鄧哲 歐陽(yáng)昭廣 胡玉星 馮婷 陳錚甲 寧迪敏 張博宇 雷宜晨 劉華 田雪飛

〔摘要〕 目的 觀(guān)察薯蕷丸對(duì)腫瘤微環(huán)境中HIF-1α與p53的表達(dá)以及線(xiàn)粒體損傷的影響，及其對(duì)肝細(xì)胞癌的治療作用。方法 制備人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，雄性BALB/c裸鼠（n=24， 5周齡），隨機(jī)分為4組，每組6只：模型組（0.9%生理鹽水0.2 mL/d）、薯蕷丸組（薯蕷丸0.4 g/d），薯蕷丸+順鉑組（薯蕷丸0.4 g/d+每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）、順鉑組（每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）。每只裸鼠灌胃劑量為0.2 mL/d，每2天測(cè)量1次腫瘤體積與小鼠體質(zhì)量，連續(xù)干預(yù)14 d后脫頸處死，剝離皮下移植瘤;電鏡下觀(guān)察腫瘤組織線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量;Western blot與RT-qPCR法分別檢測(cè)人肝癌裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α、p53的蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，薯蕷丸組可抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，抑制HIF-1α的mRNA與蛋白表達(dá)（P<0.05），上調(diào)抑癌基因p53的mRNA與蛋白表達(dá)（P<0.05），同時(shí)改善線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)損傷;與薯蕷丸組或順鉑組相比，薯蕷丸聯(lián)合順鉑組對(duì)HIF-1α、p53基因表達(dá)及改善線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)作用更顯著（P<0.05）。結(jié)論 薯蕷丸可通過(guò)促使HIF-1α的失活與p53的活化，改善線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)損傷，從而抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，與順鉑聯(lián)用后具有協(xié)同增效作用。

〔關(guān)鍵詞〕 肝癌;腫瘤微環(huán)境;薯蕷丸;線(xiàn)粒體損傷;HIF-α;p53

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.007

〔Abstract〕 Objective To evaluate the effect of Shuyu Pills on the expression of HIF-1α and p53 in tumor microenvironment and mitochondrial damage， and therapeutic effect on treating hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The subcutaneously transplanted tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice was prepared. Male BALB/c nude mice （n=24， 5 weeks old） were randomly divided into 4 groups with 6 mice in each group： model group （administered normal saline， 0.2 mL/d）， SYP group （0.4 g/d Shuyu Pills）， SYP+DDP group （0.4 g/d Shuyu Pills + weekly intraperitoneal dose of 5 mg/kg cisplatin）， DDP group （weekly intraperitoneal dose of 5 mg/kg cisplatin）. Each mouse was taken 0.2 mL drug via gavage every day. The tumor volume and body weight of mouse were measured every 2 days. After continuous intervention for 14 days， all the mice were sacrificed by neck removal and subcutaneous graft tumor was removed; the structure and quantity of mitochondria in tumor tissues were observed by electron microscopy; the protein and mRNA expression levels of HIF-1α and p53 of tumor were detected by Western blot and RT-qPCR. Results Compared with model group， SYP group inhibited the growth of subcutaneous transplanted tumor of HCC in nude mice， inhibited the mRNA and protein expression of HIF-1α （P<0.05）， upregulated the mRNA and protein expression of tumor suppressor gene p53 （P<0.05）， and improved the mitochondrial structure damage; compared with SYP group or DDP group， SYP+DDP group improved the expression of HIF-1α and p53 genes and mitochondrial structure significantly （P<0.05）. Conclusion Shuyu Pills could inhibit the growth of subcutaneously transplanted human HCC in nude mice， which might inactivate HIF-1α and activate p53， to improve mitochondrial structural damage， combined with cisplatin， Shuyu Pills has synergistic effect.

