李鳳輝 邊 力 史會來 周麗青 陳四清① 葛建龍 劉長琳 盧 斌 常 青

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；4. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 舟山 316021)

真蛸(Octopus sinensis, d’Orbigny, 1841)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、二鰓亞綱(Dibranchiata) 、 八 腕 目(Octopoda) 、 蛸 科(Octopodidae)、蛸屬(Octopus)，主要分布于北太平洋西部的溫帶淺海海域，特別是中國、韓國和日本沿海，成體營底棲生活(Amoret al, 2017; Gleadall, 2016)。O. sinensis過去常與分布于大西洋和地中海等海域的真蛸(Octopus vulgaris)視為同種異名(Iglesiaset al,2007; Okumuraet al, 2005; Warnkeet al, 2004)。近年來，基于分子生物學(xué)和外部形態(tài)特征，在物種水平上將O. sinensis和真蛸(O. vulgaris)分離開來，英文命名為East Asian common octopus (O. sinensis)(Amoret al,2019、2017; Gleadall, 2016)。鑒于國內(nèi)沒有重新定名，本文暫沿用真蛸。蛸類是海洋大型經(jīng)濟(jì)魚類的重要餌料，作為捕食者和被捕食者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中扮演著重要角色；其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，備受消費(fèi)者青睞，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(廖永巖, 2006)。隨著頭足類海洋捕撈量的逐漸減少和消費(fèi)量的逐漸增大，蛸類人工養(yǎng)殖將是必然，市場前景廣闊(葉守建等, 2014)。O. sinensis具有生命周期短、產(chǎn)卵量大、食物轉(zhuǎn)化率高和生長速度快等特點(diǎn)，是極具潛力的海水增養(yǎng)殖品種(Danet al, 2019)。目前，中國、日本等國家已經(jīng)開始進(jìn)行O. sinensis人工養(yǎng)殖技術(shù)的研究(Danet al, 2019; 徐大鳳等, 2019)。

染色體是生物遺傳信息的載體，是兩性生物進(jìn)化、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究染色體數(shù)目和核型，對了解生物遺傳變異規(guī)律、親緣關(guān)系、進(jìn)化地位、性別決定機(jī)制等均具有重要意義(史寶等, 2017; Amoreset al, 2014)。同時，可為生物的種質(zhì)鑒定、雌(雄)核發(fā)育、多倍體誘導(dǎo)、雜交育種等技術(shù)的研究以及染色體水平的基因組組裝提供參考依據(jù)(Molina-Luzónet al,2015)?，F(xiàn)存的頭足類大約有700 余種，但對其染色體核型的研究相對較少。目前，國內(nèi)外僅對10 種頭足類的染色體進(jìn)行了研究：金烏賊(Sepia esculenta)、虎斑烏賊(Sepia pharaonis)、擬目烏賊(Sepia lycidas)、萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)、長槍烏賊(Heterololigo bleekeri)、劍尖槍烏賊(Photololigo edulis)、商烏賊(Sepia officenalis)、短蛸(Octopus ocellatus)、長蛸(Octopus minor)和真蛸(王曉華等, 2011; Papanet al, 2010; Gaoet al, 1990; Vitturiet al, 1982; Inaba,1959)。目前，國內(nèi)外對O. sinensis的研究主要集中在分類、發(fā)育生物學(xué)以及人工養(yǎng)殖技術(shù)等方面，對其染色體核型的研究未見報(bào)道(Amoret al, 2017、2019;Gleadall, 2016; Danet al, 2019)。本研究對O. sinensis的染色體核型進(jìn)行分析，旨在豐富其細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，以期為其種質(zhì)鑒定、資源保護(hù)和人工養(yǎng)殖等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用真蛸為2019 年10 月在浙江省舟山市附近海域捕獲的野生群體幼體，根據(jù)右側(cè)第3 腕足確定其雌雄(圖1B、C)，雌雄各5 只，雌性體重為(169.25±4.03) g，全長為(34.05±3.46) cm，生殖腺指數(shù)為1.31±0.62；雄性體重為(345.60±5.32) g，全長為(41.20±4.35) cm，性腺指數(shù)為2.31±0.89。按照Amor 等(2017)的研究，基于線粒體COI 基因部分序列對隨機(jī)選取的5 只章魚進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果為O. sinensis(圖1D)。實(shí)驗(yàn)在浙江省舟山市浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前，車間暫養(yǎng)30 d，暫養(yǎng)水溫為22℃～24℃，鹽度為30～33，pH 為7.8～8.4，DO＞6 mg/L。飼以菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)和日本蟳(Charybdis japonica)，日投餌1 次，投餌量為體重的 5%～10%，采用流水養(yǎng)殖，日換水量為100%～200%。

