瞿廣勝， 李顯娛， 徐 林， 劉鈺潔， 韋 剛， 蔡貴香

(安順市疾病預(yù)防控制中心， 貴州 安順 561000)

0 引言

【研究意義】真菌毒素是真菌在特定環(huán)境下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，常污染豆類、谷物、水果和蔬菜等植源性農(nóng)產(chǎn)品及制品，并通過食物鏈富集作用，威脅人類健康和畜禽養(yǎng)殖安全。真菌毒素污染被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)視為全球食源性疾病的禍?zhǔn)譡1]。在自然界特定環(huán)境下，一種真菌會產(chǎn)生多種毒素[2]，不同的豆類及制品在加工、貯存、運(yùn)輸過程中，也會被多種不同的真菌污染，使得真菌毒素的污染存在組分復(fù)雜、污染范圍廣、種類多的特點。豆類及制品中基質(zhì)復(fù)雜，如豆類中含有大量蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物，豆腐乳、豆瓣醬等豆類制品中含有幾十種香料和香精，這些基質(zhì)中的次生代謝產(chǎn)物易對目標(biāo)分析物造成嚴(yán)重干擾，而以多種混合凈化填料組合的QuEChERS前處理技術(shù)[3]，可快速去除此類干擾，該技術(shù)操作簡便、快速、成本低，是真菌毒素多樣本前處理的有效手段[4]。【前人研究進(jìn)展】國家標(biāo)準(zhǔn)對真菌毒素的檢測方法主要有UPLC法、HPLC-柱前/柱后衍生法、ELISA法、免疫親和柱-熒光光度法和LC-MS/MS等方法[5]。LC-MS/MS法采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(multi reaction monitor，MRM；僅采集目標(biāo)母離子和對應(yīng)子離子對，有效去除背景離子信號干擾)進(jìn)行真菌毒素定量分析[6]，該方法具有分析速度快、分辨率高、定量準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)的特點。【研究切入點】目前，國內(nèi)關(guān)于豆類及制品中玉米赤霉烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-AcDON)和15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-AcDON)的研究尚未見報道[7-8]，且國家標(biāo)準(zhǔn)僅針對豆類及制品中的單一種類真菌毒素開展分析，尚未建立豆類及制品中真菌毒素多組分定量研究方法[9-10]。因此，構(gòu)建QuEChERS提取-UPLC-MS/MS測定豆類及制品中6種真菌毒素的分析方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以8種不同類別的豆類及制品樣本為基質(zhì)，通過對QuEChERS前處理技術(shù)和LC-MS/MS方法進(jìn)行聯(lián)合優(yōu)化[11-14]，首次建立了豆類及制品中黃曲霉毒素B1(AFTB1)、ZEN、DON、3-AcDON、15-AcDON和赭曲霉毒素(OTA)6種真菌毒素的定量分析方法，為豆類及制品中以及其他類食品基質(zhì)中真菌毒素多組分定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 試驗用豆腐、豆腐乳、小豆、蕓豆、綠豆、菜豆、豌豆、黃豆8類樣本，均為市購。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲酸、甲酸銨、乙酸銨(色譜純，上海阿拉丁生化科技有限公司)，氨水、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉(分析純，重慶川東化工有限公司)，C18、丙基乙二胺(PSA)(色譜純，美國安捷倫科技有限公司)， AFTB1、ZEN、DON、3-AcDON、15-AcDON和OTA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.1.3 儀器 QTRAP 4500液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司)，XSE105DU十萬分之一分析天平、ME204TS萬分之一分析天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司)，TCL16M高速冷凍離心機(jī)(凱特實驗儀器有限公司)，SD290H超聲儀(北京中晟科技有限公司)，LW20恒溫水浴震蕩器(北京萊伯泰科科技有限公司)，ELGA PURELAB Option-R純水機(jī)(法國威立雅公司)，Ultimate XB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，月旭科技有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精準(zhǔn)稱取6種真菌毒素固體標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的單個標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再以乙腈稀釋為質(zhì)量濃度100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品制備