〔Keywords〕 hepatocellular carcinoma; tumor microenvironment; Shuyu Pills; mitochondrial damage; HIF-1α; p53

肝細(xì)胞癌（hepatocarcinoma， HCC）是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率分別位居全球惡性腫瘤第6位與第4位[1]。缺氧是實(shí)體瘤中的常見(jiàn)現(xiàn)象，可誘導(dǎo)腫瘤能量代謝重編程[2]。代謝異常是腫瘤的重要特征，正常細(xì)胞在氧氣充足的情況下利用線(xiàn)粒體的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量，而在氧氣不足的情況下則轉(zhuǎn)變?yōu)槔锰墙徒獾姆绞?。在多?shù)腫瘤中，無(wú)論處于有氧還是缺氧環(huán)境，都要保證一定程度的糖酵解反應(yīng)作為產(chǎn)能方式，這被稱(chēng)為有氧糖酵解過(guò)程，即Warburg效應(yīng)，也是腫瘤細(xì)胞獨(dú)有的代謝特征之一[3]。腫瘤細(xì)胞糖酵解過(guò)程不僅為腫瘤細(xì)胞提供維持生長(zhǎng)的能量，其合成的乳酸、核苷酸等一系列產(chǎn)物還為腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程提供了必需的內(nèi)源性生物原料[4]。也有研究[5]認(rèn)為是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞中線(xiàn)粒體含量減少了20%～50%的原因?qū)е翺XPHOS的降低，這一理論進(jìn)一步擴(kuò)展支持了Warburg的假說(shuō)。線(xiàn)粒體的代謝受一系列基因的調(diào)控，腫瘤發(fā)生的早期處于缺氧微環(huán)境，使得HIF-1、p53、NF-κB等基因的表達(dá)變化，導(dǎo)致線(xiàn)粒體的氧化磷酸化受到抑制，細(xì)胞主要以糖酵解的形式獲得能量[6-7]。肝臟作為一個(gè)高度再生的器官，肝細(xì)胞中包含大量的線(xiàn)粒體以供能，線(xiàn)粒體代謝重編程在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，肝臟線(xiàn)粒體代謝異常是公認(rèn)的致癌因素之一[8]。因此，抑制腫瘤缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，改善線(xiàn)粒體的損傷，有助于抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，恢復(fù)線(xiàn)粒體的氧化磷酸化功能，抑制腫瘤的進(jìn)展。

低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1α）是HCC細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，影響HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生、耐藥、凋亡等過(guò)程[9-10]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的表達(dá)可降低線(xiàn)粒體的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞氧耗的減少。另外，抑癌基因p53的突變、表達(dá)下調(diào)或缺失，也可作用于線(xiàn)粒體代謝，使線(xiàn)粒體呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒饽Ｊ絒11]。因此，抑制HIF-1α的表達(dá)與p53的失活，有望改善肝癌細(xì)胞線(xiàn)粒體代謝重編程，抑制糖酵解的發(fā)生。研究[12]發(fā)現(xiàn)，脾虛模型大鼠中多器官的線(xiàn)粒體含量明顯減少，形狀異常，結(jié)構(gòu)紊亂，基質(zhì)改變。通過(guò)改善脾虛進(jìn)而改善線(xiàn)粒體在臟器中的合成與代謝，有望從改善代謝方式的角度控制腫瘤的進(jìn)展。而線(xiàn)粒體生物合成、能量代謝功能的正常發(fā)揮與中醫(yī)“脾為后天之本”的功能密切相關(guān)[12-13]，薯蕷丸出自東漢張仲景《金匱要略·血痹虛勞病》：“虛勞諸不足，風(fēng)氣百疾，薯蕷丸主之”，功用健脾益氣和營(yíng)，因脾氣虧虛導(dǎo)致的虛勞百疾皆可用之?，F(xiàn)代研究[14-15]表明，薯蕷丸具有改善能量代謝與免疫功能、輔助治療腫瘤等多個(gè)方面的作用。為了探究薯蕷丸是否通過(guò)保護(hù)線(xiàn)粒體發(fā)揮調(diào)控HCC細(xì)胞能量代謝的作用，我們將薯蕷丸與順鉑聯(lián)合運(yùn)用，通過(guò)研究薯蕷丸對(duì)代謝相關(guān)基因HIF-1α與p53的調(diào)控，以及線(xiàn)粒體損傷的影響，觀(guān)察其對(duì)HCC的輔助治療作用。

