葉長(zhǎng)文，李 璐，賀 琛，李 棟，陳連芳，范 黎，陳 宸，魏雪團(tuán)*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢市洪山區(qū)獅子山街1號(hào) 430070

雪茄煙是一種傳統(tǒng)的煙草制品，通常以晾曬煙葉為原料，經(jīng)多次發(fā)酵達(dá)到雪茄煙特殊的吸食品質(zhì)。在發(fā)酵過(guò)程中微生物起著至關(guān)重要的作用［1-2］。李寧等［3］、杜佳等［4］采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒別法，分別對(duì)雪茄煙葉葉面和茄衣發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌為主要微生物，真菌含量較少，其中芽胞桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。由于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)本身的局限，即使選擇多種培養(yǎng)基和分離條件，也僅能從樣品中分離出少量?jī)?yōu)勢(shì)菌群，不能全面反映其微生物群落的真實(shí)組成［5-8］。近年來(lái)，基于細(xì)菌16SrRNA基因及真菌rRNA基因間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域的高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛用于微生物多樣性分析。該方法不僅省去了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的繁瑣過(guò)程，并且為大量未培養(yǎng)微生物的研究提供了有效手段，促使煙草微生物多樣性和優(yōu)勢(shì)菌群研究取得了新進(jìn)展［5-11］。張鴿等［8］采用高通量測(cè)序和傳統(tǒng)分離2種方法對(duì)比分析雪茄煙茄衣原料表面細(xì)菌的多樣性及不同發(fā)酵時(shí)期的演替，證實(shí)了高通量測(cè)序法可更全面揭示微生物的多樣性和演替規(guī)律。

由于雪茄煙葉原料、發(fā)酵工藝和生產(chǎn)環(huán)境等因素不同，各地區(qū)生產(chǎn)的雪茄煙中微生物種類組成可能存在較大差異。微生物群落的差異可能影響雪茄煙的發(fā)酵過(guò)程，進(jìn)而影響雪茄煙產(chǎn)品品質(zhì)。目前，基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析不同雪茄煙成品微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究尚未見報(bào)道。因此，通過(guò)高通量測(cè)序分析技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，對(duì)比分析國(guó)內(nèi)外雪茄煙的微生物群落多樣性，旨在更加準(zhǔn)確、全面地掌握其菌群結(jié)構(gòu)，明確優(yōu)勢(shì)菌群，為提高雪茄煙產(chǎn)品質(zhì)量和吸食品質(zhì)，并為后續(xù)雪茄煙生產(chǎn)工藝的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

10個(gè)雪茄煙樣品均從市場(chǎng)直接購(gòu)買，其中1#～7#樣品為國(guó)產(chǎn)雪茄煙，8#～10#樣品為進(jìn)口雪茄煙，樣品編號(hào)、產(chǎn)地國(guó)、煙支規(guī)格、茄芯形態(tài)和卷制工藝等具體信息見表1，涵蓋了國(guó)內(nèi)4個(gè)雪茄煙廠及國(guó)外主流品牌的產(chǎn)品，卷制工藝包括手工卷制、半機(jī)制和機(jī)制等3種方式。

表1 10個(gè)雪茄煙樣品信息表Tab.1 Information of 10 cigar samples

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

使用無(wú)菌剪刀將雪茄煙樣品剪碎，根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit（美國(guó)Omega Bio-tek公司）說(shuō)明書對(duì)樣品中微生物總DNA進(jìn)行抽提，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的DNA提取液于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL，各樣品做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

選用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（美國(guó)New England Biolabs公司）和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增區(qū)域、所用引物及序列信息見表2。

表2 PCR擴(kuò)增區(qū)域、所用引物及其序列信息表Tab.2 Information of PCR amplification regions,primers and sequences

1.2.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

使用2%濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果將PCR產(chǎn)物調(diào)節(jié)為相同濃度，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，再用GeneJET膠（美國(guó)Thermofisher Scientific公司）剪切回收目標(biāo)條帶。