圖1 O. sinensis 外部形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定Fig.1 External morphology and molecular identification of the O. sinensis

1.2 染色體標(biāo)本制備

染色體標(biāo)本制備參照金烏賊染色體核型分析方法(王曉華等, 2011)，略作修改。預(yù)處理：將O. sinensis活體置于含秋水仙素終濃度為0.005%的過濾海水中暫養(yǎng)2 h，暫養(yǎng)水溫為22℃～24℃，暫養(yǎng)過程中持續(xù)充氣。處理：解剖并取鰓和腎臟組織于過濾海水配制的秋水仙素溶液(終濃度為0.04%)中浸泡30 min。低滲：將處理后的鰓和腎臟組織切成小塊，并置于50 ml 濃度為0.075 mol/l 的KCl 溶液中(蒸餾水配制)處理50 min。固定：將低滲后的組織轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的卡諾氏液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)中，每隔15 min 更換固定液，重復(fù)3 次。固定后的組織4℃保存過夜。解離：固定后的組織于50%的冰醋酸(蒸餾水配制)中解離，解離時間視組織解離狀態(tài)而定，待解離組織近乎透明，終止解離，剔除未解離的組織，并用吸管輕輕吹打解離液2 min。滴片：采用熱滴片法制備染色體標(biāo)本。染色：載玻片在空氣中自燃干燥后，用10%的吉姆薩染液染色30 min，蒸餾水沖洗，晾干后鏡檢。整個實(shí)驗(yàn)過程雌雄各重復(fù)5 次。

1.3 染色體核型分析

使用Nikon ECLIPSE 80i 顯微鏡對O. sinensis染色體標(biāo)本進(jìn)行觀察并拍照。選取200 個染色體分散較好的中期分裂相進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)。再從中選取20 個著色較好、輪廓清晰、收縮適中的染色體中期分裂相經(jīng)放大打印后進(jìn)行測量和分析，并計(jì)算相對長度和臂比。相對長度=(實(shí)測染色體長度/全部染色體長度總和)×100；臂比=長臂長度/短臂長度；按照Levan 等(1964)提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析，按臂比將染色體分為4 種類型：中部著絲點(diǎn)染色體(m，臂比1.00～1.70)、亞中部著絲點(diǎn)染色體(sm，臂比1.71～3.00)、亞端部著絲點(diǎn)染色體(st，臂比3.01～7.00)、端部著絲點(diǎn)染色體(t，臂比≥7.0)。中部著絲粒染色體(m)和亞中部著絲粒染色體(sm)臂數(shù)為2，亞端部著絲粒染色體(st)和端部著絲粒染色體(t)臂數(shù)為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目的確定

利用O. sinensis的鰓和腎臟組織均能獲得中期分裂相(圖2A)，雌雄各選取100 個分散較好的分裂相進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)(表1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，200 個分裂相中，染色體條數(shù)為60 的分裂相有156 個，占比為78%，由此確定O. sinensis的二倍體染色體條數(shù)為2n=60。

表1 O. sinensis 二倍體染色體數(shù)目頻率分布Tab.1 Frequency distribution of O. sinensis diploid chromosome number

2.2 染色體相對長度及核型分析

染色體相對長度和臂比統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。根據(jù)相對長度和臂比，O. sinensis的60 條染色體可配對為30 對(圖2B)，其中，7 對為中部著絲粒染色體(m)，13 對為亞中部著絲粒染色體(sm)，6 對為亞端部著絲粒染色體(st)，4 對為端部著絲粒染色體(t)。最長和最短的染色體相對長度分別為3.76±0.05 和0.70±0.13，均為亞中部著絲粒染色體。雌雄染色體類型一致，未發(fā)現(xiàn)性別相關(guān)的異型染色體，也沒發(fā)現(xiàn)次溢痕和隨體。確定本研究O. sinensis的染色體核型為2n=14 m+26 sm+12 st+8 t，臂數(shù)(NF)為100。

