包仲明 文黛薇 陸品剛 黃舞標 唐國文

1.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，廣西梧州 543002；2.廣西中醫(yī)藥大學第六附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西梧州 543002；3.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，廣西梧州 543002；4.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院康復科，廣西梧州 543002

帕金森病便秘是指帕金森病患者的一種非運動癥狀，病因主要是腸胃蠕動功能下降，給患者生活質(zhì)量帶來嚴重的不良影響[1]。帕金森病患者中很大一部分會發(fā)生便秘，即使不發(fā)生便秘，也有部分患者發(fā)生排便頻率降低。帕金森病便秘原因比較復雜，可能由多種原因引起，帕金森病本身可能會伴隨便秘，也可能因服用治療帕金森病藥物副作用而加重便秘的癥狀。因此帕金森病便秘可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物治療、飲食變化或體力活動有限有關[2]。中藥具有多靶點的作用優(yōu)勢，在帕金森病便秘的治療中具有良好的前景[3]，但其具體的作用機制尚未明確，需要進一步探討。全國老中醫(yī)藥專家文黛薇教授認為脾胃是氣機升降的樞紐，人體精氣的升降運動有賴于脾胃居于其中而主宰。人以脾胃為后天之本，若脾胃受損，氣血化生障礙，元氣不充，正虛邪犯，百病由生。由此可見，中焦脾胃能影響其余諸臟的生理功能，中氣足則四臟皆健，脾胃旺以安五臟。故在臨證中，應謹遵“調(diào)治百病，扶土為先”之旨，將其應用于諸多疾病的診治過程中，并始終重視顧護脾胃。白術-黃芪-枳實組方可在健脾胃益氣基礎上，治療帕金森病便秘癥狀[4]。因此，本研究擬結合網(wǎng)絡藥理學方法探討白術-黃芪-枳實組方治療帕金森病便秘作用機制并進行實驗驗證。

1 材料與方法

1.1 白術-黃芪-枳實組方的化合物及其作用靶點

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）中分別檢索白術、黃芪和枳實的活性化合物，篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為標準，同時結合相關文獻[7-13]，對化合物進行篩選。在TCMSP 中查找各有效化合物所對應的基因靶點，用于后續(xù)分析。

1.2 帕金森病便秘靶點基因收集

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“帕金森病便秘”為關鍵詞檢索其相關基因，與白術-黃芪-枳實組方中有效化合物作用的靶點基因進行比較，篩選出白術-黃芪-枳實組方用于帕金森病便秘的作用靶點并繪制韋恩圖，靶點基因用于后續(xù)生物功能及信號通路分析。

1.3 有效靶點基因及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析

構建白術-黃芪-枳實組方化合物-帕金森病便秘的靶點關系網(wǎng)絡，并在Cytoscape 軟件中進行可視化，初步分析白術-黃芪-枳實組方治療帕金森病便秘的作用機制。同時將有效靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫中，選擇“人”作為物種，以靶點蛋白互作評分＞0.7 為標準，獲取有效靶點PPI 網(wǎng)絡。

1.4 有效靶點GO 富集分析及KEGG 通路分析

將白術-黃芪-枳實組方的靶點輸入生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID），對篩選所得化合物靶點進行GO 生物學過程富集分析。利用KEGG Mapper功能將白術-黃芪-枳實組方化合物作用靶點在其與帕金森病便秘相關的作用通路上標注。

1.5 藥物及試劑

白術-黃芪-枳實組方濃縮液（方藥組成如下：白術40 g、黃芪15 g、枳實15 g），由廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，該組方經(jīng)煎煮后濃縮，使每1 ml 濃縮液中含2 g 生藥。洛哌丁胺（中國藥品檢驗總所，批號：100300）、美多芭（上海羅氏）、聚乙二醇（馬應龍藥業(yè)，批號：20082092）。RNA 提取試劑盒（廣州美基公司，批號：R4121-02B）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTM，批號：RR055A/B）、PCR 引物（美國賽默飛，批號：450006）。絲裂原激活蛋白激酶8（mitogen-activation protein kinase 8，MAPK8）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、MYC、胱天蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease 3，Caspase3）一抗（北京中杉金橋，TA809895、TA500067、TA336584、TA336456）。

