黃延俊，方鉦中，張廷貴，黃華發(fā)*，韓書(shū)磊，葉劍良，藍(lán)洪橋，劉澤春，謝 衛(wèi)

1.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建省廈門(mén)市集美區(qū)濱水路298號(hào) 361021

2.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)翠竹街6號(hào) 450001

3.廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建省廈門(mén)市思明區(qū)思明南路422號(hào) 361005

煙堿結(jié)構(gòu)中包含吡啶和吡咯兩個(gè)含N基團(tuán)，因此在不同pH條件下存在3種形態(tài)：雙質(zhì)子態(tài)、單質(zhì)子態(tài)和游離態(tài)（圖1），解離常數(shù)p Ka1和p Ka2分別為3.12和8.02［1］。通常條件下，煙堿主要以單質(zhì)子態(tài)和游離態(tài)形式存在［2］。煙堿形態(tài)與卷煙煙氣的刺激性顯著相關(guān)［3-4］，游離態(tài)煙堿容易穿透上呼吸道黏膜，產(chǎn)生強(qiáng)烈的生理感受或“擊喉感”［5］；質(zhì)子態(tài)煙堿產(chǎn)生的感受平順，因此普遍認(rèn)為含質(zhì)子態(tài)比例高的煙氣煙堿容易進(jìn)入呼吸道深處，給吸煙者帶來(lái)更強(qiáng)的生理滿足感［6］。隨著JUUL等電子煙產(chǎn)品的流行，為了提供與傳統(tǒng)卷煙相當(dāng)?shù)臒焿A攝入量，電子煙煙液中煙堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)被提高至5%甚至更高［7］；與此同時(shí)添加于煙液中的有機(jī)酸（苯甲酸、乳酸、丙酮酸等）與煙堿生成鹽［8］，可調(diào)控?zé)焿A形態(tài)。

圖1 煙堿的3種形態(tài)（雙質(zhì)子態(tài)、單質(zhì)子態(tài)和游離態(tài)）Fig.1 Nicotine in three forms:diprotonated,monoprotonated and free-base

利用煙堿的不同性質(zhì)均可達(dá)到測(cè)定游離態(tài)煙堿（Free-base nicotine，F(xiàn)BN）的目的，比如通過(guò)測(cè)定煙草制品的pH，再經(jīng)過(guò)Henderson-Hasselbach公式可快速換算FBN的質(zhì)量百分比（αfbn）［9］。此外利用煙堿在水相-有機(jī)相或液相-氣相中的分配，液液萃取法［10-11］或SPME萃取法［12］也可實(shí)現(xiàn)游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的分離，但操作較為繁瑣，且溫度和水分均會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果［13］。文獻(xiàn)［2，14-15］中所使用的1H NMR方法是一種非破壞性手段，其通過(guò)煙堿吡啶環(huán)上Ha～Hd和吡咯環(huán)上甲基He的化學(xué)位移差，可計(jì)算得到αfbn。由于測(cè)試前不經(jīng)過(guò)前處理，1H NMR方法可較為真實(shí)地反映電子煙煙液或煙氣中煙堿的形態(tài)分布。光譜方法較少應(yīng)用于煙堿的表征，主要原因是煙堿分子結(jié)構(gòu)中不帶有生色團(tuán)，難以通過(guò)直接測(cè)量光譜獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)信息。為了更簡(jiǎn)便直觀地表征電子煙液中的FBN，前期工作已應(yīng)用可溶性的指示分子茜素紅S（ARS）開(kāi)展FBN的測(cè)量［16］。由于該方法基于指示分子和煙堿分子中吡咯環(huán)N的親和性，指示分子與有機(jī)酸存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，即指示分子的p Ka需滿足其與煙堿反應(yīng)顯色的需要，又不影響業(yè)已形成的煙堿-有機(jī)酸絡(luò)合反應(yīng)平衡。因此，本研究中選取結(jié)構(gòu)相似但吸電子能力不同的溴甲酚綠（Bromocresol green，BCG，p Ka=4.24）［17］和氯酚紅（Chlorophenol red，CPR，p Ka=6.11）（圖2）［18］，比較了不同顯色分子與煙堿的親和性對(duì)電子煙液FBN測(cè)定結(jié)果的影響，并采用pH法和1H NMR法對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，旨在建立一種快速準(zhǔn)確測(cè)定電子煙液FBN的方法。

