李俊偉，胡瑞萍，陳素文，郭永堅，朱長波，李 婷，頡曉勇，蘇家齊

（1. 中國水產科學研究院南海水產研究所/農業(yè)農村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300； 2. 廣州市海威水產科技有限公司，廣東 廣州 510300）

鹽度是影響水生動物繁殖、發(fā)育和生長的重要環(huán)境因素之一[1-2]。受全球變暖、降雨增加以及潮汐變化等因素影響，海水鹽度出現下降趨勢，尤其是雨季形成的地表徑流會造成潮間帶區(qū)域的海水鹽度急劇下降，進而影響海水中喜鹽生物的生長與繁殖。

星蟲類動物是典型的喜高鹽生物，鹽度是影響其分布的主要環(huán)境因子。星蟲類動物在繁殖和發(fā)育期對低鹽的耐受性極差，其繁殖的正常鹽度介于25～44，因此其在封閉的低鹽環(huán)境中無法正常繁殖和發(fā)育[3-5]。光裸方格星蟲 (Sipunculus nudus) 又稱方格星蟲，為暖水性、世界廣布種，在北部灣沿海灘涂和國內淺海區(qū)域均有分布。由于降雨和地表徑流等因素，潮間帶區(qū)域的方格星蟲易受到鹽度驟變的影響，而滲透調節(jié)是水生動物應對鹽度變化的生存基礎，因此關于鹽度變化對滲透調節(jié)器官影響的研究受到廣泛關注[1]。方格星蟲屬于較低等的無脊椎動物，受滲透壓影響的組織器官主要為體腔液和體壁組織。國內學者曾研究方格星蟲幼蟲對鹽度的耐受性[6-7]，對鹽度驟降情況下方格星蟲成體的生物學結構、免疫能力變化、耐受程度等方面缺乏系統(tǒng)研究。

本研究采用多個鹽度處理組開展方格星蟲養(yǎng)殖試驗，針對其成活率、滲透壓、生物組織結構及免疫酶活性等指標研究方格星蟲在鹽度驟降情況下的綜合反應，以豐富方格星蟲的鹽度變化適應機制，為其增養(yǎng)殖生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及分組

試驗用方格星蟲采自近海灘涂區(qū)域，灘涂底質為細沙質。將方格星蟲暫養(yǎng)于循環(huán)流水槽中，水槽內鋪設細沙，方格星蟲體質量為 (4.24±0.95) g，養(yǎng)殖密度為80條·m?2。暫養(yǎng)期間水體鹽度29.8～30.9，水溫 29～31 ℃，水體溶解氧質量濃度高于 6.0 mg·L?1，養(yǎng)殖10 d后開展鹽度脅迫試驗。

設置6個鹽度處理組 (5、10、15、20、25、30)，分別記為 S5、S10、S15、S20、S25、S30，每個處理組設4個重復。采用天然海水和蒸餾水按照不同比例配制各試驗組的鹽度。試驗用養(yǎng)殖箱為 31 cm×20 cm×17 cm，鋪設相同厚度的細沙(14.5 cm)，粒徑為 0.1～0.2 mm，養(yǎng)殖箱內加入3 L不同鹽度的水，然后將暫養(yǎng)池中的方格星蟲直接轉移到相應的養(yǎng)殖箱中進行急性鹽度脅迫試驗，養(yǎng)殖密度為6條·箱?1。試驗期間不投喂，連續(xù)微孔充氧96 h。在試驗初始時每個處理組取4條方格星蟲作為初始樣品，隨后在試驗開始后第24、第48和第96 小時從養(yǎng)殖箱各取1條進行肌肉和體腔液取樣，用于測定免疫酶活性。

1.2 樣品采集與測定

采集方格星蟲后用吸水紙擦拭并稱質量，使用一次性無菌注射器抽取體腔液，并記錄體腔液體積，樣品采集在冰袋上低溫操作，體腔液于4 ℃靜置 12 h 后，以 3 000 r·min?1進行離心，分裝上清液。分裝好的體腔液上清和肌肉組織均于?80 ℃保存，用于測定免疫酶活性。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定體腔液和體壁肌肉中的蛋白質含量、過氧化氫酶(CAT)、超氧化歧化酶 (SOD) 活性。采用組織滲透壓計 (Vapor pressure osmometer) 測定體腔液的滲透壓。