1.6 實驗動物、造模及干預

選取6 周齡健康清潔級雄性SD 大鼠20 只，平均體重（180±20）g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心（生產(chǎn)許可：SCXK 桂2020-0003，使用許可：SYXK 桂2020-0004），其中5 只為正常組，15 只采用雙靶點注射6-羥基多巴胺，建立帕金森病模型，注射藥物3 周后，大鼠逐漸開始出現(xiàn)毛色變黃、弓背、震顫、步態(tài)不穩(wěn)等帕金森病表現(xiàn)，4 周后其行為學評分均達到2 分以上為造模成功[5]。進一步使用洛哌丁胺3 mg/kg，1 ml 生理鹽水稀釋后進行灌胃6 d[6]。于末次給藥2 h后，20 只大鼠均灌胃5%活性炭-阿拉伯樹膠懸液，灌胃后記錄首粒黑便的排出時間，當15 只帕金森病模型大鼠的首粒黑便平均排出時間長于正常組且差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）時，視為帕金森病便秘模型造模成功。本研究涉及的實驗動物，研究過程遵循《赫爾辛基宣言》有關生物醫(yī)學研究的倫理要求。

將15 只帕金森病便秘模型大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性對照組、實驗組，每組各5 只。實驗組給予10 ml/kg 白術-黃芪-枳實組方濃縮液灌胃；陽性對照組給予美多芭50 mg/kg和聚乙二醇1 mg/kg進行灌胃；正常組、模型組用等量的生理鹽水進行灌胃，均1 次/d，持續(xù)2 周。最后用2.5 ml/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，處死并取結腸組織。

1.7 mRNA表達檢測

根據(jù)網(wǎng)絡藥理學分析結果及參考文獻[14-15]，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測四組結腸組織中相關基因表達量。試劑盒提取四組結腸組織中相關mRNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為參考。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qRT-PCR 進行擴增及定量分析。

1.8 Western blot 檢測

取四組結腸組織于低溫冰盒內(nèi)剪碎后并裂解，根據(jù)BCA 法測定蛋白濃度后進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入稀釋相關基因的一抗，按1∶200 稀釋后至于4℃冰箱中孵育過夜，洗膜后滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，至于37℃恒溫箱中孵育1 h。顯影后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，用β-actin 蛋白進行校正。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用Tukey 法進行兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白術、黃芪和枳實的活性生物化合物

白術、黃芪和枳實共收集到50 種活性生物化合物，主要包括3β-acetoxyatractylone、quercetin和naringenin等。見表1。

表1 白術、黃芪和枳實中篩選的50 種活性生物化合物

2.2 白術-黃芪-枳實組方的靶點篩選

白術-黃芪-枳實組方作用靶點共2448 個，篩選的活性化合物相對應的靶點共116 個，帕金森病便秘相關的靶點共2559 個，二者取交集后得到白術-黃芪-枳實組方可能作用于帕金森病便秘的靶點84 個。見圖1、表2。

表2 白術-黃芪-枳實組方可能作用于帕金森病便秘靶點

圖1 帕金森病便秘與白術-黃芪-枳實組方作用靶點交集的韋恩圖

2.3 白術-黃芪-枳實組方活性化合物-帕金森病便秘靶點網(wǎng)絡構建與分析

白術-黃芪-枳實組方與帕金森病便秘之間的靶點網(wǎng)絡圖中共有114 個節(jié)點，見圖2。PPI 網(wǎng)絡圖中相互作用節(jié)點共648 個，將蛋白連接節(jié)點最多的蛋白以柱狀圖的形式表示，相互作用節(jié)點最多的為MAPK8，共58 個，見圖3。

圖2 白術-黃芪-枳實組方活性化合物-帕金森病便秘作用靶點網(wǎng)絡圖

圖3 白術-黃芪-枳實組方與帕金森病便秘作用靶點網(wǎng)絡構建與分析

2.4 白術-黃芪-枳實組方-帕金森病便秘靶點的生物學功能及信號通路分析

GO 分析共富集到111 條生物過程，主要包括泛素樣蛋白連接酶結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉(zhuǎn)錄因子結合、DNA 結合轉(zhuǎn)錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡、核受體活性等生物過程，見圖4（封三）。KEGG 分析富集結果顯示白術-黃芪-枳實組方靶點主要富集在PI3K-Akt、Hepatitis B、MAPK和neurodegenerationmultiple diseases 等信號通路上，見圖5（封三）。

圖4 白術-黃芪-枳實組方與帕金森病便秘相關靶點GO 富集分析圖

圖5 白術-黃芪-枳實組方與帕金森病便秘相關靶點信號通路氣泡圖

2.5 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 基因表達量比較

模型組MAPK8 基因表達量均低于正常組，IL-6、MYC、Caspase3 基因表達量均高于正常組，實驗組MAPK8 基因表達量高于模型組，IL-6、MYC、Caspase3基因表達量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見圖6。

圖6 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 基因表達量比較

2.6 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表達量比較

模型組MAPK8 蛋白表達量低于正常組，IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表達量均高于正常組，實驗組MAPK8 蛋白表達量高于模型組，IL-6、MYC、Caspase3蛋白表達量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見圖7。

