姚小磊 時健 劉倩宏 陳立浩 侯念婷

〔摘要〕 目的 觀察青光安Ⅱ號方對谷氨酸誘導(dǎo)損傷的RGC-5細(xì)胞中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3， BNIP3）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）及丙二醛（malondialdehyde， MDA）的影響。方法 體外培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞，分為4組：空白組、模型組、含藥血清組和阻斷劑組。模型組、含藥血清組和阻斷劑組予以谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，模擬青光眼對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷，含藥血清組加入青光安Ⅱ號方含藥血清，阻斷劑組加入KC7F2進(jìn)行HIF-1α通路的阻斷。以CCK-8法摸索含藥血漿以及谷氨酸的最佳干預(yù)濃度;采用Hoechst法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況;Western blot檢測NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)情況;比色法檢測SOD、MDA的表達(dá)情況。結(jié)果 CCK8法確定青光安Ⅱ號方5倍組含藥血清為實驗量，確定谷氨酸的最佳干預(yù)濃度為200 μM。與空白組比較，模型組NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD、MDA表達(dá)顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，含藥血清組、阻斷劑組NF-κB、HIF-1α、BNIP3和SOD的表達(dá)顯著降低（P<0.05）;含藥血清組與阻斷劑組的NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD及MDA差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 青光安Ⅱ號方對NF-κB具有抑制作用，進(jìn)而抑制了HIF-1α相關(guān)通路的激活，減弱了由于氧化應(yīng)激所致RGC-5細(xì)胞的凋亡，對RGC具有保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 青光眼;青光安Ⅱ號方;視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;核因子κB;低氧誘導(dǎo)因子-1α;BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3;超氧化物歧化酶;丙二醛

〔中圖分類號〕R276.7 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.004

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Qingguangan Ⅱ Formula on nuclear factor kappa-B （NF-κB）， hypoxia inducible factor-1 （HIF-1α）， BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3 （BNIP3）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in RGC-5 cells injury induced by glutamate. Methods The RGC-5 cells cultured in vitro were divided into 4 groups： blank group， model group， drug-containing serum group and blocker group. Glutamic acid was added to model group， drug-containing serum group and blocker group to simulate retinal ganglion cell damage caused by glaucoma， and Qingguangan Ⅱ Formula serum was added to drug-containing serum group， and the blocker group was added with KC7F2 to block the HIF-1α pathway. The CCK-8 method was used to find optimal intervention concentration of drug-containing plasma and glutamate; Hoechst method was used to detect the apoptosis of cells in each group; Western blot was used to detect the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3; colorimetry was used to detect the expression of SOD and MDA. Results CCK8 method determined 5 times serum content as the Qingguangan Ⅱ Formula experimental amount， and the optimal intervention concentration of glutamate was 200 μM. Compared with blank group， the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3， SOD and MDA increased significantly in the model group （P<0.05）; compared with the model group， the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3 and SOD in the drug-containing serum group and blocker group significantly decreased （P<0.05） ; there was no statistically significant difference between NF-κB， HIF-1α， BNIP3， SOD and MDA in drug-containing serum group and blocker group （P>0.05）. Conclusion Qingguangan II Formula has an inhibitory effect on NF-κB， thereby inhibiting the activation of HIF-1α related pathways， reducing the apoptosis of RGC-5 cells caused by oxidative stress， it also has a protective effect on RGC.