1.2.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒（美國(guó)Thermofisher Scientific公司）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Thermofisher Scientific公司）進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt軟件（V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先對(duì)原始序列（Reads）進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，再根據(jù)Barcode從得到的Reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)（Raw reads）。經(jīng)過(guò)以上處理后得到的Reads需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Reads序列通過(guò)UCHIME Algorithm與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean reads）。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic unit,OTU）聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋。通過(guò)對(duì)OTU進(jìn)行豐度、α多樣性以及物種在各個(gè)分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成，并分別利用Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Coverage指數(shù)公式計(jì)算細(xì)菌生態(tài)多樣性指數(shù)；利用Excel 2013做柱形圖；利用HemI（Heatmap Illustrator,version 1.0）做熱圖；利用SPSS 17.0做統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S r RNA和ITS序列豐度分析

對(duì)10個(gè)雪茄煙樣品中的微生物進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序，分別得到2 085 050條和2 354 038條高質(zhì)量的16S rRNA序列和ITS序列（Clean Reads），平均每個(gè)樣品分別高達(dá)69 502條和78 468條，所得的ITS序列數(shù)目稍高于16S rRNA。通過(guò)繪制稀釋曲線發(fā)現(xiàn)，10個(gè)樣品的稀釋曲線在97%相似性水平下已趨于平坦，雖未達(dá)到完全飽和，但可涵蓋樣品中絕大多數(shù)微生物物種，基本能反映所測(cè)雪茄煙樣品的細(xì)菌和真菌微生物群落組成。

2.2 α多樣性分析

在97%分類水平上，雪茄煙樣品微生物的α多樣性指數(shù)如表3所示。所有樣品微生物Coverage指數(shù)均大于0.99，說(shuō)明樣品文庫(kù)中序列基本上都被測(cè)出，即樣品測(cè)序結(jié)果可反映樣品的真實(shí)情況。

從表3中10個(gè)樣品的細(xì)菌和真菌多樣性分析結(jié)果可見，不同樣品細(xì)菌和真菌的多樣性存在較大差異。對(duì)于細(xì)菌的α多樣性，CCSS樣品中的微生物Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在所有的雪茄煙樣品的微生物中均為最低，且OTU數(shù)量也最少，表明CCSS樣品中的細(xì)菌物種最少，物種豐富度最低。而HNL9樣品中的微生物Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)與OTU數(shù)量均是最高的，Shannon指數(shù)也較高，說(shuō)明HNL9樣品中的細(xì)菌群落多樣性最為豐富。

表3 雪茄煙樣品中細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)及檢測(cè)的OTU數(shù)量Tab.3 Index of bacterial and fungal diversities in cigar samples and number of OTUs detected

對(duì)于真菌的α多樣性，由表3可知，HNL9樣品的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和OTU數(shù)量在所有雪茄煙樣品的微生物中均為最低，說(shuō)明HNL9樣品中真菌群落多樣性和豐富度是最低的，而細(xì)菌群落多樣性結(jié)果在10個(gè)樣品中則是最高的。此外，在10個(gè)雪茄煙樣品的微生物中，WG樣品中的微生物Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)均為最高，表明WG樣品的真菌群落多樣性和豐富度最高，其OTU數(shù)量也印證了該結(jié)論。TS樣品的Chao1指數(shù)為517.32，在所有的雪茄煙樣品的微生物中是最高的，其OTU數(shù)量達(dá)到433個(gè)，僅次于WG樣品，說(shuō)明TS樣品的真菌群落多樣性也較為豐富。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)10個(gè)雪茄煙樣品中微生物的細(xì)菌群落組成進(jìn)行了分析，共檢出36個(gè)細(xì)菌門和360個(gè)細(xì)菌屬。表4列舉了10個(gè)雪茄煙樣品中的細(xì)菌在各分類水平的種類數(shù)目，其中HNL9樣品中的細(xì)菌在各分類水平的種類數(shù)量均為最高，這也印證了16SrRNA序列豐度分析和α多樣性分析結(jié)果。

表4 雪茄煙樣品中細(xì)菌在各分類水平的種類數(shù)量Tab.4 Number of species of each bacterial classification in cigar samples （個(gè)）