豆類干性樣本采樣量需大于1 kg，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，過20目篩，使其粒徑小于0.5～1 mm孔徑篩，混合均勻后縮分至100 g，儲存于樣品瓶中，干燥密封保存；濕性樣本經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎混勻后取100 g，儲存于樣品瓶中，于-20℃冰箱中保存待用。

1.4 樣本前處理

樣本以QuEChERS前處理技術(shù)進(jìn)行凈化除雜。準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入10 mL水放置10 min，加1%甲酸乙腈提取溶液10 mL，加鹽析劑(無水硫酸鈉4 g、氯化鈉4 g、檸檬酸鈉1 g)，渦旋混合器混勻2 min，超聲提取10 min，于4℃條件下，11 000 r/min離心10 min。取出轉(zhuǎn)移5 mL上清液于15 mL離心管中，加凈化劑(MgSO4︰PSA︰C18質(zhì)量比為3︰2︰1)1.2 g，振搖混勻5 min，于4℃條件下，11 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待分析。

1.5 色譜條件及質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜 正離子模式：流動相A相為0.05%甲酸水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫條件：0～1 min，20% B；1～5.5 min，20%～90% B；5.5～7.5 min，90% B；7.5～8 min，90%～20% B；8～10 min，20% B。負(fù)離子模式：流動相A相為0.05%氨水，B相為甲醇，梯度洗脫條件：0～1 min，10% B；1～7 min，10%～90% B；7～9 min，90% B；9～9.5 min，90%～10% B；9.5～15 min，10% B。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

1.5.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，通過ESI+、ESI-模式進(jìn)行掃描，其質(zhì)譜參數(shù)為電噴霧正離子模式電壓，+5 500 V，電噴霧負(fù)離子模式電壓，-4 500 V；氣簾氣(CUR)，35 psi；噴霧氣(GS1)，50 psi；輔助加熱氣(GS2)，50 psi；離子源溫度，500℃；針泵流速10 μL/min。6種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 條件優(yōu)化及指標(biāo)考察

1.6.1 色譜條件優(yōu)化 試驗利用質(zhì)量濃度為100 ng/mL的6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過ESI+和ESI-模式分別對甲醇-水、乙腈-水進(jìn)行考察，并對影響離子化效率的甲酸、氨水、甲酸銨和乙酸銨添加劑進(jìn)行考察。

1.6.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 配置質(zhì)量濃度為200 ng/mL的真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵恒流進(jìn)樣模式、電噴霧離子源(ESI)和多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，分別在ESI+和ESI-模式下進(jìn)行母離子和子離子掃描，選擇強(qiáng)度高、穩(wěn)定性佳的離子對2～3對，再通過MRM模式分別對6種真菌毒素離子對的去簇電壓、碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，最終確定2對離子對作為定量離子和定性離子。

1.6.3 提取方式考察 在空白樣品中添加100 μg/kg的6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察震蕩、超聲2種提取方式和不同提取時間(0 min，10 min，20 min，30 min，60 min)對加標(biāo)回收率的影響。

1.6.4 鹽析劑與凈化劑 在空白樣品中添加100 μg/kg的6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察0.5～4.0 g的無水硫酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉對真菌毒素加標(biāo)回收率的影響，以及100～2 000 mg PSA、C18和無水硫酸鎂對6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響。

1.6.5 線性關(guān)系及檢出限考察 根據(jù)合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南(GB/T 27417—2017)要求選擇豆腐、豆腐乳、小豆、蕓豆、綠豆、菜豆、豌豆、黃豆共8類空白樣本，按樣本前處理方法制備8類樣本空白基質(zhì)溶液，將6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液配置成不同線性范圍的系列空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中，AFTB1、OTA質(zhì)量濃度為1～200 μg/L；15-AcDON、3-AcDON、DON、ZEN的質(zhì)量濃度為10～300 μg/L。對8類空白樣本基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗，以3倍信噪比作為6種真菌毒素的檢出限，3倍檢出限作為定量限。

1.6.6 準(zhǔn)確度考察 取6種真菌毒素貯備液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別對8類豆類及制品空白樣本進(jìn)行低、中、高3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，其中AFTB1、OTA的加標(biāo)量為2 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg；15-AcDON、3-AcDON、DON和ZEN的加標(biāo)量為20 μg/kg、100 μg/kg和400 μg/kg，每個加標(biāo)量均獨立重復(fù)提取3次。

