王曉露 張 坤 曾慶鑫 胡 海 孫 潔 王彭峰

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，2 病理生理學(xué)教研室， 包頭市 014060，電子郵箱：787851491@qq.com；3 內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，包頭市 014060；4 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院烏蘭察布臨床醫(yī)學(xué)院，包頭市 014060)

肝纖維化是由慢性肝損傷引起的纖維化和炎癥過程，是向肝硬化、肝癌進(jìn)展的早期階段。在肝纖維化進(jìn)展過程中，以肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)為中心，多種細(xì)胞因子及其相關(guān)信號通路相互影響，共同對肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起調(diào)節(jié)作用[1]。HSC定位于肝細(xì)胞和竇性內(nèi)皮細(xì)胞之間的竇間隙，靜態(tài)HSC主要用于儲存維生素A，在慢性肝損傷發(fā)生時，炎癥介質(zhì)促進(jìn)HSC活化并分化為成肌纖維細(xì)胞，隨之α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分分泌增多，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[2]。有研究表明，血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blocker，ARB)氯沙坦與人血清白蛋白聯(lián)合使用可減輕晚期肝纖維化程度，但是ARB類藥物對肝纖維化的干預(yù)機(jī)制尚不清楚[3]。本研究應(yīng)用ARB類藥物坎地沙坦對四氯化碳致肝纖維化大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療，觀察該藥物對大鼠肝纖維化的保護(hù)作用，探討其對HSC激活的影響及其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體級SD雄性大鼠40只，5～6周齡，體重180～220 g，由北京市斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002。

1.2 主要試劑 四氯化碳購自上海榕柏生物科技有限公司(批號：HX7484)，橄欖油購自北京中企華業(yè)食品有限公司；坎地沙坦酯片購自廣州白云山天心制藥股份有限公司；AST和ALT測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所(批號：c010-2、c009-2)；α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白兔多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(批號：A03744、BA0325)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)兔多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司(批號：B661204-0001)，二抗購自北京瀚海拓新生物技術(shù)有限公司(批號：KIT-9710)；TRIzol試劑購自天根生化科技有限公司(批號：DP405-02)，RT-PCR兩步法試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司(批號：KR103-03)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組、肝纖維化模型建立及給藥方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠分為對照組、模型組以及坎地沙坦高、中、低劑量組，每組8只。所有大鼠均自由飲水，同時給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。對照組給予皮下注射橄欖油5 mL/kg，其余各組大鼠給予皮下注射橄欖油稀釋的10%四氯化碳5 mL/kg(橄欖油與四氯化碳體積比為9 ∶1)，每周2次，共20周。從造模第5周開始，坎地沙坦高、中、低劑量組分別每日給予坎地沙坦20 mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg灌胃治療，同時對照組與模型組給予0.9%生理鹽水5 mg/kg灌胃直至造模結(jié)束。

1.3.2 標(biāo)本獲取及保存： (1)血清標(biāo)本采集。造模結(jié)束后大鼠禁食不禁水8 h，稱重，麻醉后開腹，于腹主動脈取血8～10 mL，靜置2 h后離心(4 000 r/min，4℃)15 min后取上清液，分裝后于-80℃冰箱凍存。(2)肝組織標(biāo)本收集。完整切離肝臟，分別于各肝葉處取一塊肝臟(厚約4 mm)，于4%多聚甲醛固定液中固定至少24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋；將剩余肝臟組織切塊，分裝于凍存管中，于-80℃冰箱凍存。

1.3.3 肝功能指標(biāo)測定：取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定血清AST和ALT水平。

1.3.4 肝纖維化評分：取蠟塊連續(xù)切片，切片厚度為 3～5 μm，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法染色后鏡下觀察。每張切片取5個視野拍照，應(yīng)用 Ishak 評分標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行肝纖維化評分。

1.3.5 PCR檢測：使用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計測定RNA的質(zhì)量和濃度，A260/A280為1.18～2.10。使用反轉(zhuǎn)錄PCR兩步法試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR體系包括cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、2×Tag PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增步驟：α-SMA為94℃預(yù)變性2 min，35個循環(huán)(94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s)，72℃最后延伸5 min；Ⅰ型膠原蛋白為94℃預(yù)變性 2 min，35個循環(huán)(94℃變性30 s，56℃退火30s，72℃延伸30 s)，72℃最后延伸5 min；GAPDH為94℃預(yù)變性2 min，35個循環(huán)(94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)，72℃最后延伸5 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)對DNA條帶進(jìn)行吸光度掃描，與相應(yīng)GAPDH吸光度的比值為α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白 mRNA的相對表達(dá)水平。α-SMA上游引物序列為5′-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3′，下游引物序列為3′- GATCACCTGCCCATCAGG-5′(291 bp)；Ⅰ型膠原蛋白上游引物序列為5′- GGCAAGACAGTCATCGAATACA-3′，下游引物序列為3′-GATTGGGATGGAGGGAGTTTA-5′(147 bp)；GAPDH上游引物序列為5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物序列為3′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-5′(92 bp)。

