張良，陳娜，付昱，鄭亮，肖婧，陳柳青

皮膚鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是源于皮膚組織中角質形成細胞的惡性腫瘤，是全世界范圍內常見的皮膚癌［1］。目前對于不能手術治療的SCC 患者常采用順鉑、5-氟尿嘧啶等化療藥進行治療，但這些藥物會引起糖代謝紊亂等嚴重不良反應［2］。因此，開發(fā)有效、安全的靶向藥物是當前SCC診療領域的熱點和難點。最近一項關于復發(fā)或轉移性頭頸鱗狀細胞癌治療的Ⅱ期臨床試驗研究表明，組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑丙戊酸聯(lián)合順鉑和西妥昔單抗對其有良好的治療效果［3］。但是，不同藥物之間存在藥代動力學差異，使得這種“雞尾酒”療法中的藥物難以共同發(fā)揮各自的最佳療效［4］。因此，將多個藥物拼接成一個單一的藥物分子來治療腫瘤已是當前藥物研發(fā)領域的重點方向［5］。2-（2-氨基-3-甲氧苯基）色酮（PD98059）是絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號轉導通路的阻斷劑，可抑制包括SCC在內的多種腫瘤的生長［6］。目前有關PD98059聯(lián)合其他藥物治療SCC的研究尚少見。本研究將HDAC抑制劑伏立諾他（SAHA）與PD98059偶聯(lián)構建單一結構的綴合物（SAHA-PD9805），并在細胞和動物模型上評價其抗SCC活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級 BALB/c 裸鼠 56 只，4～5 周齡，雌雄各半，體質量18～24 g，平均（21.0±3.4）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（川）2015-030。實驗過程中動物自由攝水、食物，自由光照，溫度25 ℃，相對濕度50%；本研究經武漢市第一醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗細胞 人皮膚鱗癌細胞A431、HSC-5、Colo16、SCC-12 和人正常皮膚細胞TE353.sk 購自中科院上海細胞所，由本實驗室凍存使用。

1.1.3 實驗試劑 PD98059（WXCD00602105）、8-氯-8-氧代辛酸甲酯（385565-1G）、鹽酸羥胺（A46614）購自北京伊諾凱科技有限公司；HDAC試劑盒（K330-100）購自艾美捷科技有限公司。

1.1.4 實驗儀器 XT4 型顯微熔點測定儀（溫度未校正）購自北京市科儀電光儀器廠；BrukerAM-400 Hz 型磁共振儀（CDCl3或DMSO-d6為溶劑，四甲基硅烷為內標）購自瑞士Bruker公司；ELx800型酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 中間體1 的制備 氬氣保護下，將PD98059（1.336 g，5 mmol）、8-氯-8-氧代辛酸甲酯（2.067 g，10 mmol）溶解加入到乙腈（60 mL）中，冰浴下滴加三乙胺（2.8 mL，20 mmol），室溫反應12 h 后，減壓脫去溶劑，粗產物用硅膠柱純化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，V/V），得1.273 g淺黃色固體，產率58.2%；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.05（d，J=8.0 Hz，1H），7.83～7.87（m，1H），7.76（t，J=7.6 Hz，1H），7.67～7.70（m，1H），7.07（d，J=8.0 Hz，1H），6.96（d，J=8.0 Hz，1H），6.71（t，J=8.0 Hz，1H），6.55（s，1H），3.84（s，3H），3.62（s，3H），2.20～2.27（m，4H），1.58～1.68（m，4H），1.27～1.32（m，4H）。

1.2.2 目標綴合物SAHA-PD98059的制備 氬氣保護下，將中間體1（1.224 g，2.8 mmol）溶解加入無水四氫呋喃（10 mL）中，冰浴下加入氫氧化鉀（0.236 g，4.2 mmol）和新配置的羥胺溶液，室溫反應1 h后，減壓脫去溶劑，向殘留物中加入10 mL蒸餾水，用2 mol/L的鹽酸調節(jié)pH=7，加入乙酸乙酯進行萃?。ㄝ腿? 次，每次加入25 mL），有機層用無水Na2SO4干燥，減壓脫去溶劑，粗產物用硅膠柱純化（二氯甲烷∶甲醇=12∶1，V/V），得591 mg淺黃色固體，產率48.1%。新羥胺溶液的制備如下：將鹽酸羥胺（2.919 g，42 mmol）、氫氧化鉀（2.353 g，42 mmol）溶解到25 mL 甲醇中，反應液加熱至40 ℃反應15 min后，析出大量的沉淀，經過濾得到的濾液即為新鮮的羥胺溶液。

