劉亞楠 王炳先 路臣桂 楊 君

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院臨床學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453000； 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科二病區(qū)，河南新鄉(xiāng)453000）

子宮內(nèi)膜癌是一種常見的女性生殖系統(tǒng)上皮性惡性腫瘤，常發(fā)生于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，是導(dǎo)致死亡的第三位常見婦科惡性腫瘤［1］。早期患者首選手術(shù)療法，術(shù)后放療是防治其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效輔助手段，然而由于化療耐藥的出現(xiàn)，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差，嚴重危害女性生命健康［2］。紫草是我國傳統(tǒng)藥用植物之一，《本草經(jīng)疏》 等多種中藥典籍對其藥用價值均有記載。紫草素是紫草Lithosperraum erythrorhizon Sieb.et Zucc.根的主要活性成分，具有抗癌、抗炎、抗菌等作用。研究顯示，紫草素可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達具有抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用［3?4］，但其作用機制以及對子宮內(nèi)膜癌細胞順鉑耐藥性的影響尚不清楚。肝細胞核因子1α 反義鏈1（HNF1A?AS1）是近年來發(fā)現(xiàn)的致癌因子，HNF1A?AS1 在骨肉瘤、非小細胞肺癌等惡性腫瘤中高表達并促進腫瘤細胞的增殖和遷移［5?6］。此外，HNF1A?AS1 高表達還可增強宮頸癌細胞的順鉑耐藥［7］。生物信息學(xué)分析顯示，miR?20b?5p是HNF1A?AS1 的潛在靶基因，miR?20b?5p在子宮內(nèi)膜癌中低表達，過表達miR?20b?5p可抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［8］。本研究旨在闡明紫草素在子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡、順鉑耐藥中的作用，探討其機制是否與調(diào)控HNF1A?AS1 和miR?20b?5p表達有關(guān)，以期為紫草素開發(fā)成抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞 人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC?1B 購于杭州亦博生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（SH30070）、青鏈霉素雙抗溶液（P1400）購于北京索萊寶生物科技有限公司；紫草素（純度≥98%，批號110769?200506）購于上海源葉生物科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK?8）（C0038）、膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素／碘化丙啶（Annexin V?FITC／PI）雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（C1062S）購于上海碧云天生物科技有限公司；SYBR Green qPCR Mix（11202ES）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購于上海翊圣生物科技有限公司；兔源細胞周期素D1（CyclinD1）（＃2922）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved?caspase?3）（＃9654）、β?actin 抗體以及山羊抗兔二抗購于美國CST 公司；鼠源多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）抗體（sc?18835）、羊抗鼠二抗（sc?2005）購自購于美國Santa Cruz 公司；HNF1A?AS1 小干擾RNA（si?HNF1A?AS1）及其對照（si?NC）、miR?20b?5p模擬物（miR?20b?5p mimics）及其對照（miR?NC）、HNF1A?AS1 過表達載體（pcDNA?HNF1A?AS1）及其對照（pcDNA?NC）、PCR 引物由廣州復(fù)能基因有限公司提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HEC?1B細胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d 換液1 次，當細胞融合度達到80%時進行傳代，胰酶消化后，選用對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 分組和給藥 實驗分為對照組及紫草素低、中、高劑量組為分別加入為0.4、0.8、1.6 μg／mL 含紫草素培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h；si?NC組、si?HNF1A?AS1組、miR?NC組、miR?20b?5p組為分別將si?NC、si?HNF1A?AS1、miR?NC、miR?20b?5p mimics 轉(zhuǎn)染HEC?1B細胞；pcDNA?NC＋紫草素組、pcDNA?HNF1A?AS1＋紫草素組、pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?NC＋紫草素組、pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?20b?5p＋紫草素組為分別將pcDNA?NC、pcDNA?HNF1A?AS1、pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?NC、pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?20b?5p mimics 轉(zhuǎn)染HEC?1B細胞后進行紫草素干預(yù)處理。

