張學(xué)杰，齊丹華

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

人類使用可食用香辛料對食物進行加工調(diào)味的歷史非常久遠?？茖W(xué)研究表明，許多香辛料除了調(diào)味外，還具有殺菌作用，包括姜、花椒、大蒜、牛至、肉桂、丁香、茴香等[1-8]。已有的大部分研究集中在表征香辛料的最低抑菌濃度，但結(jié)果差別較大，如宋麗雅等[9]發(fā)現(xiàn)花椒提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度為10mg/mL。吳周和等[10]發(fā)現(xiàn)八角的醇提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為12.5、25 mg/mL。MEHDI等[11]評估了檸檬香茅混合精油與牛至混合精油對食源致病菌的殺菌效果，認為兩者在大腸桿菌抑制上效果相近，最低抑菌濃度均為3.4 mg/L左右。也有一部分研究報道了不同香辛料在食源性致病菌上的殺菌效果如抑菌圈大小，結(jié)果亦相差較大，王海燕等[1]研究認為陳皮對食源性致病菌抑菌效果最弱，香果、香葉和沙姜的抑菌作用相當(dāng)。梁穎等[12]研究認為草果的醇提物抗菌效果最好，其次為桂皮、八角的醇提物，茴香、香葉、陳皮的醇提物對大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抗菌效果較差。究其原因，在于影響香辛料殺菌能力的因素較多，如香辛料種類及來源、提取與作用條件、作用對象等，李永梅等[2]報道同一香辛料不同部位的抑菌效果不同，BIN等[13]研究認為革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對食用香料提取物更敏感，其中大腸桿菌抗性最強。眾所周知，E.coli O157：H7是主要人體病原微生物之一，嚴重時會導(dǎo)致急性腎衰竭而造成死亡。目前，國內(nèi)針對E.coli O157：H7的食用香辛料殺菌效果報道較少，尚缺乏常見香辛料對E.coli O157：H7殺菌效果的評估，而香辛料來源的影響亦未見報道。

本研究擬通過開展不同來源的常見食用香辛料包括茴香、八角、花椒、麻椒、芥末、丁香等醇提取物對E.coli O157：H7的殺菌效果的評估，明確具有較強殺菌作用的香辛料的種類及其作用條件，并探討不同來源對香辛料殺菌效果的影響，研究結(jié)果對于香辛料在食品安全保障方面的利用與開發(fā)將有所裨益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八角、丁香、桂皮、茴香、芥末、花椒、麻椒、香葉共21份香辛料：市售，其中1、2、3號茴香分別產(chǎn)自河南、甘肅、河北；4、5、6、7 號八角均產(chǎn)自廣西；8、10 號桂皮產(chǎn)自廣西，9號桂皮產(chǎn)自北京；11、12號丁香分別產(chǎn)自河北、北京；13、14號麻椒產(chǎn)自四川；15、16號花椒分別產(chǎn)自陜西、四川；17號香葉產(chǎn)自廣西，18號香葉產(chǎn)自吉林；19、20號芥末產(chǎn)自廣東，21號芥末產(chǎn)自遼寧。

E.coliO157：H7菌株 GIMCC1.334 和GDMCC1.707：廣東省微生物研究所；E.coli O157：H7菌株CICC 21530：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 （tryptic soy agar，TSA）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京江晨公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、95%乙醇：北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司。

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水試多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DK-98-1水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；HFsafe-1200LC型生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；H1850R高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 E.coli O157：H7母液的制備

采用接種環(huán)，分別挑接E.coliO157：H7菌株GIMCC 1.334、GDMCC1.707和CICC21530于盛有10 mL TSB的無菌離心管中，37℃培養(yǎng)24 h，離心，去掉上清液，加入10mL 0.1% BPW，懸混。將3管菌液轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管混勻，即為E.coli O157：H7母液，濃度約為9 lg（CFU/mL），保藏于 4℃冰箱。使用時，取 1 mL E.coli O157：H7母液，加入到 9 mL BPW 中，混勻，依次稀釋母液得到初始菌量約為 6、5、3 lg（CFU/mL）的工作菌液，待測。