圖2 溴甲酚綠（BCG）和氯酚紅（CPR）的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structures of bromocresol green(BCG)and chlorophenol red(CPR)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

16種商品化電子煙液樣品（表1）由福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供，包括裝填式和煙彈式，其中煙彈式經(jīng)過(guò)破拆吸出煙液，有棉芯的取出棉芯后使用針筒擠出煙液。

表1 16種商品化電子煙液樣品信息Tab.1 Information of 16 commercial e-liquid samples

溴甲酚綠（95%）、氯酚紅（95%）、無(wú)水乙醇（HPLC級(jí)）、異丙醇（HPLC級(jí)）、1,2-丙二醇（99.8%）、丙三醇（99%）和DMSO-d6（99.8%D，含TMS內(nèi)標(biāo)，VTMS∶VDMSO=3∶10 000）（北京百靈威科技有限公司）；煙堿（標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心）；煙堿（99.9%，湖北和諾生物工程股份有限公司）；正十七烷（標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁生化科技股份有限公司）；苯甲酸（99.0%）、檸檬酸（98.0%）、乙酸（99.5%）和三乙胺（99.0%）［梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司］；純水（自制，電阻率18.2 MΩ·cm）。

Lambda 35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin Elmer公司）；AVANCE III核磁共振波譜儀（500 MHz，瑞士Bruker公司）；7890A氣相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Excellence T7電位滴定儀（裝配DGi111-SC玻璃pH電極，瑞士Mettler Toledo公司）；ML204電子天平（感量0.000 1 g）（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；NI5CCI-B同軸核磁管（5 mm，美國(guó)Norell公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

煙堿溶液：準(zhǔn)確稱取1.622 3 g煙堿，用無(wú)水乙醇定容至50.0 mL，得到0.2 mol/L煙堿母液；準(zhǔn)確移取2.0 mL煙堿母液，用純水定容至50.0 mL，得到8 mmol/L煙堿溶液。

指示劑（BCG或CPR）溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的指示劑，用純水定容至50.0 mL，得到1 mmol/L指示劑母液；再移取2.0 mL該母液，用純水定容至100.0 mL，得到20μmol/L指示劑測(cè)試溶液。

1.2.2 煙堿滴定

移取2.0 mL指示劑（BCG或CPR）測(cè)試溶液至若干4 mL離心管中，用10.0μL微量進(jìn)樣器注射適量8 mmol/L煙堿溶液，得到系列含0～80μmol/L煙堿的混合溶液。將混合溶液搖勻，靜置2 min后進(jìn)行光譜測(cè)試。測(cè)試條件：光程10 mm，狹縫寬度1 nm，波長(zhǎng)掃描范圍300～700 nm。

1.2.3 Job’s Plot結(jié)合比測(cè)定

分別配制60μmol/L煙堿溶液和60μmol/L指示劑（BCG或CPR）溶液?？刂瓶倽舛葹?0μmol/L，按照摩爾濃度c煙堿∶c指示劑=0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0混合，將溶液搖勻，靜置2 min后進(jìn)行光譜測(cè)試。測(cè)試條件同1.2.2節(jié)。

1.2.4 電子煙液游離煙堿的光譜測(cè)定

稱取約100 mg電子煙液，用1.0 mL無(wú)水乙醇溶解，移取5.0μL該溶液至2.0 mL指示劑測(cè)試溶液（20μmol/L）中，將溶液搖勻，靜置2 min后進(jìn)行光譜測(cè)試。測(cè)試條件同1.2.2節(jié)。