2.3 CCK?8 法檢測細胞活力 將HEC?1B細胞接種到96 孔板，按照上述分組進行細胞處理，每孔添加10 μL 的CCK?8 試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h，以空白孔調(diào)零，用酶標儀測量450 nm 波長處各孔OD，計算細胞存活率。細胞存活率＝（OD實驗－OD空白）／（OD對照－OD空白）×100%。HEC?1B細胞按照上述分組進行處理后，調(diào)整細胞濃度為5×104／mL，向每孔加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)24 h 后，加入不同質(zhì)量濃度（0、1.25、2.5、5、10、20、40 μg／mL）的順鉑進行處理，培養(yǎng)24 h，采用CCK?8 試劑盒測定各孔OD。用SPSS分析計算IC50值。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 HEC?1B細胞按照上述分組處理后，調(diào)整細胞密度為1×106／mL。按照Annexin V?FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書分別加入Annexin V?FITC 和PI 進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.5 RT?PCR 檢測HNF1A?AS1 和miR?20b?5p的表達 采用Trizol 試劑提取各組細胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA，并利用SYBR Green 試劑盒進行PCR 擴增。反應(yīng)體系為SYBR Green Master Mix 10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，cDNA 2 μL，補加超純水至20 μL。引物序列HNF1A?AS1正向5′?TCAAGAAATGGTGGCTAT?3′，反向 5′?GCTCTGAGACTGG CTGAA?3′。miR?20b?5p正向 5′?CAAAGTGCTCATAGTG CAGGTAG?3′，反向為通用引物。β?actin正向 5′?CATGTACGTTGCTATCCAGGC?3′，反向 5′?CTCCTTAATGT CACGCACGAT?3′。U6 正向5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，反向5′?ACGCTTCACGAATTTGCGT?3′。

2.6 Western blot 檢測 CyclinD1、Cleaved?caspase?3 和MRP1 蛋白的表達細胞按照上述分組進行處理后，加入細胞裂解液，完全裂解后離心獲得上清液即為細胞總蛋白。二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。將蛋白樣品和等體積上樣緩沖液混合，煮沸3 min 使其變性。取40 μg細胞蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將已分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。室溫條件下將膜置于5%的脫脂牛奶中孵育1 h，將膜置于稀釋的一抗溶液中孵育2 h，洗膜后，將膜置于稀釋的二抗溶液中孵育1 h，洗膜后，進行增強化學(xué)發(fā)光顯色。Image J 軟件對各目的條帶灰度值進行分析，以各目的條帶與內(nèi)參β?actin 灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?含有miR?20b?5p結(jié)合位點的HNF1A?AS1 野生型（wt?HNF1A?AS1）或突變型（mut?HNF1A?AS1）熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建由上海生工公司提供。將miR?NC、miR?20b?5pmimics分別與wt?HNF1A?AS1、mut?HNF1A?AS1 共轉(zhuǎn)染HEC?1B細胞，轉(zhuǎn)染48 h，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0 進行條件分析，實驗均設(shè)置3個復(fù)孔或平行實驗，重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)均采用（）表示。組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK?q 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響 相較于對照組，紫草素低、中、高劑量組HEC?1B細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，細胞IC50值降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1 和圖1。

表1 紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

表1 紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01。

圖1 紫草素對HEC?1B細胞凋亡的影響

3.2 紫草素對HEC?1B細胞CyclinD1、Cleaved?caspase?3、MRP1 蛋白的影響 相較于對照組，紫草素低、中、高劑量組HEC?1B細 胞CyclinD1、MRP1 蛋白的表達降低，Cleaved?caspase?3 蛋白的表達增加（P＜0.01），見表2、圖2。

圖2 紫草素對HEC?1B細胞中CyclinD1、Cleaved?caspase?3、MRP1 蛋白表達的影響

表2 紫草素對HEC?1B細胞中CyclinD1、Cleaved?caspase?3、MRP1 蛋白表達的影響（， n＝9）

表2 紫草素對HEC?1B細胞中CyclinD1、Cleaved?caspase?3、MRP1 蛋白表達的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

3.3 紫草素對HNF1A?AS1 和miR?20b?5p表達的影響相較于對照組，紫草素低、中、高劑量組HEC?1B細胞HNF1A?AS1 的表達降 低，miR?20b?5p的表達升 高（P＜0.01），見表3。