1 材料與方法

1.1 ?主要試劑

胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T1320）;高糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：AE29005267）;胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)：2176404）;水合氯醛（貨號(hào)：20180622）、無(wú)水乙醇（貨號(hào)：GB/T678-2002）（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;青霉素（貨號(hào)：408G021）、鏈霉素（貨號(hào)：70100900）（北京索萊寶科技有限公司）;環(huán)氧丙烷（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，貨號(hào)：M25514）;鋨酸（貨號(hào)：18456）、DDSA（貨號(hào)：18022）、NMA（貨號(hào)：18032）、DMP30（貨號(hào)：18042）（美國(guó)TED PELLA INC公司）;戊二醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DF0156）;HIF-1α小鼠抗人單克隆抗體（貨號(hào)：ab1）、p53小鼠抗人單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab26）;β-actin小鼠抗人單克隆抗體（美國(guó)proteintech公司，貨號(hào)：66009-1-Ig）;HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（美國(guó)proteintech公司，貨號(hào)：SA00001-1）;RIPA裂解液（中國(guó)上海碧云天有限公司，貨號(hào)：P0013B）;SuperECL Plus超敏發(fā)光液（美國(guó)Advansta公司，貨號(hào)：K-12045-D50）;顯影液（貨號(hào)：BW-61）、定影液（貨號(hào)：BW-62）（中國(guó)上海佳信公司）;TEMED（中國(guó)上海阿拉丁公司，貨號(hào)：T105497）;SDS（貨號(hào)：MB2479）、EDTA（中國(guó)大連美倫生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：MB2514）;瓊脂糖（西班牙BIOWEST公司，貨號(hào)：111860）;mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：CW2569）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：CW2141）、上樣緩沖液（貨號(hào)：CW0610）、UltraSYBR Mixture（貨號(hào)：CW2601）、DM2000 Plus DNA Marker（貨號(hào)：CW0632）（中國(guó)北京康為世紀(jì)公司）;Tris（貨號(hào)：V900483）、DEPC（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：D5758）;Trizol（美國(guó)Thermo公司，貨號(hào)：15596026）;核酸染料（中國(guó)北京普利萊，貨號(hào)：PB11141）。

1.2 ?藥物

薯蕷丸使用中藥配方顆粒，藥物組成及生產(chǎn)批號(hào)：山藥（0090443）24 g，當(dāng)歸（0103203） 6 g，桂枝（0116553） 6 g，建曲（0091033） 6 g，生地黃（0113523） 12 g，人參（0115203） 6 g，炙甘草（0112233） 12 g，川芎（0125883） 6 g，白芍（0121933） 6 g，白術(shù)（0111433） 6 g，麥冬（0121693） 6 g，苦杏仁（0112663） 6 g，柴胡（0110723） 6 g，桔梗（0101183） 3 g，茯苓（0110753） 6 g，阿膠（0112143） 6 g，干姜（0115493） 3 g，防風(fēng)（0101983） 6 g，白蘞（0086073） 6 g，大棗（0111143）24 g，所有藥物購(gòu)自廣東一方制藥有限責(zé)任公司。將藥物用溫水溶解后，振蕩制備成混懸液。根據(jù)薯蕷丸的藥理學(xué)劑量規(guī)定，成人薯蕷丸日劑量為156 g/d，小鼠體質(zhì)量約為20 g，根據(jù)人鼠體表面積換算，小鼠給藥劑量為0.4 g/d。順鉑注射液（DDP）（齊魯制藥有限公司，貨號(hào)9E0214B02）：5 mg/kg，每周1次，腹腔注射。

1.3 ?細(xì)胞與動(dòng)物分組

采用HCC細(xì)胞株SMMC-7721，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。BALB/c無(wú)胸腺裸鼠（雄性，5周齡），購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005），所有動(dòng)物飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體（specific pathogen free， SPF）級(jí)環(huán)境中，可自由地獲取食物和水，并進(jìn)行12 h/12h的明/暗循環(huán)。將1×107個(gè)SMMC-7721細(xì)胞接種于每只裸鼠右上肢后側(cè)，建立人HCC裸鼠皮下移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)從可觸及裸鼠皮下移植瘤開(kāi)始（腫瘤體積約為100 mm3），造模成功后，隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為：模型組（0.9%生理鹽水0.2 mL/d）、薯蕷丸組（薯蕷丸0.4 g/d）、薯蕷丸+順鉑組（薯蕷丸0.4 g/d+每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）、順鉑組（每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）。每只裸鼠灌胃劑量為0.2 mL/d。