圖7 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表達量比較

3 討論

便秘是帕金森病患者最容易出現(xiàn)的腸道并發(fā)癥，同時也有研究表明便秘作為帕金森病的非運動癥狀，會早于帕金森病運動癥狀出現(xiàn)[16]。便秘的加重會導致帕金森病病情的加重，同時便秘也是部分藥物治療帕金森病的副作用之一[17]。

網(wǎng)絡藥理學是結合計算機科學、生物信息學和醫(yī)學的綜合學科，在“藥物-靶點-疾病”相互作用的基礎上，利用數(shù)據(jù)庫進行網(wǎng)絡分析，可以系統(tǒng)地分析藥物對疾病的干預作用，揭示藥物多分子協(xié)同作用于人體的機制，這與中醫(yī)藥復方治療疾病多靶點有異曲同工之處，可以科學地分析中藥復方對疾病的作用機制[18]。

網(wǎng)絡藥理學結果分析顯示，白術-黃芪-枳實組方作用的靶點具有多樣性，顯示了中醫(yī)“異病同治”的理論，同時也提示“扶土為先”理論的科學性，可從脾胃論治腦病。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡分析得出節(jié)點最多的MAPK8、IL-6 等靶點，結合文獻確與帕金森病便秘存在相關性[19-22]。生物學功能GO 分析中，與白術-黃芪-枳實組方作用靶點生物過程相關聯(lián)的有泛素樣蛋白連接酶結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉(zhuǎn)錄因子結合、DNA 結合轉(zhuǎn)錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等，與帕金森病便秘的發(fā)展有相關性[23-25]。KEGG 信號通路分析得出，白術-黃芪-枳實組方作用靶點主要參與的信號通路有PI3KAkt、Hepatitis B、MAPK和neurodegeneration-multiple diseases 等，研究表明與帕金森病便秘相關[26]，同時也與脾胃疾病存在密切的關系[27]，由此也從信號通路說明了可通過“扶土為先”論治帕金森病便秘。MAPK和neurodegeneration-multiple diseases 信號通路也與帕金森病便秘密切相關[28-29]。Hepatitis B 信號通路與帕金森病便秘也存在高度相關，可能是其危險因素或共用信號通路[30]。

由于使用網(wǎng)絡藥理學研究中藥對疾病的機制仍有其局限性，因此，本研究還通過動物實驗進行驗證。選取PPI 網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點，同時結合文獻，選取MAPK8、IL-6、MYC 及Caspase3 基因及其蛋白表達量進行研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK8 是白術-黃芪-枳實組方治療帕金森病便秘中的最主要節(jié)點，而動物實驗結果也顯示實驗組結腸中MAPK8的基因表達量高于模型組，提示MAPK8 極可能為帕金森病便秘中的關鍵的基因，可將腦和腸聯(lián)系起來。而實驗組中IL-6、MYC 及Caspase3的基因表達量均低于模型組，與相關文獻報道一致[8,31-32]。

文黛薇教授為第六批全國老中醫(yī)藥專家學術經(jīng)驗繼承工作指導老師之一，行醫(yī)數(shù)十載，一直重視脾胃，認為脾胃乃后天之本，化生之源，強調(diào)“調(diào)治百病、扶土為先”的學術思想，在內(nèi)科疾病診治方面逐步形成一套辯證思維方法和臨床醫(yī)療經(jīng)驗。文黛薇教授指出，脾胃為“倉廩之官”“水谷之?！薄昂筇熘尽?。所謂“本”，是指脾主運化，生血、統(tǒng)血，為氣血生化之源，氣機升降的樞紐，是保證生命活力的源泉。同時腦髓由水谷精微中至清至精者所化，所以文黛薇教授認為脾胃與腦關系密切，腦病的諸多癥狀，皆可從脾胃而論治?！秱摗分杏刑岬健叭舸蟊銏?，小便自利者，去桂加白術湯主之”，同時也有研究表明白術能促進腸道平滑肌蠕動，說明白術不僅可以益氣健脾，同時也是治療便秘的對癥中藥[33-34]。黃芪能補氣健脾、益氣固表，同時能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善便秘的癥狀[35-36]。枳實具有調(diào)節(jié)胃腸動力、抗氧化、消炎鎮(zhèn)痛等作用，多用于消化系統(tǒng)疾病的治療。白術和黃芪“以補為通”，補虛而不壅滯，通腑而不傷正，同時結合枳實，辛散溫通，破氣消積，消補結合，一走一守，相互制約，相互為用，以達補而不滯，消而不散的功效。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學對白術、黃芪、枳實的活性成分對帕金森病便秘的作用靶點和機制進行機制初步探討，結果顯示白術-黃芪-枳實組方治療帕金森病便秘，作用靶點最主要的信號通路為MAPK8等，與“扶土為先”理論殊途同歸，提示白術-黃芪-枳實組方可能通過健脾扶土治療帕金森病便秘。