〔Keywords〕 Qingguangan Ⅱ Formula; retinal ganglion cell; nuclear factor kappa-B; hypoxia inducible factor-1; BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3; superoxide dismutase; malondialdehyde

青光眼為導(dǎo)致人類失明的三大眼類疾病之一。調(diào)查顯示，2020年全球青光眼患病人數(shù)高達(dá)7 600萬，其中我國占2 100萬，位居世界之首[1]，目前，超過40歲以上人群青光眼的總患病康復(fù)率僅有1.5%～3.6%[2]，治療方案主要以控制眼壓來保存視力，但是青光眼導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷卻不可逆，且沒有較好的視神經(jīng)保護(hù)方案。彭清華教授通過多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出“青光安Ⅱ號方”，研究表明其有較好的臨床療效，尤其對青光眼術(shù)后仍存在視力下降的患者，有較好的視神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[3]，但其具體的機(jī)制并不清楚。動物實驗中發(fā)現(xiàn)青光安Ⅱ號方對于Caspase-3有影響，可減少視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[4]。有研究表明，青光眼的視神經(jīng)損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[5-6]，活性氧的增加是小膠質(zhì)細(xì)胞在高眼壓過程中死亡的主要原因[7]。因此，本研究通過實驗的方法探討青光安Ⅱ號方對RGC-5細(xì)胞模型[8]中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）/低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1， HIF-1α）通路中相關(guān)因子的影響，以期明確其視神經(jīng)保護(hù)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ?動物及細(xì)胞

取健康SPF級雄性和雌性SD大鼠各30只，由湖南省斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-2004，體質(zhì)量0.17～0.28 kg。動物實驗倫理合格證號：LL2019121901。RGC-5細(xì)胞株（批號：CP-M122，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 ?藥物

中藥配方：黃芪（批號：CK19111807）、枸杞子（批號：SL19112203）、燈盞細(xì)辛（批號：2019011616）、牛膝（批號：CK19101401）、川芎（批號：SL19111503）、女貞子（批號：2019011201）均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.3 ?試劑與儀器

CCK-8試劑盒（批號：CA1210）、30%制膠液（批號：A1010）均購自索萊寶公司;總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測定試劑盒（批號：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）測定試劑盒（批號：A003-1）均購自南京建成公司;Tris（中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號：30188216）;5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號：P0015L）、ECL發(fā)光液（批號：P0018S-2）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白Marker（賽默飛世爾科技公司，批號：26617）;PVDF膜（美國密理博公司，批號：IPVH00010）;膜再生液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：P1650）;HIF-1α（批號：ab1）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）（批號：ab109362）、NF-κB（批號：ab16502）均購自上海Abcam生物技術(shù)有限公司;GAPDH（美國proteintech公司，批號：10494-1-AP）;羊抗兔-HRP（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0295G-HRP）;KC7F2（上海浩洋生物科技有限公司，批號：S7946）。

酶標(biāo)儀（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，型號：Synergy H4）;KHB洗板機(jī)（上海科華實驗系統(tǒng)有限公司，型號：ST-36WT）;電泳儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：1645070）;電轉(zhuǎn)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：BE6085）;全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：5200）。

1.4 ?含藥血清的獲取

將60只SD大鼠隨機(jī)分成青光安Ⅱ號方10倍組、青光安Ⅱ號方5倍組、青光安Ⅱ號方2.5倍組和空白組。按體表面積換算的方法計算出每只大鼠的灌藥量，灌藥大鼠均按照10倍成人等效劑量灌胃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后開始灌胃，空白對照組灌同等劑量的生理鹽水，每日1次。灌胃7 d后，提取血清。取血方法：每只大鼠麻醉前1 h灌胃，大鼠麻醉、固定，頸總動脈采血，離心提取含藥血清和空白血清。青光安Ⅱ號方10倍組：所取血清即為高劑量血清;青光安Ⅱ號方5倍組：所取血清加入1倍體積DMEM低糖培養(yǎng)基，設(shè)為中劑量血清;青光安Ⅱ號方2.5倍組：所取血清加入3倍體積DMEM低糖培養(yǎng)基，設(shè)為低劑量血清。收集的血清56 ℃下滅活補(bǔ)體30 min，按組別混合后放-80 ℃冰箱保存。