1.3 香辛料提取物的制備

將21份香辛料各取10 g用干磨機磨成粉末狀，然后各取1 g分別置于100 mL錐形瓶中，采用95%乙醇90℃提取3 h，過濾，濾液置于20 mL試管中，將兩次提取液合并至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，減壓蒸干，底物即為香辛料提取物（spice extract，SE）。采用DMSO溶解SE，并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，共得到5 mL提取液，于4℃冰箱中存放。重復(fù)3次。

1.4 試驗設(shè)計與方法

1.4.1 體積分數(shù)為50%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果

21份香辛料提取物各取0.5mL，分別加入到0.5mL約為5 lg（CFU/mL）的工作菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 h。對照組為0.5 mL DMSO處理1 h。每個處理重復(fù)3次，待測。

1.4.2 體積分數(shù)為50%的SE處理1 min對E.coli O157：H7的殺菌效果

根據(jù)1.4.1結(jié)果，分別取殺菌效果較好的香辛料提取物0.5 mL加入到0.5 mL初始菌量約為9lg（CFU/mL）的菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 min。對照組同1.4.1，處理時間1 min。每個處理重復(fù)3次，待測。

1.4.3 體積分數(shù)為9.1%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果

分別取1.4.2中的香辛料提取物0.1 mL加入1 mL初始菌量約為6lg（CFU/mL）的菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 h。對照組為0.1 mL DMSO處理。每個處理重復(fù)3次，待測。

1.4.4 體積分數(shù)為1.0%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果

分別取1.4.2中的香辛料提取物0.01 mL加入0.99 mL初始菌量約為3 lg（CFU/mL）的菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 h。對照組為0.01 mL DMSO處理，每個處理重復(fù)3次，待測。

1.4.5 E.coli O157：H7檢測方法

試驗中的每個處理做不同稀釋梯度，各取0.1 mL涂TSA板，37℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究的試驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計軟件進行方差分析，平均數(shù)之間的多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 體積分數(shù)為50%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分數(shù)為50%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果見圖1。

圖1 體積分數(shù)為50%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.1 Effect of 50% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 h

圖1表明，體積分數(shù)為50%的香辛料提取物處理1 h均表現(xiàn)出一定的殺菌能力，殺菌能力差異顯著（p＜0.05），其中丁香和八角的提取物具有較強的殺菌能力，均能夠殺滅至少 5 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。左勇等以抑菌圈為指標(biāo)研究認為芥末對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等具有明顯的抑菌作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與其它香辛料相比，芥末提取物殺滅E.coli O157：H7的效果不理想，3個不同來源的芥末產(chǎn)品提取物處理1 h平均只能殺滅 2.47 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。李永梅等以抑菌圈為指標(biāo)，研究認為肉桂的抑菌能力最強，花椒籽和花椒殼次之，小茴香的抑菌效果最差[2]。李京晶等采用水蒸氣蒸餾法提取的肉桂揮發(fā)油與其主要成分肉桂醛表現(xiàn)出的抗菌活性比丁香揮發(fā)油及其主要成分丁香酚強[15]。本研究結(jié)果未能予以充分支持，這可能與研究指標(biāo)、方法或原料不同有關(guān)。圖1表明，產(chǎn)地來源不同對某些香辛料的殺菌能力有影響，如茴香、桂皮（p＜0.05）。眾所周知，香辛料的殺菌能力與其殺菌成分及含量有關(guān)[16-19]，香辛料精油中的萜類以及脂肪族、芳香族揮發(fā)性成分是香辛料中主要的抗菌物質(zhì)，如丁香酚、肉桂醛、α-蒎烯等[16]，從本研究結(jié)果來看，產(chǎn)地的影響是存在的，但產(chǎn)地對上述香辛料殺菌成分與含量的影響及成分間的協(xié)同作用等研究甚少，值得深入開展。

2.2 體積分數(shù)為50%的SE處理1 min對E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分數(shù)為50%的SE處理1 min對E.coli O157：H7的殺菌效果見圖2。

圖2 體積分數(shù)為50%的SE處理1 min對E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.2 Effect of 50% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 min