1.6.7 精密度考察 以8種豆類及制品空白樣本為基質(zhì)，對空白樣本進(jìn)行低、中、高加標(biāo)回收試驗(AFTB1、OTA的加標(biāo)量為4 μg/kg、40 μg/kg、200 μg/kg；15-AcDON、3-AcDON、DON和ZEN的加標(biāo)量為40 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg)，每個加標(biāo)量均按前處理操作方法獨立重復(fù)提取7次。

1.6.8 基質(zhì)效應(yīng)考察 樣品基質(zhì)效應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定，即按樣本前處理方法制備8類樣本空白基質(zhì)溶液，以此溶液配制第1組真菌毒素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，同樣以純?nèi)軇?0%乙腈-水溶液配制第2組真菌毒素溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別繪制有機(jī)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和有機(jī)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比(K)評價樣本基質(zhì)效應(yīng)。其中，K為0.9～1.1，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；K大于1.1，受抑制基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)；K小于0.9，則基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件

試驗對甲醇-水、乙腈-水體系進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，真菌毒素在乙腈-水體系下具有更好響應(yīng)強(qiáng)度和色譜分離能力，且基質(zhì)干擾較??；負(fù)離子模式下，真菌毒素在甲醇-水體系下的響應(yīng)強(qiáng)度和色譜峰分離度更好。因此，真菌毒素正離子模式選擇乙腈-水體系，負(fù)離子模式選擇甲醇-水體系。

試驗分別考察甲酸、氨水、甲酸銨和乙酸銨對各真菌毒素的離子化效率(圖1)：正離子模式下，0.05%甲酸水可明顯改善真菌毒素離子化效率和色譜峰峰型，而2 mmol/L的甲酸銨和乙酸銨對6種真菌毒素造成離子干擾，使離子對信號強(qiáng)度降低；在負(fù)離子模式下，0.05%氨水可有效促進(jìn)DON、3-AcDON和15-AcDON的離子化效率并改善峰型，而2 mmol/L的甲酸銨和乙酸銨在一定程度上抑制真菌毒素的離子化強(qiáng)度，使色譜峰展加寬。因此，正離子模式下選擇0.05%甲酸-乙腈作為流動相，負(fù)離子模式下選擇0.05%氨水-甲醇作為流動相。

圖1 6種真菌毒素在正、負(fù)離子模式下的總離子流

2.2 質(zhì)譜條件

分別在ESI+和ESI-模式下對6種真菌毒素的離子對進(jìn)行篩查分析得出：ZEN、DON、3-AcDON、15-AcDON在ESI+模式下離子化效率較差，響應(yīng)值較低，無法產(chǎn)生相應(yīng)的子離子對，其原因可能是4種真菌毒素中含有大量HO-和COOH-等酸性基團(tuán)[15]，在ESI+模式下無法接收質(zhì)子從而形成電離化合物，而在負(fù)離子模式下，4種真菌毒素化合物的離子化效率較好，能顯著形成子離子對。AFTB1和OTA 2種真菌毒素含有CHO-和苯環(huán)等兩性基團(tuán)[16]，在ESI+和ESI-模式下均能電離，但在ESI+模式下電離效果更好。因此，ZEN、DON、3-AcDON和15-AcDON選擇ESI-模式檢測，AFTB1和OTA選擇ESI+模式檢測。

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取試劑 對甲醇、乙腈2種提取體系進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，乙腈比甲醇能易分離豆類樣本中的蛋白質(zhì)和脂肪，由于赭曲霉類毒素等真菌毒素具有羧基基團(tuán)，對酸敏感，一定的有機(jī)提取溶劑酸度可提高其穩(wěn)定性。通過空白樣品加標(biāo)回收試驗(加標(biāo)量100 μg/kg)發(fā)現(xiàn)，隨著甲酸濃度的升高會降低DON、15-AcDON和3-AcDON的提取效率，1%的甲酸-乙腈對6種真菌毒素的整體提取效果較好，其提取效率為76.2%～82.7%。因此，試驗選擇1%甲酸-乙腈作為樣本提取試劑。