1.5 ?含藥血清加入量及谷氨酸加入量的摸索

采用CCK-8法確定含藥血清及谷氨酸加入量。將細(xì)胞以2×104個/mL、200 μL/孔的密度接種在96孔板中，在37 ℃、5% CO2箱中培養(yǎng)24 h，移出孔板，分別加入0、25、100、200 μM的谷氨酸;繼續(xù)放回37 ℃、5% CO2箱進(jìn)行培養(yǎng);24 h干預(yù)后取出96孔板;向每個孔中添加10 μL CCK-8反應(yīng)溶液;在37 ℃、5% CO2箱中繼續(xù)孵育2 h;用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度（OD），并通過存活率判定各種濃度下的細(xì)胞增殖活性，由此選擇適當(dāng)?shù)墓劝彼釢舛?。同時按照上述方法分別加入3種不同濃度的24 μL含藥血清，通過存活率OD判定各種濃度下的細(xì)胞增殖活性。選擇適當(dāng)?shù)暮幯鍧舛取?/p>

1.6 ?細(xì)胞模型建立及分組、干預(yù)

使用RGC-5細(xì)胞株，培養(yǎng)至狀態(tài)良好，體外培養(yǎng)的RGC-5細(xì)胞分為4組?？瞻捉M：10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基加空白血清進(jìn)行培養(yǎng)。模型組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入谷氨酸，以此模擬RGC-5細(xì)胞損傷[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基加空白血清進(jìn)行培養(yǎng)。含藥血清組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入谷氨酸，以此模擬RGC-5細(xì)胞損傷[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基加含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)。阻斷劑組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入谷氨酸，以此模擬RGC-5細(xì)胞損傷[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基加含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，合并使用阻斷劑KC7F2[9]2 μM處理。

1.7 ?Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞以2×104個/mL、2 mL/孔密度接種于6孔板爬片中，在37 ℃、5% CO2箱中培養(yǎng)24 h;取出孔板，按以上分組進(jìn)行處理，先加入200 μM谷氨酸;繼續(xù)在37 ℃、5% CO2箱中培養(yǎng)24 h;取出孔板，按以上分組換入空白對照血清、5倍青光安血清、以及5倍青光安血清和KC7F2;繼續(xù)在37 ℃、5% CO2箱中培養(yǎng)24 h;取出孔板，吸去上清液，每孔加入1 mL Hochest染色劑，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2箱中培養(yǎng)30 min;取出孔板，觀察是否出現(xiàn)熒光;如果出現(xiàn)熒光，首先吸去上清液，PBS清洗2次，封片。每組拍攝3次。

1.8 ?四氮唑藍(lán)（tetrazolium blue， NBT）核黃素比色法檢測SOD含量

樣品6倍稀釋后種于6孔板中培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，加入底物、酶，測定孔、測定空白孔加樣品20 μL，對照孔、對照空白孔加超純水20 μL。對照孔、測定孔加酶工作液20 μL;對照空白孔、測定空白孔加酶稀釋液20 μL。每孔加底物應(yīng)用液200 μL，混勻后37 ℃加熱20 min，450 nm處酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果計算公式：SOD抑制率=[（對照孔OD值-對照空白孔OD值）-（測定孔OD值-測定空白孔OD值）]/（對照孔OD值-對照空白孔OD值）×100%;SOD活力（U/mL）=SOD抑制率/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.9 ?硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法檢測MDA含量

MDA試劑盒準(zhǔn)備完畢后，配置相關(guān)試劑：（1）試劑一：37 ℃加熱溶解至透明;（2）試劑二：加170 mL超純水配制;（3）試劑三：加30 mL超純水后加熱95 ℃充分溶解，再加30 mL冰醋酸，混勻?？瞻坠芗訜o水乙醇20 μL，標(biāo)準(zhǔn)管加10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品20 μL，測定管加樣品20 μL。每管加試劑一20 μL，混勻。每管加試劑二3 mL，加試劑三1 mL。用針在離心管蓋上扎1個小孔，混勻后95 ℃加熱40 min，取出后流水冷卻，3 500 r/min離心10 min，離心半徑20 cm，取上清200 μL加入到酶標(biāo)板中，532 nm處測各管吸光度值。結(jié)果計算公式：MDA含量（nmol/mL）=（測定管OD值-空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.10 ?Western blot檢測NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)