表2 O. sinensis 中期染色體類型、相對長度和臂比值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.2 Relative length and arm ratio of metaphase chromosome in O. sinensis (Mean±SD)

3 討論

現(xiàn)存頭足類有700 余種，但僅有7 種報(bào)道了染色體核型(表3)。頭足類染色體的研究最早見于Inaba(1959)的報(bào)道，采用精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞對長蛸和真蛸的染色體進(jìn)行制備并分析染色體數(shù)目，并未報(bào)道核型。染色體標(biāo)本多采用生物細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)時期或組織進(jìn)行制備，像魚類的頭腎、鰓等，細(xì)胞分裂指數(shù)高，更易獲得較多的中期分裂相。已知頭足類染色體核型的研究多采用性細(xì)胞、受精卵、正在發(fā)育的胚胎等(王曉華等, 2011; Papanet al, 2010; Gaoet al,1990; Vitturiet al, 1982; Inaba, 1959)。性腺和受精卵能夠獲得中期分裂相，但制備過程中細(xì)胞極易破裂，容易造成染色體丟失，同時，受精卵因含有較多的卵黃組織，會影響染色體分散及染色(王曉華等, 2011;Vitturiet al, 1982; Inaba, 1959)。正在發(fā)育的胚胎細(xì)胞分裂旺盛，所制備的染色體標(biāo)本中期分裂相較多，染色體分散好，輪廓清晰，極適用于頭足類染色體標(biāo)本的制備(王曉華等, 2011)。在胚胎時期，頭足類性別尚未分化，難以確定頭足類的染色體性別決定機(jī)制。本研究利用O. sinensis幼體鰓和腎臟組織，采用活體浸泡秋水仙素暫養(yǎng)的方法，成功獲得雌雄個體分散較好、輪廓清晰、收縮適中的染色體中期分裂相(圖2A)。首先，O. sinensis幼體處于生長期，細(xì)胞分裂相對旺盛，且已出現(xiàn)性別分化，有利于結(jié)合染色體核型分析其染色體性別決定機(jī)制。其次，采用含秋水仙素海水暫養(yǎng)的方法對活體進(jìn)行預(yù)處理，保證在組織細(xì)胞活性下獲得實(shí)驗(yàn)樣本，提高有絲分裂指數(shù)。但與胚胎相比，幼體鰓和腎臟有絲分裂指數(shù)相對較低，可通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)來彌補(bǔ)不足。

表3 國內(nèi)外頭足類染色體核型研究Tab.3 Study on karyotype of chromosome of cephalopod

圖2 O. sinensis 中期分裂相染色體及核型Fig.2 Metaphase chromosome and karyotype of O. sinensis

兩性分化與有性生殖推動了生物的遺傳和變異過程。異形染色體(性染色體)對在生物性別決定過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)異形染色體對在兩性中的存在形式，可將目前已知的生物染色體決定模式分為XX/XY 型、ZW/ZZ 型、ZO/ZZ 和XX/XO 型以及復(fù)性染色體型(尚曉莉等, 2010)。部分生物的性別決定模式除受到性染色體調(diào)控外，常染色體也發(fā)揮一定的調(diào)控作用，即常染色體性別決定類型(童金茍等,2003)。常染色體性別決定類型是指在現(xiàn)有的技術(shù)條件下未能發(fā)現(xiàn)異形染色體(尚曉莉等, 2010)。目前，國內(nèi)外對軟體動物染色體性別決定機(jī)制的研究較少，國內(nèi)僅見櫛江珧(Atrina pectinata)。周麗青等(2018)利用愈傷組織制備櫛江珧染色體標(biāo)本，分析發(fā)現(xiàn)櫛江珧的染色體性別決定機(jī)制為XX/XY 型。國外研究發(fā)現(xiàn)，在腹足類中可能存在XO 或XY 型性染色體(陳宇，2007)。國內(nèi)外未見頭足類染色體存在異形染色體的報(bào)道。本研究通過分析O. sinensis雌雄個體染色體核型亦未發(fā)現(xiàn)異形染色體，推斷頭足類染色體性別決定模式可能為常染色體性別決定類型。Twyman(2002)認(rèn)為，大部分雌雄異體型動物原始性別及第二性征是由性染色體決定的。蛸類外部形態(tài)已出現(xiàn)雌雄性別的差異，即第二性征，具體表現(xiàn)為雄性右側(cè)第3 腕足特化為交接腕(圖1B、C)。因而，O. sinensis是否存在性染色體有待通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，染色體帶型分析等方法進(jìn)一步探究。

