肖 冉，楊 盟，丁茹夢(mèng)，譚遠(yuǎn)遠(yuǎn)，李朵璐

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,河南 鄭州450052；2.鄭州市第七人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450006)

乳腺癌(breast cancer,BRCA)是女性最多發(fā)的腫瘤之一，是女性死亡的主要原因，其發(fā)病率逐年上升[1-2]。隨著診療水平的提高，BRCA的死亡率顯著降低，但由于BRCA的高異質(zhì)性，手術(shù)和化療仍是其主要的治療手段[3-4]。有研究報(bào)道，BRCA患者的預(yù)后與機(jī)體免疫力有關(guān)[5-7]。因此，有必要尋找與免疫相關(guān)的預(yù)測(cè)因子來(lái)改善BRCA的預(yù)后。長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的主要非編碼RNA類型[8]，其參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤的免疫應(yīng)答，并可導(dǎo)致不良預(yù)后[9]。干擾lncRNA的表達(dá)能夠改變腫瘤的實(shí)際情況，已在多種癌癥類型中得到廣泛認(rèn)可[10]。而免疫相關(guān)lncRNA在乳腺癌預(yù)后中的作用尚不明確，因此，本研究擬探索免疫相關(guān)lncRNA與BRCA患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)中獲得了BRCA的轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)，包含113個(gè)非腫瘤組織和1 039個(gè)BRCA組織。收集并提取了患者的臨床病理數(shù)據(jù)(不包括總生存時(shí)間≤30 d的患者)。數(shù)據(jù)更新于2020年7月11日。

1.2 鑒定免疫相關(guān)的lncRNA結(jié)合ImmLnc數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/ImmLnc)，篩選出BRCA免疫相關(guān)lncRNAs。單因素Cox回歸分析獲得了10個(gè)與免疫相關(guān)的lncRNA的預(yù)后(P<0.05)。根據(jù)AIC確定最優(yōu)的預(yù)測(cè)模型，建立免疫相關(guān)的lncRNAs模型(P<0.05)。計(jì)算每例患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=Exp1×lncRNA1 + Exp2×lncRNA2 +…+ Expi×lncRNAi，其中Expi是樣本中每種免疫相關(guān)lncRNA的相對(duì)表達(dá)量，lncRNAi是多元分析模型的回歸系數(shù)。

1.3 模型評(píng)價(jià)及臨床病理參數(shù)分析根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將BRCA患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析比較2組之間的差異。并構(gòu)建受試者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲線進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的預(yù)測(cè)能力。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者的臨床病理資料，用箱式圖驗(yàn)證該模型中的lncRNA與BRCA患者T分期的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R 3.5.1處理數(shù)據(jù)，用單因素和多因素Cox回歸分析篩選與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA，建立風(fēng)險(xiǎn)模型，并用Kaplan-Meier生存分析和受試者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲線檢驗(yàn)該模型的辨別力,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫相關(guān)lncRNA的獲取從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)得到368個(gè)差異表達(dá)的lncRNA。通過(guò)與ImmLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中BRCA的lncRNA基因集進(jìn)行匹配，選出了128個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA。

2.2 免疫相關(guān)lncRNA對(duì)預(yù)后的影響單因素Cox回歸分析顯示，10個(gè)lncRNA(包括LINC00578、LINC01614、LINC00987、HOXB-AS1、HOXB-AS1、LINC00667、SH3BP5-AS1、MIR4435-2HG、LINC01235和HOTAIR)與BRCA患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。將以上變量(P<0.05)納入多因素Cox回歸分析，最終篩選出3個(gè)lncRNA(即LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667)是BRCA患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，以此建立與BRCA患者免疫相關(guān)lncRNA預(yù)后模型，根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將BRCA患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(模型評(píng)分>1.037 6)和低風(fēng)險(xiǎn)組(模型評(píng)分≤1.037 6)。Kaplan-Meier生存曲線表明，高風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間(P<0.001)。低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的5 a生存率分別為87.8.0%(95%CI：83.6%～92.1%)和76.2%(95%CI：70.7%～82.3%)。ROC曲線分析顯示，曲線下面積為0.706(95%CI：0.676～0.771，P<0.001)，具有良好的BRCA患者預(yù)后的辨別力。見(jiàn)表1、2，圖1、2。