RGC-5細(xì)胞長至90%鋪滿時再消化傳代。將細(xì)胞以5×104個/mL密度接種于6孔板中，2 mL/孔;按以上分組進(jìn)行處理，37 ℃、5% CO2箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;吸去上清液，PBS清洗1次;吸去PBS，每孔加入100 μL蛋白裂解液;細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下后吸進(jìn)1.5 mL離心管中，-80 ℃保存;從-80 ℃冰箱中取出樣本，置于冰上解凍，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，離心半徑20 cm，取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度;根據(jù)濃度測定結(jié)果對蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整，保證不同組別之間蛋白濃度一致，每孔上樣量為30 μg，與適量5×loading buffer混勻，95 ℃、5 min后進(jìn)行上樣，剩余樣本于

-80 ℃保存。制備電泳膠、上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗[用含2% BSA的TBST稀釋相應(yīng)的一抗，NF-κB（1∶2 000）、HIF-1α（1∶500）、BNIP3（1∶2 000）];孵二抗[用封閉液稀釋HRP標(biāo)記二抗（1∶5 000）]、顯色曝光、膜洗脫再生，再次進(jìn)行封閉。內(nèi)參孵育，加入二抗，曝光。曝光結(jié)果使用Image J軟件分析灰度值。

1.11 ?統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料用“x±s”表示。先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，且方差齊，則進(jìn)行單因素方差分析。若分析結(jié)果顯示，各組間存在差異，則采用Tukey法進(jìn)行多組比較。若不滿足正態(tài)性要求，則采用非參數(shù)檢驗，若分布正態(tài)但方差不齊者，則采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ?含藥血清和谷氨酸加入量的確定

含藥血清中空白組細(xì)胞存活率為100%，2.5倍組為89.05%，5倍組為88.96%，10倍組為74.93%。為確保含藥量，選用5倍組作為實驗量。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，谷氨酸加入量為0 μM時細(xì)胞存活率為100%、25 μM時為95.85%、100 μM時為84.87%、200 μM時為64.20%，最終選用200 μM的谷氨酸為加入量。

2.2 ?各組細(xì)胞凋亡情況

與空白組比較，模型組凋亡細(xì)胞個數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組和阻斷劑組凋亡細(xì)胞個數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與含藥血清組比較，阻斷劑組凋亡細(xì)胞個數(shù)減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1、圖1。

2.3 ?各組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)情況

與空白組比較，模型組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組及阻斷劑組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與含藥血清組比較，阻斷劑組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;但與空白組比較，阻斷劑組HIF-1α蛋白的表達(dá)量明顯增加，而BNIP3蛋白的表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2、圖2。

2.4 ?各組SOD和MDA含量表達(dá)情況

與空白組比較，模型組SOD及MDA的含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組SOD及MDA的含量明顯減少、阻斷劑組SOD明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與含藥血清組比較，阻斷劑組SOD含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），MDA的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;但與空白組比較，阻斷劑組MDA的含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

3 討論

青光眼在控制眼壓后仍然可引起RGC的凋亡，目前對于視神經(jīng)的挽救方式較少，神經(jīng)生長因子的效果并不具有優(yōu)勢[10-11]，而干細(xì)胞移植仍處于實驗室階段[12-13]。中醫(yī)藥因其具有龐大的藥物組分庫，具備從中進(jìn)行創(chuàng)新藥物挖掘的潛力，越來越受到學(xué)者的重視。彭清華教授所創(chuàng)制的“青光安Ⅱ號方”對RGC的Caspase-3表達(dá)有抑制作用，能有效抑制RGC的凋亡[4]，但青光安Ⅱ號方抑制凋亡的具體機(jī)制并不清楚。