1.2.5 煙液中αfbn的核磁共振法測(cè)定

配制煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g的溶液（溶劑：m甘油∶m丙二醇=4∶6）。取適量該溶液，加入等倍于煙堿摩爾數(shù)的三乙胺，得到游離煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液；另取適量該溶液，加入5倍于煙堿摩爾數(shù)的冰醋酸，得到單質(zhì)子態(tài)煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用同軸核磁管制備樣品，外管中加入適量DMSO-d6作為鎖場(chǎng)溶劑，內(nèi)管中加入適量電子煙液（或游離煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液、單質(zhì)子煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液），進(jìn)行1H NMR測(cè)試。

1.2.6 煙液pH的測(cè)定

使用pH 4.00鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液、pH 7.00磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液和pH 10.00碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液進(jìn)行校正。將500 mg電子煙液溶解于5 mL去離子水中，取15 min內(nèi)3次pH測(cè)量結(jié)果的平均值。

1.2.7 煙液煙堿總量的測(cè)定

稱取約200 mg電子煙液，溶解于50 mL異丙醇（含正十七烷內(nèi)標(biāo)），溶液搖勻后直接進(jìn)行氣相色譜測(cè)試。色譜條件：

色譜柱：J&W DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：2.0μL；分流比：30∶1；載氣：He，流速1.4 mL/min；升溫程序：檢測(cè)器：250℃。

使用煙堿的異丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（含正十七烷內(nèi)標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算電子煙液煙堿的總量。

2 結(jié)果與討論

2.1 溴甲酚綠和氯酚紅的光譜性質(zhì)

BCG在水溶液中呈現(xiàn)透明的淡綠色，隨煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，溶液發(fā)生由淡綠色-藍(lán)綠色-藍(lán)色的轉(zhuǎn)變，與之對(duì)應(yīng)的光譜（圖3a）中，442 nm處的吸光度逐漸降低，616 nm處的吸光度逐漸升高。CPR在水溶液中呈現(xiàn)透明的淡黃色，隨煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，溶液呈現(xiàn)由淡黃色-橙紅色-玫紅色的轉(zhuǎn)變，與之對(duì)應(yīng)的光譜（圖3b）中，439 nm處的吸光度逐漸降低，587 nm處的吸光度逐漸升高，最大吸收波長(zhǎng)逐漸向短波長(zhǎng)移動(dòng)至577 nm。顏色的改變說(shuō)明BCG和CPR分子與煙堿發(fā)生反應(yīng)，脫質(zhì)子而呈現(xiàn)離子態(tài)的顏色。

圖3 添加不同濃度煙堿的BCG溶液（a，50μmol/L）和CPR溶液（b，50μmol/L）的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.3 UV-vis spectra of BCG(a,50μmol/L)solution and CPR(b,50μmol/L)solution in presence of nicotine

固定BCG和煙堿總濃度為60μmol/L，按照不同BCG-煙堿摩爾濃度比例配制溶液，并繪制吸收光譜。取光譜中616 nm（BCG）或587 nm（CPR）的吸光度與摩爾濃度比作圖（Job’s Plot圖，圖4）并考察結(jié)合比。結(jié)果表明，當(dāng)c煙堿∶cBCG=1.5～2.3（6∶4～7∶3）時(shí)，616 nm處的吸光度最強(qiáng)，可認(rèn)為BCG與煙堿的結(jié)合比為1∶2；同理，當(dāng)c煙堿∶cCPR=1.5～2.3時(shí)，587 nm處的吸光度最強(qiáng)，可認(rèn)為CPR與煙堿的結(jié)合比為1∶2。

向BCG和煙堿的混合溶液中添加0.5倍于BCG摩爾數(shù)的苯甲酸或檸檬酸，兩種有機(jī)酸均可使溶液顏色改變，且檸檬酸的作用更加明顯（圖5）。CPR呈現(xiàn)與BCG類(lèi)似的光譜變化，說(shuō)明由于有機(jī)酸的酸性高于兩個(gè)指示劑，能夠競(jìng)爭(zhēng)與煙堿分子中吡咯環(huán)N的作用位點(diǎn)，從而使顯色分子回到其分子形態(tài)。

