高玉龍 姚現(xiàn)琦 吳 昊 金維忠 盧緒志 陳祥禮 丁國家 王 歡

臨沂金鑼文瑞食品有限公司 山東臨沂 276036

香腸因其美味、營養(yǎng)豐富和方便食用等特點，深受廣大消費者的青睞，是市場上銷量最大的熟肉制品之一[1，2]。目前市售的香腸主要是以肉餡為原料生產(chǎn)的，由于肉類中含有較多的脂肪、膽固醇和熱量，過量攝入會引起一定的健康風險。因此香腸市場亟待開發(fā)迎合當下健康理念的新產(chǎn)品。

大豆蛋白是一種優(yōu)質的植物蛋白，其豐富的營養(yǎng)和保健價值早已為消費者共知。早在1999年10月美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)就公布了大豆蛋白的健康聲明：每天攝入包含25g大豆蛋白的低脂肪低膽固醇的食品，可以明顯地降低患心臟病的風險。自此之后，大豆蛋白及其加工制品逐漸成為眾多科研機構及生產(chǎn)企業(yè)研究開發(fā)的熱點[3]。其中大豆蛋白素腸是以大豆分離蛋白為主要原料制成的一種新型豆制品，其具有營養(yǎng)豐富，不含膽固醇，不含反式脂肪酸的特點，非常符合當代消費者對健康飲食的追求。但是，在大豆蛋白素腸生產(chǎn)的過程中除了進行常規(guī)的熱殺菌外，符合GB 2760-2014的防腐劑只有山梨酸及其鉀鹽、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、丙酸及其鈉鹽、鈣鹽少數(shù)幾種防腐劑[4]。由于食品衛(wèi)生安全標準不斷提高，在現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝下就出現(xiàn)了微生物控制難的問題。

本研究是在GB 2760-2014允許食用的防腐劑范圍內(nèi)，通過防腐劑的復配，達到控制微生物生長并降低防腐劑用量，提高食品安全性并降低企業(yè)生產(chǎn)成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山梨酸鉀，食品級，金能科技股份有限公司；

丙酸鈣，食品級，山東省同泰維潤食品科技有限公司；

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，食品級，浙江新銀象生物工程有限公司；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平JH3100-2，北京京衡偉業(yè)科技有限公司；

斬拌機BZBJ-40，中國艾博公司；

真空攪拌機KRJB-150，嘉興市凱潤機械制造有限公司；

填充機BHDK-2008，北京航天東方科技公司；

生化培養(yǎng)箱LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司；

恒溫震蕩培養(yǎng)箱ZHWY-2102C，上海志誠設備公司；

立式蒸汽滅菌鍋DGL-50B，江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司；

超凈工作臺BBS-DDC，濟南鑫貝西生物技術有限公司；

PH計PHS-3C，上海雷磁；

紫外可見分光光度計UV-2550，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 腐敗菌的分離鑒定與增菌

取室溫下腐敗變質的大豆蛋白素腸產(chǎn)品1g，切碎，放入盛有10mL無菌水的離心管中，密封，震蕩10min,使用無菌濾紙過濾除去殘渣，保留菌液備用，采用稀釋涂布平板法將菌液涂布到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，此實驗全程在無菌操作條件下進行，涂布均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。根據(jù)菌落形態(tài)特征，從含菌平板上挑取形態(tài)特征不同的單個菌落，進行平板劃線并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察單個菌落形態(tài)，如色澤、大小、邊緣整齊與否等,挑取菌種進行革蘭氏染色[5],并在顯微鏡下觀察染色情況[6]。挑取菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃，150r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中增菌16～18h，將菌液用無菌水稀釋一定的倍數(shù)，采用血球計數(shù)板計數(shù)，得出菌體濃度，并將培養(yǎng)液稀釋成菌體濃度為107cfu/ml的菌懸液，4℃冰箱暫存?zhèn)溆肹7]。

1.2.2 防腐劑添加限量分析

根據(jù)GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》對大豆蛋白素腸中防腐劑的添加限量總結如下表1。

表1 不同防腐劑在大豆蛋白素腸產(chǎn)品中使用限量

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

將山梨酸鉀、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、丙酸鈣用無菌水配制成質量濃度為30mg/mL的溶液，無菌過濾，4℃保存?zhèn)溆?。測定大豆蛋白素腸正常產(chǎn)品的pH值為6.1～6.5之間[8]，并相應的將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至相應的值，分裝至250mL錐形瓶中，100mL/瓶，滅菌后備用。

將山梨酸鉀母液分別加入到滅菌后的培養(yǎng)基中，使山梨酸鉀(山梨酸計)的最終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL。