氧化應(yīng)激可能與青光眼的視神經(jīng)損傷有關(guān)[14-15]，研究[7]表明活性氧的增加是小膠質(zhì)細(xì)胞在高眼壓過程中死亡的主要原因，而抑制氧化應(yīng)激損傷則可以保護(hù)膠質(zhì)細(xì)胞[16]。目前，關(guān)于中醫(yī)藥的研究中，細(xì)胞黃素、銀杏葉提取物對于缺氧損傷的RGC具有保護(hù)作用[17-18];枸杞子、丹參、川芎、燈盞細(xì)辛等，也具有視神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[19]。所以本研究從氧化應(yīng)激的相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行研究，來驗證青光安Ⅱ號方對于RGC的保護(hù)作用是否是通過調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)因子來實現(xiàn)的。

研究表明，HIF-1α和NF-кB均是氧化應(yīng)激相關(guān)通路中的核心因子，且兩者之間還有密切聯(lián)系：HIF-1α可誘導(dǎo)缺氧細(xì)胞中的NF-кB的活化[20];而NF-кB也可與HIF-1α啟動子結(jié)合，上調(diào)缺氧反應(yīng)中HIF-1α的表達(dá)[21]。缺氧反應(yīng)發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)氧自由基的大量生成會引發(fā)SOD的上調(diào)，其最終產(chǎn)物MDA也會大量生成;同時引發(fā)BNIP-3的激活，誘導(dǎo)RGC發(fā)生線粒體自噬[22-23]。為了觀察青光安Ⅱ號方含藥血清是否是通過調(diào)控HIF-1α發(fā)揮作用，本實驗中加入HIF-1α的阻斷劑KC7F2，它是一種選擇性HIF-1α蛋白翻譯抑制劑，可抑制HIF-1α的蛋白合成，進(jìn)一步抑制BNIP-3和SOD的激活。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為青光眼的病理機(jī)制是氣虛血瘀，脈絡(luò)阻滯，目系失養(yǎng)，玄府閉塞，神水瘀積[24]，中醫(yī)治療宜采用益氣活血利水的治法，“青光安Ⅱ號方”在此思想指導(dǎo)下應(yīng)運(yùn)而生[25]。其組方由黃芪、枸杞子、燈盞細(xì)辛、牛膝、川芎、女貞子組成，重用枸杞子、女貞子、牛膝三味，歸肝腎經(jīng)，為滋補(bǔ)肝腎之品，其中以枸杞子、女貞子補(bǔ)肝腎明目為君，另加黃芪補(bǔ)氣健脾，四藥補(bǔ)益正氣取其“正氣存內(nèi)，邪不可干”之意，扶助正氣以驅(qū)邪外出。故本方以補(bǔ)為主，側(cè)重補(bǔ)肝腎之陰，同時在補(bǔ)益基礎(chǔ)上，用牛膝及燈盞細(xì)辛活血。黃芪利水，川芎行氣，一使氣行則血行、氣行亦水行，二使全方補(bǔ)而不滯。全方補(bǔ)通兼施，使目竅通暢、氣血調(diào)和，則諸癥俱解。