圖5 添加或不添加苯甲酸或檸檬酸（10μmol/L）的BCG-煙堿混合溶液（a,20μmol/L+30μmol/L）和CP R-煙堿混合溶液（b,20μmol/L+30μmol/L）的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.5 UV-vis spectra of BCG-nicotine(a,20μmol/L+30μmol/L)mixture solution and CPR-nicotine(b,20μmol/L+30 μmol/L)mixture solution in absence and presence of benzoic acid(10μmol/L)or citric acid(10μmol/L)

弱酸性的顯色分子能夠與煙堿反應(yīng)脫質(zhì)子變色。但是當(dāng)有機(jī)酸共存于體系中時(shí)，由于有機(jī)酸較高的親和性，其優(yōu)先與煙堿反應(yīng)形成離子對(duì)，因此顯色分子只能與未結(jié)合的煙堿即游離煙堿反應(yīng)顯色，從而指示共存體系中游離煙堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（圖6）。

圖6 有機(jī)酸共存體系中BCG與煙堿的作用機(jī)理Fig.6 Proposed interaction mechanism of BCG and nicotine in absence and presence of organic acid

2.2 定量方法的建立

根據(jù)以上原理在20μmol/L BCG溶液中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的煙堿并繪制光譜圖，以616 nm處的吸光度建立了BCG測(cè)試FBN的工作曲線：lg A616=0.017 2c-0.537 8，r2=0.998 9（圖7）。其中A616為BCG溶液在616 nm的吸光度，c為電子煙液中FBN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位mg/g。稱量約100 mg電子煙液，用1.0 mL無(wú)水乙醇溶解，再移取5μL注射于2.0 mL 20μmol/L的BCG溶液中，混勻后測(cè)試光譜。將最低煙堿濃度的溶液重復(fù)測(cè)試11次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別以3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差得到方法的檢出限（LOD，0.11 mg/g煙液）和定量限（LOQ，0.37 mg/g煙液），可測(cè)量電子煙液FBN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.37～23.36 mg/g。采用相同方法建立了CPR測(cè)試FBN的工作曲線：lg A587=0.015 4c-0.813 0，r2=0.993 6，其中A587為CPR溶液在587 nm的吸光度。LOD和LOQ分別為0.19和0.63 mg/g煙液，可測(cè)量電子煙液FBN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.63～23.36 mg/g。

圖7 BCG溶液（20μmol/L）和CPR溶液（20μmol/L）用于測(cè)試電子煙液FBN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.7 Calibration curves for determination of FBN in e-liquids using BCG(20μmol/L)solution and CPR(20μmol/L)solution

2.3 商品化電子煙液的測(cè)試

分別測(cè)定16個(gè)商品化電子煙煙液煙堿總量和煙液pH。運(yùn)用以上建立的工作曲線，使用BCG和CPR分別測(cè)定了電子煙液FBN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。不同方法所獲得的FBN質(zhì)量分?jǐn)?shù)及αfbn如表2所示。煙液煙堿＜20 mg/g時(shí)，pH法測(cè)得的αfbn平均值為65.8%，光譜法測(cè)得的αfbn平均值為76.1%；煙液煙堿＞20 mg/g時(shí)，pH法測(cè)得的αfbn平均值為10.7%，光譜法測(cè)得的αfbn平均值為19.2%。這說(shuō)明電子煙液廠商在提供較高煙堿攝入量時(shí)采用了低游離煙堿的策略以降低生理沖擊感。

表2 16個(gè)商品化電子煙液游離煙堿（FBN）質(zhì)量分?jǐn)?shù)和游離煙堿質(zhì)量百分比（αfbn）Tab.2 Mass fractions of free-base nicotine（FBN）and proportions of FBN(αfbn)in 16 commercial e-liquid samples