將ε-聚賴氨酸鹽酸鹽母液分別加入到滅菌后的培養(yǎng)基中，使ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的最終濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mg/mL。

將丙酸鈣母液分別加入到滅菌后的培養(yǎng)基中，使丙酸鈣(以丙酸計)的最終濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50mg/mL。

在上述培養(yǎng)基中分別接入1mL菌懸液，每個濃度3個平行，37℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24h,用無菌水代替防腐劑作為陽性對照，用液體培養(yǎng)基代替菌液作為陰性對照。以空白參比為陰性對照，在620nm波長處測OD值。

1.2.4 防腐劑的復配

根據(jù)最小抑菌濃度試驗結果，針對大豆蛋白素腸腐敗菌，選取抑菌效果較好的若干種防腐劑，進行復配。以山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽為例，分別取1/2、1/4、1/8MIC 3個濃度水平，設計營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的防腐劑添加量，并相應的將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.1～6.5，分裝至250mL錐形瓶中，100mL/瓶，滅菌后備用。接種、培養(yǎng)基檢測方法與最小抑菌濃度(MIC)的測定中相同。

通過公式計算出部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)來判斷2種防腐劑相互作用。

(1)

其中，MICAalone和MICBalone分別表示2種化合物A和B單獨使用的時候的MIC值，CAcomb和CBcomb為2種化合物聯(lián)合使用時達到相同藥效(等效位點)時各自的濃度。當FICI≤0.5，證明2種防腐劑對于測定菌株有協(xié)同作用，當FICI指數(shù)為0.5～1時，2種防腐劑相加作用；當FICI指數(shù)大于l且小于2時，2種防腐劑為無關作用；當FICI指數(shù)大于2時，2種防腐劑為拮抗作用[9]，F(xiàn)ICI越小，2種防腐劑復配的協(xié)同作用就越強。

1.2.5 復配防腐劑延長產(chǎn)品貨架期驗證

將具有協(xié)同增效作用的復配防腐劑組合按照相同的添加量添加到大豆蛋白素腸中。同時以添加MIC濃度單一品種防腐劑作為對照，常溫下進行貨架期驗證。大豆蛋白素腸按照正常生產(chǎn)工藝制作，使用PVDC腸衣填充，107℃殺菌30min，每組試驗30支平行樣品，以是否發(fā)生漲袋作為判斷貨架期的標準，每天觀察記錄漲袋情況。

2 結果與討論

2.1 腐敗菌的分離與初步鑒定

通過單菌落分離和菌種純化共獲得腐敗菌3株：fb1、fb2、fb3，將其活化后，稀釋涂布在平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后觀察單個菌落形態(tài)，如色澤、大小、邊緣整齊度等。同時挑取單個菌落進行革蘭氏染色并進行鏡檢，結果如表2。

表2 腐敗菌鑒定結果

2.2 不同防腐劑最小抑菌濃度(MIC)的確定

山梨酸鉀對腐敗菌的最小抑菌濃度見表3。

表3 山梨酸鉀(以山梨酸計)對腐敗菌的最小抑菌濃度

本研究通過對比不同山梨酸鉀添加量對3株腐敗菌生長抑制情況的研究，獲得如表3所示的結果：山梨酸鉀對腐敗菌fb1的MIC為0.9mg/mL，對fb2和fb3的MIC的最小抑菌濃度都為0.7mg/mL。由此分析得出山梨酸鉀對fb2和fb3的抑菌效果明顯好于對fb1的抑菌效果，腐敗菌fb1對于山梨酸鉀具有更強的耐受性。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對腐敗菌的最小抑菌濃度見表4。

表4 ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對腐敗菌的最小抑菌濃度

通過對不同梯度濃度的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽下腐敗菌fb1、fb2和fb3的生長情況的比較，獲得如表4所示的結果：ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對腐敗菌fb1的MIC為0.18mg/mL，對腐敗菌fb2的MIC為0.24mg/mL，對腐敗菌fb3的MIC為0.21mg/mL；腐敗菌fb1、fb2和fb3對ε-聚賴氨酸鹽酸鹽耐受性為fb2>fb3>fb1。