本次研究中，我們使用谷氨酸誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷，模擬青光眼所造成的RGC凋亡[5，26-27]。本次研究結(jié)果中，模型組的NF-κB、HIF-1α均出現(xiàn)高表達(dá)，與空白組、含藥血清組和阻斷劑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），說明當(dāng)RGC-5細(xì)胞損傷出現(xiàn)時，會激活其中NF-κB表達(dá)，進(jìn)一步激活HIF-1α表達(dá)，兩者可能形成正反饋的調(diào)節(jié)。SOD、MDA在模型組中表達(dá)升高（P<0.01），說明在視神經(jīng)損傷后，細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，引發(fā)了SOD上調(diào)以及代謝產(chǎn)生MDA的集聚;另外，BNIP-3在模型組中高表達(dá)（P<0.01），說明在激活HIF-1α后，引發(fā)了BNIP-3途徑的線粒體自噬反應(yīng)，有可能進(jìn)而形成細(xì)胞凋亡。Hoechst法檢測到模型組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯多于其他各組（P<0.01），也驗證了這一點(diǎn)，且與前期研究的結(jié)果一致[4]。而與模型組相比，含藥血清組與阻斷劑組在谷氨酸致?lián)p后，其NF-κB表達(dá)均得到了一定的抑制，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;同時此兩組的HIF-1α表達(dá)也受到明顯抑制（P<0.01）;而含藥血清組與阻斷劑組之間并無明顯差異（P>0.05），表明含藥血清對RGC-5細(xì)胞產(chǎn)生了 組的BNIP-3蛋白表達(dá)和SOD含量均明顯受到抑制，表明含藥血清在抑制NF-κB和HIF-1α蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步抑制了BNIP-3和SOD的表達(dá)，前者可以減弱RGC-5細(xì)胞的線粒體自噬，對抑制RGC的凋亡有正向作用;而后者將導(dǎo)致MDA的減少，與本次實驗的結(jié)果吻合，最終形成了對細(xì)胞凋亡的抑制作用，表現(xiàn)為含藥血清組與阻斷劑組的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少（P<0.01）。

綜上所述，青光安Ⅱ號方含藥血清對谷氨酸誘導(dǎo)損傷的RGC-5細(xì)胞中NF-кB具有抑制作用，進(jìn)而抑制了HIF-1α通路的激活，減弱了由于氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

[1] 梁遠(yuǎn)波，江俊宏.我國青光眼防治問題與展望[J].浙江醫(yī)學(xué)，2020， 42（22）：2377-2382.

[2] 梁遠(yuǎn)波，江俊宏，王寧利.中國青光眼流行病學(xué)調(diào)查研究回顧[J].中華眼科雜志，2019，55（8）：634-640.

[3] 李銀鑫，歐 ?晨，周亞莎，等.彭清華教授采用青光安Ⅱ號方治療青光眼中晚期視神經(jīng)損害[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2020，16（12）：113-116.

[4] 李銀鑫，蔣鵬飛，曾志成，等.青光安Ⅱ號方有效組分對青光眼模型DBA/2J小鼠視網(wǎng)膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（6）：673-678.

[5] LIU Y， LEE R K. Cell transplantation to replace retinal ganglion cells faces challenges - the Switchboard Dilemma[J]. Neural Regeneration Research， 2021， 16（6）： 1138-1143.

[6] AHMAD A， AHSAN H. Biomarkers of inflammation and oxidative stress in ophthalmic disorders[J]. Journal of Immunoassay and Immunochemistry， 2020， 41（3）： 257-271.

[7] AIRES I D， BOIA R， RODRIGUES-NEVES A C， et al. Blockade of microglial adenosine A2A receptor suppresses elevated pressure-induced inflammation， oxidative stress， and cell death in retinal cells[J]. Glia， 2019， 67（5）： 896-914.

[8] HU X X， DAI Y， SUN X H. Parkin overexpression protects retinal ganglion cells against glutamate excitotoxicity[J]. Molecular Vision， 2017， 23： 447-456.

[9] LI J， JIANG G H， CHEN Y L， et al. Altered expression of hypoxia-Inducible factor-1α participates in the epileptogenesis in animal models[J]. Synapse， 2014， 68（9）： 402-409.

[10] EFTIMIADI G， SOLIGO M， MANNI L， et al. Topical delivery of nerve growth factor for treatment of ocular and brain disorders[J]. Neural Regeneration Research， 2021， 16（9）： 1740-1750.