1.2.3 HDAC活性抑制測試 使用HDAC熒光檢測試劑盒測試綴合物SAHA-PD98059 對HDAC 活性的抑制作用，以SAHA為陽性對照藥。按照試劑盒操作說明書，在96孔測試板中加入血清白蛋白（BSA）、HDAC 熒光底物、HDAC 酶（HeLa 細胞核提取物）和不同濃度梯度（1×104、1×103、1×102、10、1、0.1、1×10-2nmol/L）的綴合物SAHA-PD98059。將測試板在37 ℃下反應30 min 后，每孔再加入HDAC 緩沖液，于37 ℃下繼續(xù)放置15 min，使用酶標儀在359 nm 和440 nm 波長測定每孔的熒光強度，計算半抑制濃度（IC50）。

1.2.4 分子模擬 從Protein Data Bank（PDB）數據庫中下載HDAC（PDB code：1ZZ1）［7］的結構。通過 ChemBio 3D ultra 14.0 和Autodock 4.2D 中的Ligand 模塊進行小分子結構的預處理。對接軟件使用Autodock 4.2D，利用晶體結構中的配體定義口袋盒子，對接盒子邊長設置為30 ?，使用半經驗自由能進行評價，拉馬克遺傳算法循環(huán)100 次，其余參數保持默認，進行分子對接。對接結果使用PyMOL1.8.6進行繪圖。

1.2.5 細胞培養(yǎng) A431、HSC-5、Colo16、SCC-12和TE353.sk細胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，濕度為95%。細胞生長至對數期進行后續(xù)實驗。

1.2.6 體外抗增殖作用實驗 取對數生長期細胞接種于96孔板中，細胞密度約為8×103個/孔，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL 不同濃度的待測綴合物SAHA-PD98059，并以SAHA和PD98059為陽性對照，而空白組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育3 d，每孔再加入25 μL 5-［3-（羧基甲氧基）苯基］-3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內鹽（MTS）溶液，繼續(xù)孵育4 h，在波長為490 nm處用酶標儀測定每孔光密度（OD）值，計算抑制率（I）=［1-（OD1-OD0）（/OD2-OD0）］×100%。其中OD0為空白孔OD值，OD1為加藥組細胞OD值，OD2為不加藥的對照組細胞OD值。

1.2.7 急性毒性實驗 為探討綴合物SAHA-PD98059 在動物體內的毒性，按照文獻［8］的方法，選取4～5周齡的裸鼠40只，采用隨機數字表法分為5個不同的給藥劑量組，給藥劑量分別為346.4、457.1、603.9、798.0、1 054.4 mg/kg，每組8只，雌雄各半，于灌胃給藥后1 h、5 h、第4天、第5～18天觀察實驗小鼠的存活狀態(tài)，并通過寇氏法［8］計算出綴合物SAHAPD98059的半數致死量（LD50）及LD50的95%可信區(qū)間。

1.2.8 體內抗增殖作用實驗 根據體外抗腫瘤活性實驗結果，選擇A431 細胞構建動物模型，以進一步評價綴合物SAHA-PD98059的體內抗人皮膚鱗癌能力。將A431細胞接種到4～5周齡的BALB/c 裸鼠左側肩部皮下（每只100 μL，5×106細胞），待腫瘤體積大小為80 mm3后，采用隨機數字表法將小鼠分為SAHA-PD98059組、SAHA組、PD98059組和空白對照組，每組4 只，雌雄各半，將綴合物SAHA-PD98059、SAHA和PD98059用聚乙烯蓖麻油∶DMSO∶PBS（1∶1∶8）溶解后進行灌胃給藥。SAHA-PD98059 組、SAHA 組和PD98059組的給藥劑量均為25 mg（/kg·d），其中空白對照組給予等體積的溶劑（聚乙烯蓖麻油∶DMSO∶PBS=1∶1∶8），連續(xù)給藥18 d。每隔2 d 稱量實驗小鼠的體質量，計算小鼠體質量變化率=Mn/M0×100%，其中M0為給藥治療前小鼠的體質量（g），Mn為給藥第n天小鼠的體質量（g）。測量腫瘤長、寬，計算腫瘤體積（V，mm3）=a×b2/2，其中a為腫瘤的最長徑（mm），b為腫瘤的最短徑（mm）。在治療18 d后，取出腫瘤并稱量質量。