方格星蟲的體壁組織經過乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟切片、蘇木素-伊紅染色和中性樹脂封片，采用光學顯微鏡 (ZEISS Axio Scope A1型) 進行觀察和記錄圖像，觀察鹽度驟變后方格星蟲的體壁組織結構變化。

1.3 數據分析

采用 SPSS 17.0 和 Excel 2010軟件進行數據統(tǒng)計和分析。不同處理組間的數據差異采用One-way ANOVA進行分析，顯著性為P<0.05。

2 結果

2.1 鹽度驟降對方格星蟲行為和成活率的影響

不同處理組方格星蟲的成活率見圖1。除S20、S25、S30外，其他各組均出現方格星蟲死亡現象。S5、S10、S15這3組的最終成活率均為0，與其他各組差異顯著 (P<0.05)。3個低鹽度組(S5、S10、S15) 的成活率分別在 24、72和 96 h 內達到0。觀察發(fā)現，較高鹽度組 (S20、S25、S30)方格星蟲鉆沙迅速，且在30 min內全部鉆入沙層中，而低鹽度組 (S5、S10) 鉆沙緩慢，分別僅有45.83%、62.50%的方格星蟲完整鉆入沙中。

圖1 不同鹽度處理組在鹽度驟變后方格星蟲的累計成活率Figure 1 Cumulative survival rate of S. nudus of different salnity groups after salinity fluctuation

2.2 鹽度驟降對方格星蟲體質量、體腔液體積和滲透壓的影響

方格星蟲體質量和體腔液質量變化見圖2和圖3。S10、S15、S20處理組方格星蟲的體質量和體腔液體積均在第24小時顯著增加 (P<0.05)，體質量增加幅度較大的S10、S15組方格星蟲先后死亡，增加幅度較小的S20組全部存活；S25和S30組方格星蟲體質量和體腔液質量均未表現出明顯變化。體質量和體腔液體積的線性回歸分析表明，鹽度驟降后，方格星蟲的體腔液體積變化和體質量變化具有較強的相關性 (R2>0.96)。

圖2 各鹽度處理組在不同實驗階段方格星蟲的體質量和體腔液體積變化方柱上不同字母表示處理組間差異顯著 (P<0.05)；后圖同此Figure 2 Variation of body mass and coelomic fluid of S. nudus of different salnity groups at different experimental stagesDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

圖3 方格星蟲體質量與體腔液體積的相關性Figure 3 Linear-regression analysis between body mass and coelomic fluid volume

方格星蟲體腔液滲透壓和體壁肌肉蛋白質含量變化見圖4。隨著鹽度驟降幅度的增加，方格星蟲體腔液滲透壓表現出明顯降低的趨勢。S5、S10、S15、S20和S25組在第24小時分別下降至272、359、471、666和 753 mOsm·L?1，S20和 S25組在第48小時體腔液滲透壓有所回升，但是仍低于初始值，S30組體腔液滲透壓一直保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。S10、S15和S20組在第24小時體壁肌肉蛋白質含量均表現出下降趨勢，但未達到顯著差異 (P>0.05)。在第48小時，S10、S15、S20和S25組體壁肌肉蛋白質含量顯著低于S30組 (P<0.05)。在第72小時，S15、S20和S25組體壁蛋白質含量均升高，與S30組無顯著差異 (P>0.05)。

圖4 各鹽度處理組在不同采樣時間方格星蟲體腔液滲透壓和體壁肌肉蛋白質質量分數變化Figure 4 Variation of osmotic pressure of coelomic fluid and protein mass fraction of S. nudus of different salnity groups at different sampling time