1.4 ?觀(guān)察指標(biāo)

1.4.1 ?腫瘤體積測(cè)定 ?每2天測(cè)量1次腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為：（最大腫瘤長(zhǎng)度×寬度2）/2[16]。連續(xù)干預(yù)14 d后，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：福利倫理審查指南》[17]對(duì)小鼠進(jìn)行頸椎脫位安樂(lè)死，剝離皮下移植瘤并進(jìn)行檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均得到悉心照料，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4.2 ?透射電子顯微鏡成像 ?為了檢測(cè)線(xiàn)粒體的超微結(jié)構(gòu)變化，在用薯蕷丸或順鉑處理14 d后，收集人HCC裸鼠皮下移植瘤組織用于樣品制備。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）固定;取1 cm3組織塊若干塊，在4 ℃下用2.5%戊二醛在黑暗中進(jìn)行12 h的初次固定，然后將組織在1%鋨酸中固定1 h。（2）脫水：在分級(jí)乙醇系列（30%、50%、70%、80%、95%和100%）和環(huán)氧丙烷中進(jìn)行脫水。（3）浸透：在環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹(shù)脂中浸泡2 h，然后純環(huán)氧樹(shù)脂中浸泡3 h。（4）包埋：用純環(huán)氧樹(shù)脂包埋后入40 ℃烤箱烘烤12 h和60 ℃烤箱烘烤48 h。（5）切片：使用徠卡Ultracut UCT切片機(jī)以80 nm切片厚度用金剛石刀具切割超薄切片，將切片置于300目銅網(wǎng)上。（6）染色：電子染色（鉛、鈾染色）。（7）拍照：日立7700型透射電鏡觀(guān)察，用數(shù)碼相機(jī)記錄圖像。

1.4.3 ?Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 ?采用Western blot方法檢測(cè)人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α與p53的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）蛋白提取：剪取25 mg組織，用冰預(yù)冷PBS洗滌組織，加入300 μL RIPA裂解液以裂解10 min;離心后將上清液轉(zhuǎn)移入離心管。（2）制膠：在10%分離膠中加入TEMED后立即搖勻灌膠，異丙醇封膠。膠凝后倒去膠上層異丙醇并用濾紙將其吸干。在4.8%濃縮膠中加入TEMED后搖勻灌膠。將梳子插入玻璃板中，剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠，等待膠凝固。（3）樣品準(zhǔn)備：在200 μL蛋白上清中加入50 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，冰盒速冷備用。（4）電泳：據(jù)蛋白定量結(jié)果，第一孔點(diǎn)入marker 2 μL，其他每孔上樣50 μg已變性蛋白。開(kāi)始電泳，電泳恒定電壓75 V，時(shí)間為130 min。待溴酚藍(lán)電泳至膠底部，終止電泳。（5）轉(zhuǎn)膜：分別切膠PD-1（50-55 kDa）、PD-L1（33 kDa）、CD4（55 kDa）、CD8（35 kDa）、 HIF-1α（120 kDa）、p53（53 kDa）、β-actin（42 kDa）。（6）封閉：用1×PBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后室溫靜置60 min，在4 ℃下過(guò)夜后室溫靜置30 min。（7）一抗孵育：加入一抗Mouse anti-HIF-1α antibody（ab1），1∶200;Mouse anti-HIF-1α antibody（ab26），1∶500;Mouse anti-β-actin antibody（66009-1-Ig），1∶5 000，室溫放置90 min。孵育結(jié)束后用1×PBST洗3次，每次15 min。（8）二抗孵育：加入二抗（HRP goatanti-mouse IgG， SA00001-1，1∶5 000;HRP goat anti-rabbit IgG， SA00001-2，1∶6 000），室溫孵育90 min后，1×PBST洗3次，每次10 min。（9）ECL顯色曝光：使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光后顯影沖洗。

