蘇佳欣 高汝勇 馬彥榮 孫如月 董 瑜 呂亞慈

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北 衡水 053000）

銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素，是細(xì)胞色素氧化酶、多酚氧化酶以及抗壞血酸氧化酶等多種酶類的組成成分之一，同時(shí)銅元素也是各種氧化酶活性的核心元素[1]；但過(guò)量的銅會(huì)影響植物的生長(zhǎng)，土壤中含過(guò)量銅會(huì)對(duì)植物新根生長(zhǎng)造成抑制，使根尖硬化，吸收能力減弱，植株生長(zhǎng)也會(huì)受到影響[2]。

燕麥俗稱油麥、玉麥，是一種低糖、高蛋白質(zhì)、高脂肪、高能量食品，其營(yíng)養(yǎng)成分含量高，質(zhì)量?jī)?yōu)。我國(guó)對(duì)燕麥的需求量較大，目前對(duì)燕麥的研究尚屬起步階段，大部分是針對(duì)其生物學(xué)特性與栽培、加工工藝等進(jìn)行的研究，針對(duì)重金屬對(duì)燕麥的毒害研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，開(kāi)展重金屬脅迫對(duì)燕麥遺傳毒性的研究很有必要。本試驗(yàn)探究不同濃度的銅對(duì)燕麥植物根尖細(xì)胞造成的影響，從細(xì)胞的水平分析硫酸銅對(duì)燕麥根尖細(xì)胞染色體畸變、微核率、有絲分裂的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料。燕麥材料：白燕2號(hào)(由張家口市農(nóng)科院提供)；硫酸銅(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，用蒸餾水分別配制0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L等不同濃度的硫酸銅溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)。將白燕2號(hào)種子洗干凈，用0.1%氯化汞消毒10～15 min，浸泡2～24 h，放入白瓷盤中，置于烘箱中25℃培養(yǎng)生根。

1.2.2 試驗(yàn)處理。待種子初生根長(zhǎng)到1～2 cm時(shí)，挑選飽滿、生命力旺盛的種子，分別放入濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L的硫酸銅中，并分別處理6 h、12 h、24 h、48 h，以蒸餾水作對(duì)照。選擇燕麥種子生命力較旺盛的幼根，將根尖剪下來(lái)放入卡諾氏固定液中(V無(wú)水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)固定2～24 h，用70%的乙醇保存。試驗(yàn)時(shí)用1 mol/L的鹽酸水解5～10 min。改良品紅室溫下染色15 min，常規(guī)壓片、鏡檢，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，每個(gè)處理觀察10～15個(gè)根尖(隨機(jī)選擇)，至少5 000～6 000個(gè)細(xì)胞，典型圖像用顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理及評(píng)價(jià)方法

1.3.1 指標(biāo)計(jì)算。細(xì)胞分裂指數(shù)=(分裂細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù))×100%；微核率=(出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)/間期細(xì)胞總數(shù))×100‰；染色體畸變率=(畸變細(xì)胞數(shù)/分裂期細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析。用SPSS(spss for windows)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銅處理對(duì)燕麥根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響。如表1所示，本試驗(yàn)中設(shè)置5個(gè)不同濃度的硫酸銅，并且每個(gè)濃度又分不同時(shí)間處理燕麥根尖，結(jié)果顯示，各處理燕麥根尖的分裂指數(shù)均高于對(duì)照。燕麥根尖有絲分裂指數(shù)隨著硫酸銅濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)受到抑制，且與對(duì)照相比有差異(表1)。隨著硫酸銅濃度的增大，燕麥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。同一濃度隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，除800 mg/L外，有絲分裂指數(shù)呈上升趨勢(shì)。

表1 硫酸銅處理對(duì)燕麥根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響 (%)

2.2 硫酸銅處理對(duì)燕麥根尖微核千分率的影響。由表2可知，不同濃度的硫酸銅對(duì)燕麥根尖細(xì)胞微核有顯著的影響。試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，微核畸變率有顯著的差異，當(dāng)硫酸銅濃度是400 mg/L時(shí)，染色體微核率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)極度上升的趨勢(shì)。同一處理時(shí)間，細(xì)胞的微核千分率隨著硫酸銅濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在硫酸銅濃度達(dá)到400 mg/L時(shí)，微核率千分率最大。濃度在400 mg/L以內(nèi)時(shí)，微核千分率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到800 mg/L，48 h時(shí)，微核千分率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降的趨勢(shì)。

表2 硫酸銅處理對(duì)燕麥根尖細(xì)胞微核千分率的影響(‰)

2.3 硫酸銅處理對(duì)燕麥根尖分生區(qū)細(xì)胞畸變率的影響。不同濃度的硫酸銅均可導(dǎo)致多種類型的染色體畸變，常見(jiàn)的染色體畸變類型有染色體橋、染色體粘連、染色體滯后、染色體不同步、染色體蓬松、染色體不均等分裂。由表3可以看出，相同時(shí)間內(nèi)染色體畸變率隨硫酸銅濃度的升高而呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)；在同一濃度時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)染色體畸變率升高。當(dāng)硫酸銅濃度達(dá)到800 mg/L時(shí)，染色體畸變率急劇升高，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他濃度的畸變率。

表3 硫酸銅處理對(duì)燕麥根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響(%)

3 結(jié)論與討論

植物從土壤中吸收的銅主要聚集在根部。銅污染對(duì)植物根系有直接的毒害作用，導(dǎo)致植物根系新陳代謝過(guò)程紊亂[3]。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，有絲分裂最旺盛的是根尖部位，也是植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素及重金屬污染受害最敏感區(qū)域。研究表明，植物銅中毒的主要癥狀為抑制種子的萌發(fā)，根系變短，外形畸變等[4]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也表明了高濃度硫酸銅對(duì)植物生長(zhǎng)有抑制作用。倪才英[5]在研究土壤銅污染對(duì)紫云英的毒害時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界銅超過(guò)植物所承受的濃度時(shí)，紫云英根尖扭曲腐爛，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)壁分離，原生質(zhì)被破壞，本試驗(yàn)結(jié)果和倪才英的研究結(jié)果是一致的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，重金屬銅脅迫對(duì)燕麥根尖細(xì)胞的分裂指數(shù)、微核數(shù)、分裂期細(xì)胞的染色體畸變率存在著顯著影響。燕麥根尖隨著硫酸銅處理濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，微核率、染色體畸變率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到200～400 mg/L時(shí)，銅元素對(duì)燕麥根尖細(xì)胞分裂是有促進(jìn)作用的，當(dāng)濃度達(dá)到800 mg/L時(shí)，燕麥根尖表現(xiàn)出有絲分裂指數(shù)、微核率降低。過(guò)量的銅對(duì)燕麥根尖的有絲分裂毒害超過(guò)了植物的自身保護(hù)作用，使細(xì)胞中酶的活性降低，導(dǎo)致DNA合成速率減慢，分裂間期延長(zhǎng)。高濃度的硫酸銅有誘發(fā)染色體畸變的作用，因?yàn)檩^高濃度的硫酸銅不僅對(duì)細(xì)胞的畸變有影響，而且能阻止細(xì)胞紡錘絲的微管蛋白聚合。

通過(guò)對(duì)不同濃度銅離子對(duì)燕麥根尖染色體的毒害作用進(jìn)行研究，了解了重金屬銅脅迫對(duì)植物遺傳毒性的影響。但是針對(duì)銅離子對(duì)分裂間期蛋白質(zhì)的合成，與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、染色體運(yùn)動(dòng)有關(guān)的蛋白質(zhì)和酶的關(guān)系，還有待于進(jìn)一步探究。