2.3 方格星蟲觸手、體壁的組織結構變化

與S30組相比，S5、S10、S15組方格星蟲體壁縱肌和環(huán)肌結締組織均明顯變細、疏松、染色變淺，體腔膜表層的柱狀上皮細胞染色均變淺，體腔膜與縱肌束基部脫離，空隙明顯變大 (圖5)。S5、S10、S15組觸手表層的柱狀顆粒細胞核變圓，其分布更加分散，觸手內部的血竇體積增加 (圖6)。

圖5 不同鹽度處理組中方格星蟲的體壁結構組織觀察a. 體壁橫切 (10×)；b. S30組體壁 (100×)；c. S15組體壁 (100×)；d. S5組體壁 (100×)；LM. 縱肌束；C. 體腔膜；CM. 橫肌；CC. 角質層；Bgc. 柱狀上皮細胞Figure 5 Light microscopic observation of body tissue of S. nudus in different salnity treatmentsTransverse section of body wall (10×); b. Body wall (100×) in S30; c. Body wall (100×) in S15; d. Body wall (100×) in S5;LM. Longitudinal muscle; C. Coelarium; CM. Circular muscle; CC. Cuticular; Bgc. Columnar cell

圖6 不同鹽度處理組中方格星蟲觸手的觀察a. 觸手 (10×)；b. S30組觸手 (100×)；c. S15組觸手 (100×)；d. S5組觸手 (100×)；M. 肌肉；BS. 血竇；Cgc. 多層柱狀細胞；T. 觸手；Mf. 肌纖維Figure 6 Observation of tentacle of S. nudus in different salnity treatmentsa. Transverse section of tentacle (10×); b. Tentacle (100×) in S30; c. Tentacle (100×) in S15; d. Tentacle (100×) in S5;M. Muscle; Bs. Blood sinus; Cgc. Columnar cell; T. tentacle; Mf. muscle fiber

2.4 方格星蟲體壁和體腔液中的免疫酶活性變化

方格星蟲體壁肌肉SOD活性變化較小，S10、S15、S25組在第24小時有升高趨勢，略高于S30組 (P>0.05)，S20組顯著低于 S10組 (P<0.05)。S10、S15組SOD活性在第48小時均降低，且以上2組方格星蟲分別在72和96 h內死亡。從第48到第96小時，S20、S25組與S30組的SOD活性相近 (圖7-a)。方格星蟲體腔液SOD活性變化較大，S10組在第24小時顯著低于其他處理組 (P<0.05)，而S15、S20組在第48小時也顯著低于S25和S30組 (P<0.05)，S10組方格星蟲在第72小時死亡，S15組方格星蟲體腔液SOD活性在第72小時有所增加，隨后在第96小時死亡。S25組體腔液SOD活性在第72小時增加，隨后恢復到正常水平 (圖 7-b)。

圖7 不同鹽度處理組方格星蟲體壁肌肉 (a) 和體腔液 (b) 超氧化物歧化酶活性變化Figure 7 SOD activity in body wall tissue (a) and coelomic fluid (b) of S. nudus of different salnity groups

方格星蟲體壁肌肉CAT活性變化范圍較大，S10、S20組在第24小時顯著低于其他處理組(P<0.05)，S10、S15、S20組在第48小時顯著高于S30組 (P<0.05)。在第96小時，S20、S25組仍高于 S30組 (圖 8-a)。S10、S15、S20組體腔液中CAT活性均表現出先增加后降低的趨勢，其中S15組CAT活性在第24小時顯著增加 (P<0.05)，而S10、S20組CAT活性在第48小時增加，S25組CAT活性相對穩(wěn)定 (圖8-b)。

圖8 不同鹽度處理組方格星蟲體壁肌肉 (a) 和體腔液 (b) 過氧化氫酶活性變化Figure 8 CAT activity in body wall tissue (a) and coelomic fluid (b) of S. nudus of different salnity groups

3 討論

3.1 低鹽脅迫對方格星蟲體腔液滲透壓的影響

方格星蟲體腔液滲透壓受外界環(huán)境鹽度變化影響較大。以往研究發(fā)現，仿刺參(Apostichopus japonicus) 是等滲動物，其體腔液的滲透壓與外界水環(huán)境滲透壓接近，屬于變壓性生物[8]。本研究發(fā)現，隨著鹽度驟降幅度的增加，S20、S15、S10處理組方格星蟲體腔液體積也顯著增大，并且滲透壓接近養(yǎng)殖水體，表明方格星蟲的體腔液滲透壓隨外界環(huán)境滲透壓變化而改變，可知方格星蟲也屬于等滲變壓動物。