[11] LAMBIASE A， MANTELLI F， BONINI S. Nerve growth factor eye drops to treat Glaucoma[J]. Drug News & Perspectives， 2010， 23（6）： 361-367.

[12] HARADA C， NORO T， KIMURA A， et al. Suppression of oxidative stress as potential therapeutic approach for normal tension Glaucoma[J]. Antioxidants （Basel， Switzerland）， 2020， 9（9）： 874-886.

[13] XIONG S， KUMAR A， TIAN S， et， al. Stem cell transplantation rescued a primary open-angle glaucoma mouse model[J]. Elife. 2021， 10： e63677.

[14] LIU Y， LEE R K. Cell transplantation to replace retinal ganglion cells faces challenges-the Switchboard Dilemma[J]. Neural Regeneration Research， 2021， 16（6）： 1138-1143.

[15] AHMAD A， AHSAN H. Biomarkers of inflammation and oxidative stress in ophthalmic disorders[J]. Journal of Immunoassay & Immunochemistry， 2020， 41（3）： 257-271.

[16] MEANS J C， LOPEZ A A， KOULEN P. Estrogen protects optic nerve head astrocytes against oxidative stress by preventing caspase-3 activation， tau dephosphorylation at Ser422 and the formation of tau protein aggregates[J]. Cellular and Molecular Neurobiology， 2021， 41（3）： 449-458.

[17] CHO H K， KIM S， LEE E J， et al. Neuroprotective effect of Ginkgo biloba extract against hypoxic retinal ganglion cell degeneration in vitro and in vivo[J]. Journal of Medicinal Food， 2019， 22（8）： 771-778.

[18] MALISHEVSKAYA T N， YUSUPOV A R， SHATSKIKH S V， et al. Efficacy and safety of neuroprotection in patients with primary open-angle Glaucoma[J]. Vestnik Oftalmologii， 2019， 135（2）： 83-92.

[19] 周亞莎，廖林麗，覃艮艷，等.不同中藥對青光眼小鼠視網(wǎng)膜TRPV4及TRAAK蛋白影響的比較研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2020，36（12）：153-157.

[20] LEE S H， LEE Y J， HAN H J. Effect of arachidonic acid on hypoxia-induced IL-6 production in mouse ES cells： Involvement of MAPKs， NF-kappaB， and HIF-1alpha[J]. Journal of Cellular Physiology， 2010， 222（3）： 574-585.

[21] BELAIBA R S， BONELLO S， Z HRINGER C， et al. Hypoxia up-regulates hypoxia-inducible factor-1alpha transcription by involving phosphatidylinositol 3-kinase and nuclear factor kappaB in pulmonary artery smooth muscle cells[J]. Molecular Biology of the Cell， 2007， 18（12）： 4691-4697.

[22] ZENG C， ZOU T T， QU J Y， et al. Cyclovirobuxine D induced-mitophagy through the p65/BNIP3/LC3 axis potentiates its apoptosis-inducing effects in lung cancer cells[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（11）： 5820.

[23] HUANG Y N， WEN Q L， HUANG J F， et al. Manganese （II） chloride leads to dopaminergic neurotoxicity by promoting mitophagy through BNIP3-mediated oxidative stress in SH-SY5Y cells[J]. Cellular & Molecular Biology Letters， 2021， 26（1）： 23.

[24] 秦裕輝.問目哪得清如許，唯有活血利水來——評《眼科活血利水法的研究》[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（3）：381-382.

[25] 彭 ?俊，曾志成，譚涵宇，等.眼科活血利水法的基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展，2010，30（6）：585-589，593.

[26] SUCHER N J， LIPTON S A， DREYER E B. Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells[J]. Vision Research， 1997， 37（24）： 3483-3493.

[27] KRITIS A A， STAMOULA E G， PANISKAKI K A， et al. Researching glutamate-induced cytotoxicity in different cell lines： A comparative/collective analysis/study[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience， 2015， 9： 91.