1.4.4 ?RT-qPCR檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 ?采用RT-qPCR法檢測(cè)人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α與p53的mRNA表達(dá)。按照說(shuō)明書(shū)使用TRIzol試劑從SMMC7721細(xì)胞中提取總RNA。然后以總mRNA為模板，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。定量PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線(xiàn)分析：60～95 ℃。引物設(shè)計(jì)：在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成引物。使用的引物如下：β-actin：F-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC和R-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC，基因產(chǎn)物223 bp;P53：F-CCCCTGTCATCTTTTGTCCCT和R-AGCTGGCAGAATAGCTTATTGAG，基因產(chǎn)物137 bp;HIF-1α：F-TCCAGCAGACCCAGTTACAGA和R-GCCACTGTATGCTGATGCCTT，F(xiàn)-GCACCCCAAGGCAAAAATCG，基因產(chǎn)物182 bp。

1.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)樣本均重復(fù)3次，計(jì)量資料以“x±s”表示。用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較，多組比較采用單因素方差分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用LSD方法檢驗(yàn)判定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?薯蕷丸對(duì)人HCC裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

體外腫瘤生長(zhǎng)圖顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯(lián)合順鉑組的瘤體皆有縮小。與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯(lián)合順鉑組、順鉑組腫瘤體積縮小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與薯蕷丸組或順鉑組相比，薯蕷丸聯(lián)合順鉑組對(duì)腫瘤體積的抑制作用增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 ?薯蕷丸對(duì)HIF-1α、p53基因蛋白及mRNA表達(dá)的影響

HIF-1α基因的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、順鉑組中癌基因HIF-1α的蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且薯蕷丸聯(lián)合順鉑組差異更加顯著（P<0.01）。HIF-1α基因的mRNA熒光定量表達(dá)結(jié)果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯(lián)合順鉑組、順鉑組中的HIF-1α的mRNA表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與薯蕷丸組相比，薯蕷丸聯(lián)合順鉑組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。p53基因的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組中p53的蛋白表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且薯蕷丸聯(lián)合順鉑組、順鉑組差異更加顯著（P<0.01）;與薯蕷丸組和順鉑組相比，薯蕷丸聯(lián)合順鉑組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。p53基因的mRNA熒光定量表達(dá)結(jié)果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯(lián)合順鉑組、順鉑組中p53的mRNA熒光定量表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與薯蕷丸組和順鉑組相比，薯蕷丸聯(lián)合順鉑組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 ?線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)觀(guān)察

電鏡下人HCC裸鼠皮下移植瘤中線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)顯示，模型組線(xiàn)粒體數(shù)量較少，線(xiàn)粒體變性，嵴狀結(jié)構(gòu)排列紊亂且大多已斷裂，可見(jiàn)線(xiàn)粒體固縮，膜結(jié)構(gòu)完整;薯蕷丸組線(xiàn)粒體數(shù)量多，線(xiàn)粒體嵴狀結(jié)構(gòu)部分損傷，但可見(jiàn)排列結(jié)構(gòu)，部分線(xiàn)粒體固縮，膜結(jié)構(gòu)完整;薯蕷丸聯(lián)合順鉑組線(xiàn)粒體數(shù)量較多，線(xiàn)粒體嵴狀結(jié)構(gòu)排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，線(xiàn)粒體未固縮，膜結(jié)構(gòu)完整;順鉑組線(xiàn)粒體數(shù)量多，線(xiàn)粒體嵴狀結(jié)構(gòu)部分損傷，但可見(jiàn)排列結(jié)構(gòu)，部分線(xiàn)粒體固縮，膜結(jié)構(gòu)部分損傷。見(jiàn)圖3。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為肝癌的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛因長(zhǎng)期癌毒內(nèi)耗，加之手術(shù)、放化療等損傷性治療，易導(dǎo)致機(jī)體氣血虛衰，臟腑功能衰退，全身代謝功能紊亂，免疫功能低下。治療上，中醫(yī)以“攻補(bǔ)兼施、扶正祛邪”為主要原則[18]。薯蕷丸治療“虛勞諸不足，風(fēng)氣百疾”，根據(jù)脾為后天之本的思想，針對(duì)肝癌本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)，可以將健脾扶正法作為肝癌輔助治療的切入點(diǎn)[19]?，F(xiàn)代研究[20-21]也表明，薯蕷丸及方內(nèi)組分具有抗氧化、改善機(jī)體能量代謝、增強(qiáng)免疫、輔助抗腫瘤等多方面的作用。