表3 紫草素對HNF1A?AS1 表達的影響（， n＝9）

表3 紫草素對HNF1A?AS1 表達的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

3.4 干擾HNF1A?AS1 表達對細胞HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響 相較于si?NC組，si?HNF1A?AS1組HEC?1B細胞HNF1A?AS1 的表達降低，CyclinD1 和MRP1蛋白的表達降低，Cleaved?caspase?3 蛋白的表達升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，IC50降低（P＜0.01），見表4、圖3。

圖3 HNF1A?AS1 低表達對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

表4 干擾HNF1A?AS1 表達對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

表4 干擾HNF1A?AS1 表達對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

注：與si?NC組比較，**P＜0.01。

3.5 過表達miR?20b?5p對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響 相較于miR?NC組，miR?20b?5p組HEC?1B細胞miR?20b?5p的表達升高，CyclinD1 和MRP1 蛋白的表達降低，Cleaved?caspase?3 蛋白的表達升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率顯著升高，IC50降低（P＜0.01），見表5、圖4。

圖4 miR?20b?5p 高表達對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

表5 miR?20b?5p 高表達對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

表5 miR?20b?5p 高表達對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

注：與miR?NC組比較，**P＜0.01。

3.6HNF1A?AS1 靶向調(diào)控miR?20b?5p的表達 TargetScan軟件在線預(yù)測顯示，HNF1A?AS1 和miR?20b?5p之間直接存在相互作用，見圖5。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，相較于miR?NC 和WT?HNF1A?AS1 共轉(zhuǎn)染組，miR?20b?5p mimics 和WT?HNF1A?AS1 共轉(zhuǎn)染后HEC?1B細胞熒光素酶活性降低（P＜0.05）；相較于miR?NC 和MUT?HNF1A?AS1共轉(zhuǎn)染組，miR?20b?5p mimics 和MUT?HNF1A?AS1 共轉(zhuǎn)染后HEC?1B細胞熒光素酶活性無明顯變化，見表6。RT?qPCR 檢測顯示，相較于si?NC組，si?HNF1A?AS1組HEC?1B細 胞miR?20b?5p的表達升 高（P＜0.01）；相較于pcDNA?NC組，pcDNA?HNF1A?AS1組HEC?1B細 胞miR?20b?5p的表達降低（P＜0.01），見表7。提示，HNF1A?AS1靶向負性調(diào)控miR?20b?5p表達。

表7 干擾或過表達HNF1A?AS1 對HEC?1B細胞miR?20b?5p 表達的影響（， n＝9）

表7 干擾或過表達HNF1A?AS1 對HEC?1B細胞miR?20b?5p 表達的影響（， n＝9）

注：與si?NC組比較，** P ＜0.01；與pcDNA?NC組比較，＃＃P＜0.01。

圖5 HNF1A?AS1 和miR?20b?5p 結(jié)合示意圖

表6 miR?NC、miR?20b?5p mimics分別與WT?HNF1A?AS1 或MUT?HNF1A?AS1 共轉(zhuǎn)染后HEC?1B細胞熒光素酶活性（， n＝9）

表6 miR?NC、miR?20b?5p mimics分別與WT?HNF1A?AS1 或MUT?HNF1A?AS1 共轉(zhuǎn)染后HEC?1B細胞熒光素酶活性（， n＝9）

注：與miR?NC組比較，**P＜0.01。

3.7 過表達HNF1A?AS1 可以逆轉(zhuǎn)紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響 相較于pcDNA?NC＋紫草素組，pcDNA?HNF1A?AS1＋紫草素組HEC?1B細 胞HNF1A?AS1 的表達升高，CyclinD1 和MRP1 蛋白的表達升高，Cleaved?caspase?3 蛋白的表達降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，IC50升高（P＜0.01），見表8、圖6。

表8 過表達HNF1A?AS1 可以逆轉(zhuǎn)紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

表8 過表達HNF1A?AS1 可以逆轉(zhuǎn)紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

注：與pcDNA?NC＋紫草素組比較，**P ＜0.01。

圖6 過表達HNF1A?AS1 可以逆轉(zhuǎn)紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