1.3.6 免疫組化分析：取肝組織石蠟切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptavidin-perosidase,SP)法檢測Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá)，將石蠟包埋的肝組織切成5 μm切片，依次放入二甲苯、乙醇中，抗原修復(fù)后，依次滴加一抗、二抗，用二氨基聯(lián)苯胺顯色后，鏡下觀察，視野中呈棕黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，主要著色部位在細(xì)胞間隙。每張切片隨機(jī)選取5個視野拍照，應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro-Plus 6.0測定目的蛋白的平均光密度值(積分光密度/組織面積)，用于反映目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett-T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察及纖維化評分 肉眼觀察：對照組大鼠肝臟表面光滑，邊緣整齊；模型組大鼠肝臟略增大，邊緣鈍，表面可見粗顆粒狀凸起，手感粗糙，與周圍器官有輕度粘連；坎地沙坦各劑量組大鼠肝臟略增大，表面可見散在出血點(diǎn)，個別大鼠肝臟與周圍器官有輕度粘連。鏡下觀察：對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞呈條索狀排列整齊，呈放射狀分布；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，纖維間隔形成且伴有大量氣球樣變，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，坎地沙坦各劑量組大鼠肝臟纖維間隔變窄，氣球樣變程度減輕，炎性細(xì)胞數(shù)量減少。見圖1。

對照組 模型組 坎地沙坦高劑量組 坎地沙坦中劑量組 坎地沙坦低劑量組

5組大鼠肝組織的Ishak評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，其他4組的評分高于對照組(P<0.05)；坎地沙坦高劑量組的評分低于模型組、中劑量組和低劑量組(均P<0.05)；而坎地沙坦中、低劑量組的評分與模型組比較，中劑量組與低劑量組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠肝組織Ishak評分的比較(x±s，分)

2.2 各組大鼠血清ALT和AST水平的比較 5組大鼠的血清ALT和AST水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。其中，模型組血清ALT和AST水平均高于對照組(均P<0.05)；坎地沙坦高、中、低劑量組血清ALT表達(dá)水平均低于模型組，且坎地沙坦高、中劑量組血清ALT水平低于低劑量組(均P<0.05)，而坎地沙坦高、中劑量組血清ALT水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；坎地沙坦高、中、低劑量組血清AST水平均高于對照組(均P<0.05)，而模型組與坎地沙坦高、中、低劑量組血清AST水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清ALT和AST水平的比較(x±s，U/L)

2.3 各組大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白mRNA和α-SMA mRNA的表達(dá)情況 5組大鼠肝組織的Ⅰ型膠原蛋白 mRNA和α-SMA mRNA相對表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。其中，與對照組比較，模型組大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白 mRNA和α-SMA mRNA相對表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，坎地沙坦高、中、低劑量組Ⅰ型膠原蛋白mRNA和α-SMA mRNA相對表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；坎地沙坦各劑量組之間α-SMA mRNA相對表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而坎地沙坦高劑量組Ⅰ型膠原蛋白mRNA相對表達(dá)水平均低于坎地沙坦中、低劑量組(均P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA mRNA水平比較

表3 5組大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA mRNA相對水平的比較(x±s)

2.4 各組大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá)情況 (1)在對照組大鼠肝組織中，僅在中央靜脈及匯管區(qū)周圍可見極少量Ⅰ型膠原蛋白沉積；模型組可見Ⅰ型膠原蛋白大量表達(dá)，尤其在肝組織中央靜脈及匯管區(qū)周圍、纖維間隔周圍；在坎地沙坦各劑量組中，Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)集中在中央靜脈及匯管區(qū)周圍。 見圖3。模型組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量水平高于對照組(P<0.05)，坎地沙坦各劑量組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05)，坎地沙坦高劑量組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平低于坎地沙坦低劑量組、坎地沙坦中劑量組(均P<0.05)，但坎地沙坦低、中劑量組之間Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。(2)在對照組大鼠肝組織中，僅在中央靜脈壁和匯管區(qū)動、靜脈壁有少量α-SMA蛋白表達(dá)；與對照組相比，模型組α-SMA大量表達(dá)，尤其在纖維增生的匯管區(qū)，中央靜脈及匯管區(qū)周圍、纖維間隔周圍；在坎地沙坦各劑量組中，α-SMA的表達(dá)集中在中央靜脈及匯管區(qū)周圍，纖維間隔伴有少量增生。見圖4。模型組α-SMA蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，模型組、坎地沙坦低劑量、坎地沙坦中劑量、坎地沙坦高劑量的α-SMA表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)，見表4。