1.2.9 HE染色觀察小鼠主要器官的病理學變化 空白對照組和SAHA-PD98059 組小鼠在給藥治療結束后通過頸椎脫臼法將其處死，取下心、腦、肝、脾、腎，用4%多聚甲醛進行固定，然后用石蠟包埋，切片厚度為5 μm。按照HE 試劑盒說明書的操作步驟進行染色，于倒置顯微鏡下對組織形態(tài)進行觀察，掃描拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，不同時點組間比較采用重復測量設計的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 綴合物SAHA-PD98059 的制備與表征 綴合物SAHA-PD98059 按照圖1 路線進行合成。首先，通過親核取代反應制得中間體1，然后用羥胺將中間體1的甲酯轉化成肟酸制得了目標綴合物SAHAPD98059，其結構通過氫質子磁共振波譜進行了確證：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（s，1H），9.41（s，1H），8.70（s，1H），8.06（d，J=8.4 Hz，1H），7.80～7.84（m，1H），7.78（t，J=8.0 Hz，1H），7.48（d，J=8.0 Hz，1H），7.08（d，J=8.0 Hz，1H），7.02（d，J=7.6 Hz，1H），6.68（t，J=8.4 Hz，1H），6.54（s，1H），3.87（s，3H），2.22（t，J=6.8 Hz，2H），1.96（t，J=6.4 Hz，2H），1.48～1.54（m，4H），1.26～1.31（m，4H）。

Fig.1 Synthetic route of conjugate SAHA-PD98059圖1 SAHA-PD98059綴合物的合成路線

2.2 綴合物SAHA-PD98059 對HDAC 的抑制活性 綴合物SAHA-PD98059抑制HDAC的量效曲線見圖2，其IC50為（142.9±1.2）nmol/L。

Fig.2 Dose-response curves of conjugate SAHA-PD98059 against HDAC圖2 綴合物SAHA-PD98059抑制HDAC的量效曲線

2.3 綴合物SAHA-PD98059 與HDAC 相互作用的分子對接 綴合物SAHA-PD98059與SAHA均采用了最佳的結合結構與HDAC 的活性口袋相結合。SAHA 在HDAC 活性口袋中能夠與氨基酸殘基H142、H143和T312形成氫鍵，同時其肟酸基團也均與鋅離子進行了螯合。綴合物SAHA-PD98059 在HDAC 活性口袋中也與氨基酸殘基H142 和T312 形成氫鍵作用，因此綴合物SAHA-PD98059 對HDAC有較強的抑制活性。進一步分析對接結果發(fā)現，盡管綴合物SAHA-PD98059 未與H143 形成氫鍵作用（圖3A），但是與另外一個氨基酸殘基G151 形成了氫鍵（圖3B）。

Fig.3 Docked complexes of SAHA and SAHA-PD98059 bound to HDAC圖3 SAHA和綴合物SAHA-PD98059與HDAC分子對接結果

2.4 綴合物SAHA-PD98059 的體外抗增殖作用結果 與母體化合物PD98059 及SAHA 相比，綴合物 SAHA-PD98059 對皮膚鱗癌細胞 A431、HSC-5、Colo16和SCC-12的抗增殖作用均更強，其中綴合物SAHA-PD98059 對A431 細胞的抗增殖作用最強。此外，綴合物SAHA-PD98059 抑制人正常皮膚細胞TE353.sk 的 IC50＞100 μmol/L，表明其基本無毒性。見表1。

Tab.1 Anti-proliferative activity of conjugate PD98059-SAHA表1 綴合物PD98059-SAHA的抗增殖作用（n=3，）

Tab.1 Anti-proliferative activity of conjugate PD98059-SAHA表1 綴合物PD98059-SAHA的抗增殖作用（n=3，）

＊P＜0.05；a與PD98059組比較，b與SAHA組比較，P＜0.05

組別PD98059組SAHA組PD98059-SAHA組F IC50（μmol/L）A431 11.1±2.0 9.6±1.5 1.7±0.2ab 37.141＊HSC-5 15.7±1.4 10.3±1.2a 6.8±0.7ab 47.823＊Colo16 14.8±1.2 8.1±0.9a 5.3±0.5ab 92.580＊SCC-12 17.5±1.6 11.7±1.2a 9.3±1.2ab 29.799＊TE353.sk＞100＞100＞100-

2.5 綴合物SAHA-PD98059 的急性毒性結果 當給予實驗小鼠346.4 mg/kg 劑量時，在18 d 內全部存活；而當給予大劑量1 054.4 mg/kg時，實驗小鼠全部死亡，見表2。根據不同劑量組的小鼠死亡情況，計算綴合物 PD98059-SAHA 的 LD50為 647.5 mg/kg，其95%的可信區(qū)間為435.1～970.4 mg/kg。

Tab.2 Acute toxicity of conjugate PD98059-SAHA in mice表2 綴合物PD98059-SAHA的急性毒性實驗結果（例）