總體而言，pH方法測(cè)試的結(jié)果與光譜方法存在一定的偏離，特別是游離態(tài)煙堿比例較低時(shí)，pH換算所得αfbn明顯低于光譜方法（表2和圖8），可能是由于pH測(cè)試前用水稀釋煙液。煙液溶劑多為甘油和丙二醇，用電極進(jìn)行pH測(cè)試時(shí)溶劑組成的不確定容易帶來(lái)測(cè)試結(jié)果的誤差［19］。采用本研究中所建立的光譜方法測(cè)試時(shí)，將電子煙液濃度稀釋為原來(lái)的1/4 000，可保證溶劑體系的一致性。由圖8還可知，使用BCG所獲得的αfbn值高于CPR，可能是由于BCG（p Ka=4.24）的吸電子能力高于CPR（p Ka=6.11），BCG與有機(jī)酸的競(jìng)爭(zhēng)能力更強(qiáng)，因此在低αfbn時(shí)BCG所能結(jié)合的煙堿多于CPR。

圖8 不同測(cè)試方法所獲得的電子煙液游離煙堿質(zhì)量百分比（αfbn）Fig.8 Proportions of free-base nicotine(αfbn)in e-liquid samples obtained by p H method and by spectroscopic methods

2.4 測(cè)試結(jié)果的驗(yàn)證

按照Duell等［14］的方法，將煙堿-三乙胺（1∶1，摩爾比）溶于甘油-丙二醇（m甘油∶m丙二醇=4∶6）中制得游離煙堿標(biāo)準(zhǔn)煙液，將煙堿-冰醋酸（1∶5，摩爾比）溶于甘油-丙二醇（m甘油∶m丙二醇=4∶6）中制得單質(zhì)子態(tài)煙堿標(biāo)準(zhǔn)煙液。利用1H NMR譜圖，通過(guò)煙堿吡啶環(huán)Ha～Hd的化學(xué)位移δHa～δHd和吡咯環(huán)甲基He的化學(xué)位移δHe［21］，換算得到電子煙液的αfbn，如表3所示。光譜法測(cè)得6個(gè)電子煙液的αfbn與1H NMR方法具有較好的相關(guān)性（圖9），其中使用CPR的測(cè)定值與1H NMR法的R2=0.985 5，優(yōu)于使用BCG的測(cè)定值（R2=0.961 4）。由于1H NMR測(cè)定過(guò)程不涉及煙液樣品的前處理，保留了煙堿在電子煙液中的形態(tài)分布信息，因此使用CPR進(jìn)行αfbn的光譜測(cè)定，可更真實(shí)地反映電子煙液中煙堿的游離狀態(tài)。

表3 標(biāo)準(zhǔn)煙液和商品化電子煙液中煙堿化學(xué)位移（δ）和游離煙堿質(zhì)量百分比（αfbn）①Tab.3 Chemical shifts(δ)and proportions of free-base nicotine(αfbn)in standard and commercial e-liquid samples

圖9 光譜方法和NMR方法測(cè)定的游離煙堿質(zhì)量百分比（αfbn）比較Fig.9 Proportions of free-base nicotine(αfbn)determined by UV-vis method and by 1H NMR method

3 結(jié)論

①指示分子溴甲酚綠（BCG）和氯酚紅（CPR）與游離煙堿發(fā)生顯色反應(yīng)，不與質(zhì)子態(tài)煙堿反應(yīng)，因此能夠建立光譜信號(hào)與游離煙堿的定量關(guān)系。②16個(gè)商品化電子煙液煙堿大于20 mg/g時(shí)，αfbn平均值為19.2%；煙液煙堿小于20 mg/g時(shí)，αfbn平均值為76.1%。③煙液中游離煙堿質(zhì)量百分比（αfbn）較低時(shí)，光譜方法測(cè)定結(jié)果與pH方法存在較大差異，且BCG測(cè)得的αfbn高于CPR。④用1H NMR法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，CPR的測(cè)定結(jié)果與1H NMR法具有較好的相關(guān)性，可更真實(shí)地反映電子煙液中煙堿的游離狀態(tài)。