缺氧是實(shí)體瘤的重要生物學(xué)特征，腫瘤微環(huán)境缺氧可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變成糖酵解模式，這是腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體代謝重編程的重要表現(xiàn)形式[22]。研究[8]顯示，線(xiàn)粒體的損傷與含量減少是導(dǎo)致氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解模式的原因，而肝臟線(xiàn)粒體代謝異常是重要的致癌因素。腫瘤微環(huán)境的低氧可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體酶的表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致線(xiàn)粒體代謝異常，其機(jī)制可能與 HIF-1α或p53基因的作用有關(guān)[23]。研究[24]顯示，缺氧可通過(guò)過(guò)表達(dá)或穩(wěn)定HIF-1來(lái)促進(jìn)HCC進(jìn)展和侵襲。HIF-1α的表達(dá)可降低線(xiàn)粒體的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞氧耗的減少[5]。研究[25-26]發(fā)現(xiàn)HIF-1α在HCC組織中高表達(dá)，通過(guò)不斷激活與HCC生長(zhǎng)相關(guān)的多種靶基因，參與HCC的微血管新生、能量代謝、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡等過(guò)程，可促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，而抑制HIF-1α表達(dá)有利于控制HCC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。另外，抑癌基因p53可活化PFK-2的亞型-TP53誘導(dǎo)糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子（TIGAR），TIGAR降低了果糖-2，6-磷酸的表達(dá)水平，從而起到抑制糖酵解的作用[5]。但在腫瘤細(xì)胞中，p53基因常出現(xiàn)突變、表達(dá)下調(diào)或缺失，p53的失活可使代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變到糖酵解模式[27-28]。因此，癌基因HIF-1α的活化與抑癌基因p53的失活，可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的缺氧，導(dǎo)致能量代謝從氧化磷酸化向糖酵解的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與線(xiàn)粒體的合成受損相關(guān)，靶向調(diào)控HIF-1α與p53有助于改善線(xiàn)粒體損傷，控制腫瘤的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，薯蕷丸具有抑制人HCC裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的作用，而薯蕷丸與順鉑聯(lián)合運(yùn)用以后，其抑瘤作用更為顯著。為了進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α與抑癌基因p53的表達(dá)，同時(shí)，在電鏡下觀(guān)察了各組皮下移植瘤中線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，薯蕷丸具有抑制缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α與活化抑癌基因p53表達(dá)的作用，同時(shí)改善了線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)破壞，薯蕷丸與順鉑兩者聯(lián)用具有協(xié)同作用。因此，猜測(cè)薯蕷丸可能通過(guò)促使HIF-1α失活與抑癌基因p53活化的作用，進(jìn)一步保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)，改善腫瘤微環(huán)境的能量代謝，從而發(fā)揮抗HCC的作用。此外，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)薯蕷丸與順鉑聯(lián)用以后具有協(xié)同增效作用，有報(bào)道顯示，缺氧微環(huán)境促進(jìn)腫瘤對(duì)放化療抵抗和耐藥[17]。另一方面，研究[29]顯示線(xiàn)粒體參與順鉑的耐藥性，改善線(xiàn)粒體功能可增強(qiáng)順鉑對(duì)腫瘤化療的敏感性。并且，調(diào)控HIF-1α與p53的表達(dá)，有助于控制腫瘤細(xì)胞的順鉑耐藥[30]。因此，薯蕷丸可能通過(guò)調(diào)控HIF-1α與p53改善了腫瘤微環(huán)境的缺氧，并且通過(guò)改善線(xiàn)粒體的功能，增強(qiáng)了HCC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而發(fā)揮了協(xié)同增效的作用，這為我們今后進(jìn)一步對(duì)HCC的化療增敏作用研究提供啟發(fā)。

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