2.6 體內抗腫瘤活性

2.6.1 體質量變化率 組內比較：PD98059 組給藥6～15 d時體質量變化率高于給藥0、3 d，給藥18 d時體質量變化率高于0～12 d（P＜0.05）；SAHA 組給藥9～15 d時體質量變化率高于給藥0、3 d，給藥18 d時體 質量 變 化 率 高于 0～12 d（P＜0.05）；SAHAPD98059組給藥后不同時點體質量變化率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。組間比較：給藥 18 d 時，SAHA-PD98059 組體質量變化率均低于空白對照組、PD98059組和SAHA組（P＜0.05），其余時點各組間體質量變化率差異均無統(tǒng)計學意義，見表3。

Tab.3 Average weight changes in mice after drug treatment表3 給藥后不同時點各組小鼠體質量變化率的比較 （n=4，%，）

Tab.3 Average weight changes in mice after drug treatment表3 給藥后不同時點各組小鼠體質量變化率的比較 （n=4，%，）

＊P＜0.05；F組間=4.676，P＞0.05；F時間=15.830，P＜0.05；F交互=0.583，P＞0.05；組間比較：a與空白對照組比較，b與PD98059組比較，c與SAHA組比較，P＜0.05；組內比較：A與0 d比較，B與3 d比較，C與6 d比較，D與9 d比較，E與12 d比較，P＜0.05

組別空白對照組PD98059組SAHA組SAHA-PD98059組F 0 d 100.0±3.1 100.0±1.3 100.0±2.9 100.0±3.0 0.480 3 d 101.6±3.1 101.9±1.2 101.9±2.7 102.0±2.2 0.769 6 d 103.0±3.3 103.6±2.1AB 104.6±2.6 104.4±1.8 0.809 9 d 104.3±3.5 104.8±1.6AB 105.6±1.2AB 103.6±2.3 0.898 12 d 104.8±4.0 105.0±1.2AB 105.9±1.1AB 104.1±2.4 0.711 15 d 106.7±3.6A 106.2±1.1AB 107.5±2.1AB 103.6±2.8 0.959 18 d 108.4±3.4AB 108.1±1.2ABCDE 108.9±2.2ABCDE 104.2±2.6abc 3.724＊F 2.702＊14.038＊7.602＊1.728

2.6.2 腫瘤體積 各組小鼠腫瘤體積均隨給藥時間呈基本增大趨勢（P＜0.05）。給藥0、3 d 時，各組腫瘤體積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；給藥6～18 d時，PD98059 組、SAHA 組和 PD98059-SAHA 組腫瘤體積均低于空白對照組，PD98059-SAHA 組腫瘤體積低于PD98059組和SAHA組（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Average tumor volume changes in mice after drug treatment表4 給藥后各組小鼠腫瘤體積的變化 （n=4，mm3，）

Tab.4 Average tumor volume changes in mice after drug treatment表4 給藥后各組小鼠腫瘤體積的變化 （n=4，mm3，）

＊P＜0.05；F組間=98.577，F時間=178.818，F交互=12.476，均P＜0.01；組間比較：a與空白對照組比較，b與PD98059組比較，c與SAHA組比較，P＜0.05；組內比較：A與0 d比較，B與3 d比較，C與6 d比較，D與9 d比較，E與12 d比較，F與15 d比較，P＜0.05

組別空白對照組PD98059組SAHA組PD98059-SAHA組F給藥時間0 d 85.7±4.1 86.2±7.1 86.3±8.9 85.4±7.5 0.010 3 d 160.1±15.8A 155.6±26.9A 152.8±22.8A 137.6±7.9A 0.729 6 d 288.5±38.4AB 205.8±20.4ABa 198.9±19.9ABa 157.9±11.3ABabc 14.923＊9 d 390.6±45.3ABC 294.6±47.3ABCa 282.8±45.9ABCa 180.0±20.4ABabc 13.071＊12 d 608.9±113.5ABCD 382.8±67.6ABCa 367.4±63.9ABCa 200.9±24.9ABCabc 15.220＊15 d 823.9±108.9ABCD 539.4±80.4ABCDEa 515.8±69.5ABCDEa 243.1±33.4ABCDabc 27.828＊18 d 1 000.5±138.7ABCDE 711.3±55.1ABCDEFa 686.9±52.4ABCDEFa 309.1±49.8ABCDEabc 35.077＊F 51.876＊59.623＊64.865＊22.871＊