10個(gè)樣品細(xì)菌群落在門分類水平上的分布見圖1。10個(gè)樣品中平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門有4個(gè)，分別為厚壁菌門（Firmicutes，6.86%～67.42%），變 形 菌 門（Proteobacteria，3.39%～61.25%），放 線 菌 門（Actinobacteria，2.52%～34.20%）和 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes，0.17%～4.04%）。其中，厚壁菌門在TS，GXB，MT和DWDF樣品中的相對(duì)豐度均大于50%，變形菌門在JJ樣品中的相對(duì)豐度也超過(guò)了50%。在門水平上將各樣品的微生物組成進(jìn)行對(duì)比分析，平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門類中各樣品間的微生物組成相同，但各門類間的相對(duì)豐度具有一定的差異，其中3個(gè)國(guó)外雪茄煙中厚壁菌門細(xì)菌豐度明顯高7個(gè)國(guó)產(chǎn)雪茄煙。

圖1 雪茄煙樣品中主要細(xì)菌門的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundances of major bacterial phyla in cigar samples

在屬分類水平下，圖2列舉了10個(gè)樣品平均相對(duì)豐度前20的細(xì)菌屬，其中平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬有7個(gè)，分別是葡萄球菌屬（Staphylococcus，1.12%～57.68%），不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，0.28%～39.32%），假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas，0.62%～18.20%），氣 球 菌 屬（Aerococcus，0.16%～19.57%），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，0.31%～12.19%），芽 胞 桿 菌 屬（Bacillus，0.11%～6.07%）和 四 聯(lián) 球 菌 屬（Tetragenococcus，0.03%～4.63%）。由圖2可知，不同樣品細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)存在較大差異。葡萄球菌屬在TS、GXB、MT和DWDF樣品中相對(duì)豐度均超過(guò)50%，而不動(dòng)桿菌屬在JJ樣品中的相對(duì)豐度達(dá)到39.24%，假單胞菌屬在CCMZ樣品中相對(duì)豐度達(dá)到18.20%。可見葡萄球菌屬?gòu)V泛存在于10個(gè)雪茄煙樣品中，并在大部分樣品中占有較大的相對(duì)豐度比重，屬于雪茄煙樣品中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬也存在于各個(gè)樣品中，且在個(gè)別樣品中相對(duì)豐度占比較大，也屬于雪茄煙樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。在屬水平上將各樣品的細(xì)菌微生物組成進(jìn)行對(duì)比分析，7個(gè)國(guó)產(chǎn)雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度差異較大，而3個(gè)進(jìn)口雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度差異較小，其中3個(gè)國(guó)外雪茄煙中葡萄球菌屬細(xì)菌豐度明顯高于除TS外的6個(gè)國(guó)產(chǎn)雪茄煙。

圖2 雪茄煙樣品中主要細(xì)菌屬的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundances of major bacterial genera in cigar samples

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)10個(gè)雪茄煙樣品中微生物的真菌群落組成進(jìn)行了鑒定，共檢出7個(gè)真菌門和49個(gè)真菌屬。表5列舉了樣品中真菌在各分類水平的種類。與雪茄煙樣品中細(xì)菌在各分類水平上的種類相比，真菌的種類數(shù)量均顯著低于細(xì)菌。

表5 雪茄煙樣品中細(xì)菌在各分類水平的種類數(shù)量Tab.5 Number of species of each fungal classification in cigar samples （個(gè)）

10個(gè)樣品中真菌群落在門分類水平上主要有子 囊 菌 門 （Ascomycota） 和 擔(dān) 子 菌 門（Basidiomycota），平均相對(duì)豐度大于1%的真菌門僅有子囊菌門（1.6%～10.9%），圖3表明該菌門在10個(gè)樣品中均為優(yōu)勢(shì)菌門，這與調(diào)制期煙葉［10］和自然醇化片煙［11］中優(yōu)勢(shì)真菌門結(jié)果一致。擔(dān)子菌門僅在WG樣品中的相對(duì)豐度大于1%，而其他的真菌門相對(duì)豐度均不足1%。3種進(jìn)口雪茄煙樣品優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度差異較小，而7種國(guó)產(chǎn)雪茄煙樣品的優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度差異較大，其中WG，SBL和TS樣品中擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度明顯高于其他樣品。

圖3 雪茄煙樣品中主要真菌門的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundances of major fungal phyla in cigar samples

