勢類群,在根部、莖部、葉部、花部所占的比例分別為79.14%、82.20%、86.27%和98.28%。變形菌門是在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最廣泛的一個細菌菌門,其物種和遺傳多樣性極為豐富,已經(jīng)廣泛應用于植物病蟲害防治、土壤修復、生物固氮等方面[19-21]。放線菌門在根部、莖部和葉部也占有較高的比例,該門細菌可以在生長過程中產(chǎn)生大量且種類繁多的抗生素[22],是一類非常重要的生防微生物。在屬分類水平上,假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅球菌屬(Rhodococcus)是花生不同部位共有且相對豐度較大的細菌屬。Wang等[23]和Fernando等[24]都從花生體內(nèi)分離到了大量假單胞菌屬細菌,但都未發(fā)現(xiàn)紅球菌屬細菌的存在。王善林等[13]從大白沙花生體內(nèi)分離到14個屬的內(nèi)生細菌,其中芽孢桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢菌群,且在花生不同生育時期均能分離到。而本研究中,在相對豐度＞0.01%的水平上并未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬細菌的存在?；ㄉ鷥?nèi)生細菌多樣性有較大差異的原因可能是受花生品種、環(huán)境氣候和生長期等因素的影響。此外,在花生根部還發(fā)現(xiàn)了大量慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)細菌的存在,這與康凱等[25]研究發(fā)現(xiàn)花生根瘤菌大部分屬于慢生根瘤菌屬的結(jié)論相一致。

本研究通過高通量測序結(jié)果表明,花生根部內(nèi)生細菌的有效測序數(shù)和OTU 數(shù)目最多,多樣性最為豐富,莖部和葉部次之,花部內(nèi)生細菌多樣性最低。但與方揚等[12]對天府系列13號花生可培養(yǎng)內(nèi)生細菌研究的結(jié)果有所不同,本研究經(jīng)測序表明假單胞菌屬(Pseudomonas)是花生內(nèi)生細菌的絕對優(yōu)勢屬,而對天府系列13號花生可培養(yǎng)內(nèi)生細菌研究則顯示芽孢桿菌屬(Bacillus)是花生體內(nèi)優(yōu)勢屬。由此可見,采用培養(yǎng)法研究植物內(nèi)生細菌多樣性與高通量測序結(jié)果有較大不同,說明花生體內(nèi)還有大量未被培養(yǎng)分離出的內(nèi)生細菌需要進一步深入研究。