圖1 高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(A)和Kaplan-Meier生存曲線(B)

圖2 該模型預(yù)測(cè)BRCA患者的ROC曲線

表1 BRCA患者預(yù)后相關(guān)免疫相關(guān)lncRNA的單因素Cox回歸分析結(jié)果

2.3 該模型與臨床病理特征的關(guān)系為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型與臨床病理特征的關(guān)系，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載1 039例BRCA患者的臨床病理資料。用箱式圖分析顯示，LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667與T分期關(guān)系密切(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 3個(gè)免疫相關(guān)lncRNA與T分期的關(guān)系

表2 BRCA患者預(yù)后相關(guān)免疫相關(guān)lncRNA的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

BRCA是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其具有基因組和遺傳多樣性的特點(diǎn)[11]。近年來(lái)，針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的程序性死亡受體-1、程序性死亡受體-配體1抑制劑等新興免疫治療方法在腫瘤治療中發(fā)展迅速，并取得了一定的療效[12]。免疫治療在乳腺癌的治療中有廣泛的前景。然而，目前乳腺癌的治療仍有很大的改善空間，晚期BRCA患者的預(yù)后仍不理想。因此，有必要對(duì)BRCA的治療提出新的策略?；谶@些現(xiàn)狀，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取BRCA的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。由于lncRNA在機(jī)體的各種生物過(guò)程中發(fā)揮著廣泛的調(diào)控作用[9,13-14]，因此我們將研究重點(diǎn)放在lncRNA上，試圖找到免疫相關(guān)lncRNA，并建立預(yù)后模型。

由于腫瘤分子特征的復(fù)雜性，多種生物標(biāo)志物能夠提高預(yù)后的準(zhǔn)確性。本研究中，我們使用單因素Cox回歸分析篩選出10個(gè)與BRCA患者預(yù)后相關(guān)的免疫相關(guān)lncRNA。多因素Cox回歸分析鑒定出3個(gè)免疫相關(guān)lncRNA是BRCA患者獨(dú)立的預(yù)后因子，并建立BRCA患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。該模型能夠較好預(yù)測(cè)BRCA患者的預(yù)后。且該模型在評(píng)估患者生存上有一定的優(yōu)勢(shì)。為了檢測(cè)該模型在臨床應(yīng)用中的可行性，我們進(jìn)一步聯(lián)合患者的臨床病理特征，驗(yàn)證了模型中3個(gè)免疫相關(guān)lncRNA與臨床病理特征的關(guān)系。其可能與乳腺癌的惡性發(fā)展有關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00578在乳腺癌T分期晚期的患者中高表達(dá)，而NIFK-AS1和LINC00667的表達(dá)減少。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在這3個(gè)lncRNAs中，LINC00578與乳腺癌的自噬和乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)[15-16]。NIFK-AS1的過(guò)表達(dá)抑制能夠子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[17]。這些研究也進(jìn)一步證實(shí)上述模型在BRCA患者預(yù)后中的價(jià)值。

綜上所述，我們證明了LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667等3個(gè)與免疫相關(guān)的lncRNA作為BRCA患者的預(yù)后模型，為免疫有關(guān)的研究和治療策略提供新的依據(jù)。然而，我們的研究仍有一些不足：首先，該研究是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的一項(xiàng)探索性研究，患者信息更新不及時(shí)、檢測(cè)手段不一等均會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。檢測(cè)本模型的有效性，仍需通過(guò)現(xiàn)實(shí)生活中的臨床病理資料進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，盡管我們闡明了這些lncRNA在BRCA患者中的預(yù)后作用，他們作為免疫相關(guān)預(yù)后標(biāo)志物的潛在機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步的廣泛驗(yàn)證。