在屬分類水平，真菌屬共檢出49個(gè)，遠(yuǎn)低于檢出的細(xì)菌屬種類。圖4列舉了10個(gè)樣品平均相對(duì)豐度前20的屬，其中平均相對(duì)豐度大于1%的真菌屬有2個(gè)，分別為曲霉屬（Aspergillus，1.36%～10.49%）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia，0.1%～1.36%）。其中曲霉屬在雪茄煙微生物中屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，這與陳善義等［11］采用高通量測(cè)序技術(shù)分析12份自然醇化片煙樣品的真菌優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)果、以及邱立友等［12］利用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法研究自然醇化片煙微生物區(qū)系結(jié)果較為一致。

圖4 雪茄煙樣品中主要真菌屬的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundances of major fungal genera in cigar samples

在屬水平上將各樣品中真菌組成進(jìn)行分析，3個(gè)進(jìn)口雪茄煙樣品的曲霉屬的相對(duì)豐度差異較小，而7個(gè)國(guó)產(chǎn)雪茄煙樣品的曲霉屬的相對(duì)豐度差異較大，其中CCMZ、CCSS、HNL9和JJ樣品中曲霉屬所占比例較高且與進(jìn)口雪茄煙相對(duì)豐度相近。WG，SBL和TS樣品中節(jié)擔(dān)菌屬的相對(duì)豐度明顯高于其他樣品，三者均為國(guó)產(chǎn)雪茄煙產(chǎn)品，其中WG和SBL樣品為國(guó)內(nèi)半機(jī)制雪茄煙。

2.5 樣品間聚類分析

根據(jù)物種或樣品間豐度的相似性進(jìn)行聚類分析，并將細(xì)菌和真菌群落結(jié)果呈現(xiàn)在群落結(jié)構(gòu)熱圖上（圖5和圖6），可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色變化與相似程度可反映不同樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。顏色越紅表示菌屬在樣品中的相對(duì)豐度越高，顏色越藍(lán)表示菌屬在樣品中的相對(duì)豐度越低。從圖5中細(xì)菌聚類分析結(jié)果可知，TS、DWDF、GXB和MT樣品聚集在1個(gè)小的分支，說(shuō)明這4個(gè)樣品細(xì)菌屬的群落結(jié)構(gòu)比較相似，而JJ樣品與其他樣品未發(fā)生聚類，說(shuō)明該樣品與其余9個(gè)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。從圖6中真菌屬聚類分析結(jié)果可知，SBL和MT樣品聚集于1個(gè)小分支，JJ和GXB樣品聚集在旁邊的另1個(gè)小分支上，這2個(gè)小分支又聚集在一起，說(shuō)明這4個(gè)樣品真菌屬的群落結(jié)構(gòu)相似度較高。綜合細(xì)菌屬和真菌屬聚類分析結(jié)果，可得出GXB和MT樣品中細(xì)菌屬和真菌屬的群落結(jié)構(gòu)最為相似，這可能是因?yàn)閮烧呔鶃?lái)自同一產(chǎn)地國(guó)古巴。

圖5 基于聚類分析的屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.5 Heatmap of bacterial community structure at genus level based on cluster analysis

圖6 基于聚類分析的屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.6 Heatmap of fungal community structure at genus level based on cluster analysis

3 討論

從門分類水平分析各樣品中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和子囊菌門分別是細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)菌門。從屬分類水平分析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬是10個(gè)雪茄煙樣品中微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬，這與張鴿等［8］采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)墨西哥雪茄外包皮表面細(xì)菌主要種屬分析結(jié)果（棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬等）較為一致，且該研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵進(jìn)程而變化，優(yōu)勢(shì)微生物由發(fā)酵前期的假單胞菌屬（40.88%）和棒狀桿菌屬（44.64%）演替為發(fā)酵后期的葡萄球菌屬（72.78%）。然而相關(guān)文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道利用傳統(tǒng)微生物分離方法分析雪茄煙葉和茄衣表面微生物區(qū)系，卻發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌株，與高通量測(cè)序結(jié)果不完全一致，這可能與傳統(tǒng)微生物分離鑒定手段的局限性有關(guān)［8］，因?yàn)椴煌N屬的微生物具有不同的生理生化特征，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的需求不同，其分離純化受分離培養(yǎng)基的影響較大，故用不同的分離培養(yǎng)基可能得到不同的結(jié)果。