丙酸鈣對腐敗菌的最小抑菌濃度見表5。

表5 丙酸鈣(以丙酸計)腐敗菌的最小抑菌濃度

通過比較不同梯度濃度的丙酸鈣對腐敗菌fb1、fb2和fb3的抑制情況，得出如表5的結果：丙酸鈣對腐敗菌fb1的MIC為2.5mg/mL，對腐敗菌fb2的MIC為2.25mg/mL，對腐敗菌fb3在允許添加量范圍內(nèi)不能起到抑菌作用。產(chǎn)生上述結果的原因，推測為丙酸鈣是酸型食品防腐劑，在酸性條件下，產(chǎn)生游離丙酸，具有抗菌作用，其抑菌作用受環(huán)境pH值的影響，pH值6.0時抑菌能力明顯降低[10]，在植物蛋白素腸的pH值范圍內(nèi)(6.1～6.5)，防腐抑菌效果較低。

2.3 復配防腐劑對腐敗菌的抑制作用

由以上實驗結果得出，單一的防腐劑，不能夠對所有的大豆蛋白素腸腐敗菌產(chǎn)生良好的抑菌效果，需要將不同的防腐劑進行復配才能獲得提高抑菌能力降低防腐劑添加量的效果。本研究在上述實驗結果的基礎上選擇效果相對較好的山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽進行復配，并分別測定對3株腐敗菌fb1、fb2、fb3的抑制能力。

由上表6～表9得出，不同的山梨酸鉀與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復配濃度組合對于fb1、fb2、fb3具有不同的抑制作用，當山梨酸鉀與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽分別最小抑菌濃度為1/8和1/2、1/8和1/4、1/8和1/8時不能抑制fb1的生長，在1/8和1/4、1/8和1/8時對fb1的抑制具有協(xié)同增效作用；當山梨酸鉀與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽分別最小抑菌濃度的1/2和1/8、1/4和1/8、1/8和1/8時不能抑制fb2的生長，在1/4和1/4、1/8和1/4時對fb2的抑制具有協(xié)同增效作用；當山梨酸鉀與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽分別最小抑菌濃度的1/8和1/4、1/8和1/8時不能夠抑制fb3的生長，在1/4和1/4、1/4和1/8時對fb3的抑制具有協(xié)同增效作用。

表6 山梨酸鉀(以山梨酸計)與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復配對fb1的抑菌效果Table 6 The inhibitory effect of potassium sorbate (based on sorbic acid) and ε- polylysine hydrochloride on fb1

表7 山梨酸鉀(以山梨酸計)與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復配對fb2的抑菌效果

表8 山梨酸鉀(以山梨酸計)與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復配對fb3的抑菌效果

表9 山梨酸鉀(以山梨酸計)與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的復配抑菌活性

2.4 復配防腐劑延長貨架期驗證結果

本研究選擇上述實驗中，對腐敗菌具有協(xié)同增效作用的山梨酸鉀與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度組合，與添加MIC濃度的單一品種防腐劑作對比試驗，以不添加任何防腐劑產(chǎn)品為空白對照，常溫條件下儲藏進行貨架期驗證試驗得到如表10所示的結果。

表10 不同復配防腐劑組合與單一品種防腐劑延長貨架期對比

由表10得出，添加單一品種的防腐劑，能夠起到一定的防腐效果，例如，添加0.9mg/g的山梨酸鉀(以山梨酸計)，能夠將大豆蛋白素腸的貨架期，由空白對照的60.15d延長到93.21d；添加0.24mg/g的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽可以將大豆蛋白素腸產(chǎn)品的貨架期延長到98.48d，但是添加單一品種的防腐劑，往往會出現(xiàn)添加量大，但防腐效果卻相對較差的缺點。本研究出的添加0.175mg/g山梨酸鉀+0.06mg/g ε-聚賴氨酸鹽酸鹽可以將貨架期延長到120.45d,添加0.175mg/g山梨酸鉀+0.0525mg/g ε-聚賴氨酸鹽酸鹽也能夠將貨架期延長到107.49d，其他復配組合也能夠達到與單一品種防腐劑接近的效果，與此同時防腐劑的相對添加量卻大大降低。

3 結論

隨著食品安全標準的不斷提高以及消費者對于食品安全的重視，有效并且安全的防腐技術正越來越成為食品研究機構的研究熱點。本研究通過分離大豆蛋白素腸腐敗菌并有針對性地篩選驗證在GB2760-2014中允許添加的3種防腐劑的防腐性能，在此基礎上通過復配，獲得的復配防腐劑不僅能夠起到延長貨架期的效果，還能夠降低防腐劑的相對添加量，在提高了食品安全性的同時，降低了食品生產(chǎn)企業(yè)的成本。同時本研究中針對特定腐敗菌研究并優(yōu)化防腐劑配比的方法，也較大的縮短了試驗和開發(fā)周期，對其他種類產(chǎn)品專用防腐劑的開發(fā)有一定的借鑒價值。