外界環(huán)境滲透壓發(fā)生變化時，動物機體均會作出滲透調節(jié)。高滲或低滲脅迫首先影響體腔液中的含水量和離子含量，進而對細胞產生脅迫損傷，如改變細胞形狀、細胞骨架甚至造成DNA損傷[9-10]。滲透調節(jié)是機體細胞通過調節(jié)水的跨膜流動從而維持細胞結構和功能的能力。鹽度驟降時，外界水進入到體腔內造成各種離子及其他物質濃度下降。鹽度驟降幅度過大時，細胞膜受損，鉀、鈣等離子游離到細胞外，進而影響細胞內的各種代謝活動[11]。研究表明，仿刺參具有一定的滲透調節(jié)能力，可以適應一定的鹽度變化[12]，當鹽度驟降幅度較大時，其體腔液滲透壓降低明顯[13]，生物學結構和生理代謝均受影響，繼而體細胞離子交換和蛋白質合成過程被破壞[14]，最終導致仿刺參排臟甚至死亡。本試驗中，S20、S25處理組滲透壓均表現出先降低后穩(wěn)定的趨勢，且并未出現死亡，表明方格星蟲的機體調節(jié)和細胞自身調節(jié)能夠抵抗鹽度驟降10的變化。S5、S10、S15處理組方格星蟲的滲透壓均降低，并且死亡率先后達到100%，表明方格星蟲的機體和細胞調節(jié)不能夠抵抗鹽度驟降15～25的變化，可知方格星蟲具有一定程度的滲透調節(jié)能力。方格星蟲的滲透調節(jié)能力與仿刺參存在不同之處，仿刺參體腔液中僅有免疫相關細胞，無血細胞[8,15]，在低鹽脅迫時仿刺參排出內臟和體腔液，降低對內臟組織的脅迫，而方格星蟲缺乏排臟反應，并且其體腔液中包含血細胞、白細胞及多種免疫相關細胞和生殖細胞[16]，表明低鹽脅迫對方格星蟲的呼吸及免疫代謝等方面具有更為嚴重的危害。

3.2 低鹽脅迫對方格星蟲體壁結構的影響

本研究發(fā)現低鹽脅迫會影響方格星蟲的肌纖維結構和細胞形態(tài)。方格星蟲和海參類動物均缺乏完善的體表防御屏障，外界低鹽環(huán)境容易造成大量水分進入到體腔內。研究發(fā)現，低鹽脅迫會造成仿刺參體壁組織中膠原纖維間的空隙增加[17]，會引起三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 的鰓絲上皮層變薄甚至破壞、鰓腔增大、血細胞增多[18]，也會導致三疣梭子蟹和凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)肝胰腺的分泌細胞增多，柱狀上皮細胞空泡化明顯[18-19]。本研究發(fā)現，正常鹽度中 (S30) 的方格星蟲體壁縱肌纖維致密，體腔膜與縱肌緊密相連，柱狀上皮細胞體積較小、染色較深，而低鹽處理組(S5、S10、S15) 方格星蟲體質量明顯增加，體壁縱肌纖維腫脹、增生，縱肌束基部連接松散，組織切片染色較淺，縱肌和環(huán)肌纖維均變細、纖維空隙增大。體腔膜表層的柱狀上皮細胞體積增大，細胞核HE染色變淺，表明低鹽環(huán)境對方格星蟲體壁組織結構造成破壞，影響了細胞核、肌纖維等相關組織的正常功能。