對照組 模型組 坎地沙坦高劑量組 坎地沙坦中劑量組 坎地沙坦低劑量組

對照組 模型組 坎地沙坦高劑量組 坎地沙坦中劑量組 坎地沙坦低劑量組

表4 5組大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

肝纖維化是由于慢性肝損傷導(dǎo)致的ECM過度沉積的病理過程，其病因主要有酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、慢性病毒性肝炎和自身免疫性肝病等，其共同細(xì)胞機(jī)制是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活。在慢性肝病中，靜止期HSC分化為活化的HSC，活化型HSC失去細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)滴并獲得肌成纖維細(xì)胞表型，其特征在于α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白等ECM的表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)和血管結(jié)構(gòu)被破壞，引起肝功能受損和肝纖維化[5-6]。因此，肝組織α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)增多，在一定程度上反映了HSC的激活情況，也是促進(jìn)肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳法復(fù)制肝纖維化大鼠動物模型，經(jīng)肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，纖維間隔明顯增生，肝纖維化Ishak評分較對照組升高，說明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了肝纖維化大鼠的動物模型。檢測肝功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，模型組血清AST和ALT水平高于對照組，說明肝纖維化發(fā)生后，肝組織病理變化即結(jié)構(gòu)損害導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，ALT和AST從細(xì)胞溢出入血[7-8]。當(dāng)ECM過多沉積時會壓迫靜脈和門靜脈。當(dāng)門靜脈阻力增加至超出人體代償能力時，門靜脈血流速度和血流會減少，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)在該過程中發(fā)揮重要作用，ARB則通過阻斷AngⅡ與其受體AT1結(jié)合而發(fā)揮抗纖維化作用。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用ARB類藥物坎地沙坦對肝纖維化大鼠進(jìn)行治療后，光鏡下可見肝組織纖維間隔變窄，氣球樣變程度減輕，炎性細(xì)胞數(shù)量減少，且坎地沙坦高劑量組的Ishak評分均較模型組和坎地沙坦中劑量組、低劑量組有所降低，提示20 mg/kg劑量的坎地沙坦可以改善肝纖維化。同時，坎地沙坦可降低肝纖維化大鼠的血清ALT水平，對大鼠的肝功能具有一定的保護(hù)作用，且高、中劑量的坎地沙坦的效果更好。

α-SMA是一種收縮性蛋白，通常在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，有助于血管運(yùn)動和收縮。在肝損傷過程中，HSC轉(zhuǎn)化為活化的成肌纖維細(xì)胞，從而使α-SMA合成增多并促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展[9]。同時，肝纖維化病理過程是一種傷口愈合反應(yīng)，其特征為正常的、富含Ⅳ型膠原的ECM被主要由Ⅰ型膠原組成的間質(zhì)“瘢痕”基質(zhì)逐漸取代。Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HSC通過分泌Ⅰ型膠原蛋白觸發(fā)肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述研究提示α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)量可衡量HSC活化的程度和判斷肝纖維化的程度。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測大鼠肝組織α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的mRNA和蛋白的表達(dá)量，觀察肝纖維化大鼠模型中HSC的激活程度，以及應(yīng)用坎地沙坦實(shí)驗(yàn)性治療對HSC活化程度的影響。結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)較對照組升高，而應(yīng)用坎地沙坦干預(yù)后，各治療組的α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白mRNA和蛋白表達(dá)均較模型組降低，且坎地沙坦高劑量組α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的蛋白表達(dá)水平低于其他兩個劑量組(均P<0.05)。這表明，肝纖維化大鼠存在HSC的激活，而坎地沙坦對HSC的活化有抑制作用，且坎地沙坦高劑量組的作用更強(qiáng)。

綜上所述，ARB類藥物坎地沙坦能夠通過抑制HSC的激活來改善肝纖維化大鼠的肝功能，并降低肝纖維化程度，以高劑量(20 mg/kg)的干預(yù)效果最明顯，其分子機(jī)制可能與該藥物下調(diào)肝組織α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)有關(guān)。