2.3.2 提取方式考察 試驗對震蕩、超聲2種提取方式比較發(fā)現(xiàn)，震蕩提取10 min和超聲提取10 min的提取效率相同。試驗還考察常溫離心和冷凍離心對樣本提取效果的影響，由于大部分豆類樣本中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，通過冷凍離心可使蛋白質(zhì)、脂肪凝固分離。因此，選擇提取方式為超聲提取10 min，11 000 r/min離心。

2.3.3 鹽析劑與凈化劑 由圖2可見，3種鹽析劑中隨著無水硫酸鈉、氯化鈉用量的增加，6種真菌毒素的回收率顯著提高；由于真菌毒素的提取需要一定的pH環(huán)境，而檸檬酸鈉具有良好的穩(wěn)定性和pH調(diào)節(jié)能力，進(jìn)一步考察檸檬酸鈉加入量發(fā)現(xiàn)，加入1 g檸檬酸鈉時萃取效果較好。因此，試驗鹽析劑的加入量為4 g無水硫酸鈉、4 g氯化鈉和1 g檸檬酸鈉。

圖2 不同鹽析劑和凈化劑用量下6種真菌毒素的加標(biāo)回收率

當(dāng)無水硫酸鎂的使用量超過600 mg時，給真菌毒素的提取帶來嚴(yán)重干擾并降低回收率；C18粉末可去除豆類樣本中的脂質(zhì)，然而過多的C18用量將吸附保留樣本中的真菌毒素，當(dāng)用量超過200 mg時，加標(biāo)回收率明顯降低；使用PSA可去除豆類樣本基質(zhì)中的脂肪酸，但當(dāng)PSA用量超過400 mg時，會使AFTB1、OTA、DON和15-AcDON的回收率偏低。因此，優(yōu)化得到的凈化劑比例為MgSO4600 mg、PSA 400 mg和C18200 mg。

2.4 線性范圍和檢出限

由表2可見，不同樣本基質(zhì)中6種真菌毒素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)≥0.9990。以化合物定性通道的3倍信噪比(S/N)作為檢出限(LOD)，3倍檢出限作為化合物的定量限(LOQ)，檢出限和定量限分別為0.06～18.4 μg/kg和0.18～55.2 μg/kg，符合要求。

表2 豆類及制品樣本基質(zhì)中6種真菌毒素的線性情況

續(xù)表2

2.5 準(zhǔn)確度及精密度

由表3可見，6種真菌毒素在豆類及制品樣本中的平均回收率范圍為81.5%～119.6%。由表4可見，6種真菌毒素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=7)范圍為0.5%～8.9%。其方法準(zhǔn)確度和精密度均滿足GB/T 27417—2017要求。

表3 豆類及制品樣本基質(zhì)中6種真菌毒素的平均回收率

表4 豆類及制品樣本基質(zhì)中6種真菌毒素的相對偏差

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察顯示，該前處理方法能較好地去除8類豆類及制品樣本基質(zhì)中的次生代謝產(chǎn)物，除DON在8類樣品基質(zhì)中有輕微基質(zhì)抑制效應(yīng)外，其他真菌毒素基質(zhì)效應(yīng)均不明顯，為提高定量準(zhǔn)確性，DON測定可采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2.7 實際樣品檢驗

采用試驗建立的QuEChERS-UPLC-MS/MS法對市售128份豆類及制品樣本進(jìn)行定量分析。其中，AFTB1、DON、3-AcDON分別檢出3份、8份和7份，檢出量分別為0.19～1.2 μg/kg、2.0～2.7 μg/kg和1.5～2.5 μg/kg，AFTB1檢出限低于食品中真菌毒素限量(GB 2761—2017)要求。其余樣品均未檢出真菌毒素。