表3 顯示，在蛸科中，Gao 等(1990)報(bào)道的真蛸(O. vulgaris)二倍體染色體條數(shù)為60 條，與Vitturi 等(1982)和Inaba (1959)的研究結(jié)果(56 條)存在差異。Gao 等(1990)認(rèn)為產(chǎn)生該種差異的原因?yàn)椴煌乩砣后w的生物存在染色體的種內(nèi)變異。鑒于本研究O.sinensis的染色體條數(shù)也為60 條，作者認(rèn)為產(chǎn)生上述差異的原因更可能為染色體制備方法的差異。研究表明，取樣材料對頭足類染色體制備的影響較大(王曉華等, 2011)。本研究發(fā)現(xiàn)，O. sinensis性腺細(xì)胞在染色體制備過程中極易破裂，容易造成染色體的丟失。在烏賊科中，Gao 等(1990)與王曉華等(2011)對金烏賊染色體核型分析所得的染色體條數(shù)一致(均為92條)，但染色體核型有差異，主要體現(xiàn)在中部著絲粒染色體、亞中部著絲粒染色體和亞端部著絲粒染色體數(shù)目上的差異。該差異的產(chǎn)生可能有2 個原因：1) 實(shí)驗(yàn)方法不同導(dǎo)致染色體收縮程度不同，進(jìn)而影響到測量結(jié)果；研究顯示，秋水仙素濃度過大或處理時間過長均會導(dǎo)致染色體收縮嚴(yán)重，進(jìn)而影響到測量結(jié)果和后期染色體分型(梁述章等, 2019)；2) 魚類中不同地理群體的個體存在染色體多態(tài)性現(xiàn)象(Renet al,2014)，頭足類也可能存在類似現(xiàn)象。

染色體是生物遺傳信息的載體，染色體的核型能夠反映物種的進(jìn)化歷史和種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近(Vitturiet al, 1982)。烏賊科的金烏賊和擬目烏賊與槍烏賊科的長槍烏賊、劍尖槍烏賊和萊氏擬烏賊的二倍體染色體條數(shù)均為92 條，而蛸科的O. sinensis、短蛸和真蛸為60 條，說明烏賊科與槍烏賊科的親緣關(guān)系可能更近，而與蛸科的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究O. sinensis的染色體核型為2n=14 m+26 sm+12 st+8 t，與真蛸(O. vulgaris)(2n=14 m+2 sm+8 st+36 t)相比，O. sinensis的染色體核型主要由中部著絲粒染色體和亞中部著絲粒染色體構(gòu)成，說明O. sinensis的染色體核型更為穩(wěn)定(Ahmed, 1976)，染色體核型的差異也為二者的區(qū)分提供了另一個判定依據(jù)。短蛸(O. ocellatus)的染色體核型為2n=32 m+28 sm，不存在亞端部和端部著絲粒染色體，說明在蛸類進(jìn)化過程中，染色體可能存在易位或倒置現(xiàn)象(Gaoet al, 1990)。從染色體核型特征上可以看出，O. sinensis與真蛸(O. vulgaris)的親緣關(guān)系更近，而與短蛸(O. ocellatus)的較遠(yuǎn)。頭足綱是軟體動物門中最高等的類群，其染色體條數(shù)(48～104)比其他軟體動物(18～70)多(Vitturiet al, 1982;王梅林等, 2000; 孫振興, 2004)，結(jié)果支持Patterson(1978)的推斷：越原始的軟體動物，染色體條數(shù)越少。在蛸科、烏賊科和槍烏賊科中，蛸科的染色體條數(shù)最少，推斷蛸科的進(jìn)化地位更為原始。