低鹽處理 (S5、S10、S15) 也造成方格星蟲觸手表層的柱狀顆粒細胞數量增加，觸手分支變大、增生，觸手肌纖維變細、血竇空隙增加。方格星蟲攝食和鉆沙過程中均需要伸展吻部觸手，利用其固著和黏附能力進行攝食和運動[4]，根據方格星蟲攝食細微顆粒物質的習性分析，其觸手表層柱狀細胞的作用之一可能是分泌某種起到黏附作用物質。低鹽環(huán)境對柱狀細胞的影響導致方格星蟲觸手黏附能力減弱，并且觸手纖維變細也造成運動受限，從而限制了方格星蟲迅速鉆沙的能力。低鹽度組 (S15、S20) 方格星蟲體壁肌肉蛋白質含量在第24和第48小時降低明顯，而在后期采集的方格星蟲體壁蛋白質含量有升高的趨勢，可能與采集的星蟲樣本鉆沙較深、活力較強、體腔液增加較少有一定關系。

3.3 鹽度驟降對方格星蟲體內免疫酶活性的影響

方格星蟲體內的免疫酶活性受到低鹽脅迫的顯著影響。方格星蟲屬于無脊椎動物，缺乏特異性免疫組織和器官。在非特異性免疫生物中，體腔細胞既是細胞免疫的承擔者，又是體液免疫因子的提供者。SOD和CAT可以清除活性氧自由基，SOD首先將·O2?歧化為H2O2和H2O，隨后CAT將H2O2催化為水和氧氣，使得H2O2不會進一步生成氫氧根離子。一般情況下，SOD和CAT活性升高預示著機體內需要清除的自由基含量增加[20]。有研究表明，低鹽脅迫會造成海馬 (Hippocampus kuda)、黃姑魚 (Nibea albiflora)、毛蚶 (Scapharca subcrenata)等體內SOD活性升高[21-23]，也會引起克氏雙鋸魚 (Amphiprion clarkii) 體內 Na+-K+-ATP酶活性升高[24]，而鹽度脅迫會造成無脊椎動物如凡納濱對蝦、仿刺參體內SOD活性降低[25-27]，主要原因可能是鹽度驟降導致仿刺參機體大量吸水，滲透壓變化改變了免疫細胞的相關活性，進而降低了酶的催化效率和酶蛋白的合成[27-28]。本研究發(fā)現低鹽度組體腔液中的SOD活性表現出先降低后升高 (S15、S20) 或先降低然后失活 (S10) 的現象，表明方格星蟲不能耐受鹽度驟降10及以上的低鹽環(huán)境，會由于體內免疫系統(tǒng)紊亂而導致免疫酶活喪失。本研究發(fā)現方格星蟲體壁肌肉中的SOD活性比體腔液中的變化小，表明體腔液中的SOD更易受到低鹽環(huán)境影響。

本研究發(fā)現S10、S15、S20組體壁肌肉中的CAT活性先降低后升高，隨后又降低，而體腔液CAT活性表現出先升高后降低的趨勢，主要原因可能是鹽度驟降幅度大，低鹽水快速進入體腔內，體腔液中的CAT活性迅速增加以清除自由基，但是由于大量低鹽水進入體腔內，最終導致CAT失活。其他研究發(fā)現，低鹽脅迫會造成黃姑魚肝臟CAT活性先降低后升高而后再降低[22]，與本研究中的體壁肌肉CAT變化趨勢相同；低鹽環(huán)境也會造成脊尾白蝦 (Exopalaemon carinicauda)、青蛤(Cyclina sinensis) 產生 1 000～3 000個差異表達基因[29-30]；低鹽脅迫也會造成斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon) 能量代謝相關基因表達量升高，分析其原因可能是斑節(jié)對蝦需要加速能量分解和轉運以適應滲透壓的變化[31]。方格星蟲棲息于沉積物內部，其對鹽度變化的耐受機制可能與其他無脊椎動物有相似之處，其在低鹽脅迫下的基因水平變化仍需進一步研究。

4 結論

方格星蟲屬于等滲變壓動物，可以耐受鹽度驟降10的水體環(huán)境，鹽度驟降超過15將會影響其體壁組織結構，并引起體壁和體腔液中免疫酶的活性變化。因此，在方格星蟲增養(yǎng)殖生產中，為減少環(huán)境應激，提高成活率，應盡量避免鹽度驟降超過10的灘涂區(qū)域。