3 討論

試驗比較不同流動相體系和電離模式下的色譜峰分離度、響應(yīng)強(qiáng)度和基質(zhì)干擾情況，真菌毒AFTB1和OTA含有大量堿性基團(tuán)，在正離子模式下，0.05%甲酸水-乙腈體系可明顯提高其離子化效率；ZEN、DON、3-AcDON和15-AcDON由于電負(fù)性較強(qiáng)，在負(fù)離子模式下，在0.05%氨水-甲醇體系中能更好的釋放質(zhì)子，從而增強(qiáng)其離子化效率，由于6種真菌毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)和所含基團(tuán)不同，在不同的流動相體系下，其離子化效率不同，表現(xiàn)的色譜情況也不盡相同。

通常情況下，取溶劑甲醇對真菌毒素有更好溶解度，但甲醇較好的溶解度也會增加樣本提取基質(zhì)，而乙腈對真菌毒素具有更好的選擇性，尤其是在一定酸度情況下，對酸具有敏感性的真菌毒素能更好的被乙腈溶劑提取，且乙腈有能使蛋白質(zhì)和脂肪凝固分離的特性，而豆類及制品中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪。因此，選擇具有一定酸度的乙腈溶液作為樣本提取溶劑。

QuEChERS試劑包含鹽析劑和凈化劑，使用鹽析劑可提高真菌毒素的萃取效率，常用的鹽析劑有氯化鈉、無水硫酸鈉、硫酸銨和檸檬酸鈉等[17]。試驗的鹽析劑有氯化鈉、無水硫酸鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉顯中性，是鹽析劑產(chǎn)生作用的基礎(chǔ)試劑，無水硫酸鈉具有一定的吸水性，可增加真菌毒素在提取溶劑中的溶解度，而檸檬酸鈉是兩性化合物，一方面能有效增加兩性真菌毒素的溶解度，另一方面可調(diào)節(jié)基質(zhì)溶液的解離常數(shù)。使用凈化劑可去除復(fù)雜樣本中的次生代謝產(chǎn)物，常用的QuEChERS凈化劑有PSA、C18、弗羅里硅土、GCB、無水硫酸鎂和Al-N等[18]，GCB主要用于去除樣本基質(zhì)中的色素，而試驗樣本不含大量色素，且GCB因其具有特殊的平面結(jié)構(gòu)，容易吸附真菌毒素毒素，而中性氧化鋁和弗羅里硅土對真菌毒素的回收率無明顯影響，故選取PSA、C18和無水硫酸鎂作為凈化劑，由于赭曲霉毒素A中含有羧基基團(tuán)，而PSA會極大吸附含羧基基團(tuán)的真菌毒素，從而降低其回收率。因此，在使用PSA時，其使用量不能超過400 mg，以免降低真菌毒素回收率，無水硫酸鎂具有良好的吸水性，且對基質(zhì)的除雜效果比無水硫酸鈉好，但使用無水硫酸鎂時會放出大量的熱，降低真菌毒素在有機(jī)溶劑的溶解度，從而影響試驗提取效率，因此其使用量不宜過多。

4 結(jié)論

試驗對6種真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)和樣本前處理技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了基于QuEChERS前處理技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS測定AFTB1等6種真菌毒素的檢測方法。對6種真菌毒素進(jìn)行低、中、高濃度水平加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)回收率為81.5%～119.6%、精密度(RSD)為0.5%～8.9%；6種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)(r)≥0.999 0；方法檢出限(LOD，S/N=3)和定量限(LOQ)分別為0.06～18.4 μg/kg和0.18～55.2 μg/kg。經(jīng)方法驗證，建立的QuEChERS前處理方法適用于豆類及制品樣本基質(zhì)中多種真菌毒素目標(biāo)化合物的凈化除雜，結(jié)合LC-MS/MS分析，該方法具有適用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、精密度高和分析時間短的特點，完全滿足豆類及制品中真菌毒素的定量分析要求。目前，我國尚未建立專門針對豆類及制品中真菌毒素檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，該方法可為我國豆類及制品樣本檢測提供技術(shù)參考；且目前國家限量標(biāo)準(zhǔn)尚未對3-AcDON和15-AcDON建立限量要求，而2種真菌毒素作為DON的乙?；x產(chǎn)物，與DON污染分布、中毒機(jī)制密切相關(guān)，因而該方法也可用于3-AcDON和15-AcDON的監(jiān)測。