雪茄煙微生物中葡萄球菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬具有豐富的代謝功能，不僅可能改善雪茄煙感官品質(zhì)，而且可分解代謝煙草本身的一些有害成分。國(guó)內(nèi)外雖暫無(wú)葡萄球菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程作用機(jī)理的研究報(bào)道，但已有食品中代謝功能的相關(guān)研究，如葡萄球菌屬在臘肉和香腸發(fā)酵過(guò)程中可代謝支鏈氨基酸和含硫基氨基酸形成培根風(fēng)味［13］。而假單胞菌屬細(xì)菌能夠分解多種環(huán)境污染物，被認(rèn)為是環(huán)境中主要的有機(jī)物分解者，產(chǎn)堿假單胞菌屬（Pseudomonas alcaligenes）具有降解多環(huán)芳烴的能力［14］，假單胞菌屬中部分菌種能降解煙草中有害物質(zhì)，如煙草特有亞硝胺［15-16］。雪茄煙優(yōu)勢(shì)真菌屬中曲霉屬的很多菌也具有改善煙葉品質(zhì)的能力，如高文霞等［17］從煙葉中分離到一株曲霉屬菌株SZ14，用該菌處理煙葉后，煙葉有機(jī)酸和石油醚提取物含量明顯增加，感官評(píng)吸得分顯著提高。然而，曲霉屬也是片煙倉(cāng)儲(chǔ)和養(yǎng)護(hù)過(guò)程中導(dǎo)致霉變的主要菌屬［11,18-19］，可關(guān)注和警惕該類真菌，對(duì)于可能導(dǎo)致雪茄煙霉變的曲霉屬的具體種類和含量可進(jìn)行篩選和針對(duì)性控制，以便更有效地提升雪茄煙產(chǎn)品質(zhì)量。

雪茄煙中的微生物具有豐富的群落多樣性和特色的菌群組成結(jié)構(gòu)，可將微生物高通量測(cè)序結(jié)果作為參考，按照所剖析的優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)結(jié)合代謝組學(xué)、培養(yǎng)組學(xué)等技術(shù)手段和方法，從中篩選出更多有益的微生物菌株，對(duì)其在雪茄煙發(fā)酵過(guò)程中的功能進(jìn)行準(zhǔn)確的定位，以便深入研究其在雪茄煙發(fā)酵中的作用，探尋其作用機(jī)理，挖掘功能性菌株，進(jìn)一步改變雪茄煙發(fā)酵工藝，從而提升雪茄煙品質(zhì)。高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物生態(tài)學(xué)研究中已得到了應(yīng)用，極大加深了對(duì)食品微生物多樣性的認(rèn)識(shí)，但該技術(shù)需要專業(yè)的分析測(cè)試平臺(tái)，同時(shí)所產(chǎn)出的巨大測(cè)序數(shù)據(jù)需要熟練的生物信息學(xué)分析能力，限制了其在煙草微生物研究中的廣泛應(yīng)用和推廣。此外，高通量測(cè)序結(jié)果的序列讀長(zhǎng)有限（1 000 bp以下），對(duì)序列進(jìn)行分析時(shí)通常只能鑒定到屬水平，很難在種水平上對(duì)微生物區(qū)系進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本研究中發(fā)現(xiàn)10個(gè)雪茄煙樣品的微生物群落組成豐富，共檢出36個(gè)細(xì)菌門和360個(gè)細(xì)菌屬，其中平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門和細(xì)菌屬分別為4個(gè)和7個(gè)；共檢出7個(gè)真菌門和49個(gè)真菌屬，其中平均相對(duì)豐度大于1%的真菌門和真菌屬分別有1個(gè)和2個(gè)，其中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門和子囊菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬；細(xì)菌群落多樣性水平最高和最低的樣品分別為HNL9和CCSS樣品，而真菌群落多樣性水平最高和最低的樣品分別是WG和HNL9樣品。另外，不同樣品中細(xì)菌和真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)存在顯著差異，7個(gè)國(guó)產(chǎn)雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度差異較大，而3個(gè)進(jìn)口雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度差異較小，聚類分析顯示來(lái)自同一產(chǎn)地國(guó)的GXB和MT樣品菌群分布比較相似。