圖2表明，在高濃度菌液情況下，體積分數(shù)為50%的丁香提取物處理1 min可至少殺滅8.8 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，表明丁香提取物具有很強的殺菌能力，這與MOREIRA等的研究一致[20]。謝強等研究了6種食用香辛料提取物對4株食源性致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌）的影響，認為肉桂、香葉和八角抑菌活性最強[21]。本研究中不同產(chǎn)地來源的八角表現(xiàn)出不同的殺菌能力（p＜0.05），其中7號八角提取物殺菌能力最強，體積分數(shù)為50%的7號八角提取物處理1 min可殺滅至少8.8 lg（CFU/mL）E.coliO157：H7，其次為6號八角，可殺滅6.6lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，4號與 5號八角提取物能殺滅約 5.3 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，這顯然與八角中的殺菌成分含量有關(guān)。大部分研究指出茴香腦是賦予八角抑菌能力的主要活性物質(zhì)[22]，但張赟彬等研究顯示八角中的3種單體抑菌成分（大茴香醛、檸檬烯、反式茴香腦），在相同濃度條件下，檸檬烯對大腸桿菌的抑菌作用相對顯著[23]，黃明泉等從廣西6個地區(qū)的八角精油中檢出45種化合物，其中有19種揮發(fā)性成分不同[24]。丁香的殺菌成分主要是丁香酚[15，25]，但丁香中還有其它成分也具有殺菌作用[26]。殺菌成分差異的原因與很多因素有關(guān)，如原料品種、種植地域、栽培措施、采后干燥處理方法等都會對殺菌成分造成影響，因而在香辛料殺菌利用研究及工業(yè)化上需要對上述影響因素予以重視。

2.3 體積分數(shù)為9.1%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分數(shù)為9.1%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果見圖3。

圖3 體積分數(shù)為9.1%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.3 Effect of 9.1% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 h

MOREIRA等比較了常用香精油如迷迭香、藍桉、丁香、牛至、羅勒、歐薄荷等對E.coli O157：H7的殺滅濃度，認為丁香效果最好[20]。由圖3可知，體積分數(shù)為9.1%的丁香與八角提取物處理E.coli O157：H7 1 h后，11號丁香提取物可殺滅至少6 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，其次為12號丁香提取物，可殺滅至少5 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7；而八角提取物平均只能殺滅 2.46 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。盡管丁香提取物的殺菌效果顯著高于八角提取物的殺菌效果（p＜0.05），但體積分數(shù)為9.1%時不同產(chǎn)地來源的丁香提取物在殺菌數(shù)量上未表現(xiàn)出顯著差異（p＞0.05），八角提取物亦是如此。對于八角提取物，相較于50%體積分數(shù)，體積分數(shù)為9.1%的7號八角提取物的殺菌能力下降，顯然是其殺菌成分濃度不足或殺菌成分的協(xié)同作用不足造成的。

2.4 體積分數(shù)為1.0%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分數(shù)為1.0%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果見圖4。

圖4 體積分數(shù)為1.0%的SE處理1 h對E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.4 Effect of 1.0% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 h

圖4表明，體積分數(shù)為1.0%的八角與丁香提取物分別處理E.coliO157：H71h，殺菌效果不明顯（p＞0.05）；同時，不同來源的丁香與八角之間在殺菌效果上均未表現(xiàn)出顯著差異（p>0.05），表明當(dāng)八角及丁香醇提取物體積分數(shù)降至1.0%時，殺菌作用已不明顯。

總的來說，影響香辛料殺菌的因素很多，包括香辛料種類與產(chǎn)地甚至部位、殺菌物質(zhì)的提取與純化方法、作用條件、目標(biāo)菌的屬種等。在研究及應(yīng)用中，需要系統(tǒng)考慮相關(guān)因素的影響，只有這樣才能形成香辛料對目標(biāo)菌殺菌能力的客觀認識，才能充分開發(fā)利用香辛料的殺菌功能為食品安全做出更大的貢獻。

3 結(jié)論

本研究中殺菌效果最好的香辛料為丁香，其次為八角。采用體積分數(shù)為9.1%的丁香提取物處理1 h可殺滅 E.coli O157：H7 5 lg（CFU/mL）以上，如采用體積分數(shù)50%丁香提取物處理，則1min可殺滅E.coliO157：H7 8.8 lg（CFU/mL）以上。芥末提取物殺滅E.coli O157：H7的效果不理想，3個不同芥末產(chǎn)品醇提取物采用50%體積分數(shù)處理1 h平均殺滅2.47 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。產(chǎn)地來源對某些香辛料的殺菌能力有影響，如茴香、桂皮、八角，或是因為成分含量有差異，或是成分間存在協(xié)同作用等，相關(guān)研究工作值得進一步開展。