2.6.3 腫瘤質量 治療18 d 后，空白對照組、SAHA組、PD98059 組和SAHA-PD98059 組小鼠腫瘤質量（mg）分別為 1 259.5±60.9、693.5±12.4、657.1±5.9 和253.8±18.8（n=4，F=78.317，P＜0.05）。其中 SAHA組和PD98059 組低于空白對照組，SAHA-PD98059組較其他3組均低（均P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Tumors in mice after 18 days of drug treatment圖4 治療18 d后小鼠的腫瘤

2.7 HE染色觀察小鼠主要器官的病理學改變 與空白對照組相比，SAHA-PD98059 組心、腦、肝、脾、腎均無明顯病理變化；心臟的心肌細胞結構完整；腦神經細胞結構完整；肝臟的肝細胞結構完整；脾的淋巴細胞結構完整；腎臟中腎單位細胞結構完整，見圖5。

Fig.5 The pathological changes of main organs of A431 tumor-bearing mice observed by HE staining(×400)圖5 HE染色觀察A431荷瘤鼠主要器官病理改變（×400）

3 討論

HDAC 是參與表觀遺傳調控的蛋白酶家族，在染色體的結構修飾和基因表達調控中發(fā)揮重要作用［9-10］。大量研究表明，在 SCC［11］、乳腺癌［12］、肝癌［13］等多種腫瘤組織中均存在HDAC異常高表達的現象，HDAC是腫瘤治療的一個有效靶點。HDAC抑制劑通過阻斷HDAC 的功能，影響基因表達和細胞周期，促進腫瘤細胞分化，誘導腫瘤細胞凋亡；此外，HDAC 抑制劑還能抑制腫瘤血管生成，導致腫瘤營養(yǎng)物質供應不足，從而抑制腫瘤增殖［14］。目前已有多個HDAC 抑制劑被批準用于癌癥治療，例如FK228被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療外周T 細胞淋巴瘤；西本達胺被中國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準用于治療復發(fā)及難治性外周T 細胞淋巴瘤等［7，15-16］。有研究報道，將HDAC 抑制劑與雌激素受體［17］、Janus 激酶［18］、血管內皮細胞生長因子受體［19］等靶向藥物偶聯(lián)制成多靶點抑制劑較單靶點藥物具有更好的抗腫瘤效果。Thakur等［20］將HDAC 與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制劑偶聯(lián)成單一分子后對急性髓細胞性白血病具有良好的療效，且對正常細胞無明顯毒性。

有研究表明，HDAC 抑制劑在與HDAC 蛋白相互作用時，HDAC抑制劑結構中的表面識別區(qū)（Cap）基團僅占據了HDAC 活性口袋的一小部分，若使用一些空間位阻較大基團取代HDAC抑制劑的Cap，可增強其與HDAC 蛋白的相互作用，明顯提高其對HDAC 活性的抑制作用［21］。本研究通過將PD98059引入到HDAC 抑制劑SAHA 上，擬得到對HDAC 和SCC 抑制活性較SAHA 與PD98059 更強的綴合物SAHA-PD98059。有研究顯示，先導化合物SAHA抑制HDAC的IC50為196.0 nmo/L［22］，而本研究結果顯示綴合物SAHA-PD98059 的IC50為（142.9±1.2）nmo/L。通過分子對接研究發(fā)現，SAHA-PD98059 抑制HDAC 的IC50較低的可能原因是其在HDAC 酶活性口袋中形成了一個新氫鍵。這個新氫鍵是與氨基酸殘基G151形成了氫鍵，而該氫鍵作用對配體的抑制活性至關重要［23］。此外，與SAHA的苯環(huán)相比，綴合物SAHA-PD98059 具有更大的帽子結構（PD98059基團），增強了其與HDAC 活性口袋的相互作用，從而提高了其對HDAC活性的抑制作用［24］。體外實驗結果顯示，與母體化合物PD98059及SAHA相比，綴合物SAHA-PD98059對皮膚鱗癌細胞A431、HSC-5、Colo16和SCC-12的抗增殖作用均更強，其中綴合物SAHA-PD98059 對A431 細胞的抗增殖作用最強。此外，綴合物SAHA-PD98059 抑制人正常皮膚細胞TE353.sk 的 IC50＞100 μmol/L，表明其基本無毒性。進一步體內急性毒性及抗腫瘤作用實驗結果顯示，綴合物SAHA-PD98059 對小鼠的LD50高達647.5 mg/kg；在A431荷瘤鼠中，與母體化合物PD98059和SAHA 相比，綴合物SAHA-PD98059 可顯著抑制腫瘤體積以及質量的增長。HE染色亦顯示，綴合物SAHA-PD98059對心、腦、肝、脾、腎等主要器官均無明顯毒性。綜上，綴合物SAHA-PD98059 用于治療SCC 安全有效，且其效果強于單一使用SAHA 或PD98059。