3.8 過表達miR?20b?5p和HNF1A?AS1 對紫草素處理的HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響 相較于pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?NC＋紫草素組，pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?20b?5p＋紫草素組HEC?1B細胞miR?20b?5p的表達升高，CyclinD1 和MRP1 蛋白的表達降低，Cleaved?caspase?3 蛋白的表達升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，IC50降低（P＜0.01），見表9、圖7。

圖7 過表達miR?20b?5p 和HNF1A?AS1 對紫草素處理的HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

表9 過表達miR?20b?5p 和HNF1A?AS1 對紫草素處理的HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

表9 過表達miR?20b?5p 和HNF1A?AS1 對紫草素處理的HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響（， n＝9）

注：與pcDNA?HNF1A?AS1＋miR?NC＋紫草素組比較，**P ＜0.01。

4 討論

紫草素是天然存在的萘醌類衍生物，其通過抑制多種癌細胞的生長、誘導(dǎo)細胞凋亡而具有抗癌活性［9］。Shilnikova 等［10］研究顯示紫草素可誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，減弱順鉑耐藥卵巢癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Chen等［11］研究發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制胰腺癌細胞的生長，增強吉西他濱的抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素以劑量依賴的方式下調(diào)促增殖蛋白CyclinD1 表達，上調(diào)促凋亡蛋白Cleaved?caspase?3 表達，抑制HEC?1B細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，與Huang 等［12］紫草素的抗子宮內(nèi)膜癌作用相吻合。MRP1 是腫瘤細胞耐藥的關(guān)鍵蛋白，其通過將大量藥物轉(zhuǎn)運到細胞外，對腫瘤細胞具有保護作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素以劑量依賴的方式下調(diào)MRP1 蛋白表達，并提高HEC?1B細胞對順鉑的敏感性。以上研究說明紫草素具有抗子宮內(nèi)膜癌作用，并可提高其對順鉑的敏感性。

HNF1A?AS1 已被證實參與膀胱癌、胃癌等多種腫瘤進展，是腫瘤早期診斷的生物標記物［14?15］。研究報道［16］敲除HNF1A?AS1 顯著抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和集落形成，抑制細胞周期進入S 期，進而抑制結(jié)腸癌致瘤表型。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素干預(yù)后HEC?1B細胞HNF1A?AS1 表達顯著降低。干擾HNF1A?AS1 表達可抑制HEC?1B細胞存活，促進細胞凋亡，并提高HEC?1B細胞對順鉑的敏感性，與紫草素的抗子宮內(nèi)膜癌作用相同。進一步恢復(fù)實驗顯示，過表達HNF1A?AS1 可逆轉(zhuǎn)紫草素對HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響。以上研究提示下調(diào)HNF1A?AS1 是紫草素發(fā)揮抗子宮內(nèi)膜癌作用的分子機制。

miR?20b?5p是miR?17 家族的成員之一。B細胞淋巴瘤和T細胞白血病中miR?20b?5p表達失調(diào)，外周血單核細胞中miR?20b?5p表達升高是慢性淋巴細胞白血病預(yù)后良好的分子標志物［17］。miR?20b?5p上調(diào)還可抑制腎癌細胞遷移和增殖，促進細胞凋亡［18］。此外，上調(diào)miR?20b表達還可降低5?氟尿嘧啶耐藥結(jié)腸癌細胞的耐藥性［19］。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素干預(yù)后HEC?1B細胞miR?20b?5p表達顯著增加，過表達miR?20b?5p可抑制HEC?1B細胞存活，促進細胞凋亡，提高HEC?1B細胞對順鉑的敏感性，與紫草素、干擾HNF1A?AS1 表達的抗子宮內(nèi)膜癌作用相同。此外，過表達miR?20b?5p還可逆轉(zhuǎn)pcDNA?HNF1A?AS1 對紫草素處理的子HEC?1B細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響。由于雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏T?PCR 證實HNF1A?AS1 靶向并負調(diào)控miR?20b?5p表達，本研究推測紫草素通過調(diào)控HNF1A?AS1／miR?20b?5p軸進而影響子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、凋亡以及順鉑耐藥。

綜上所述，本研究證實紫草素可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并提高其順鉑敏感性，其機制與調(diào)控HNF1A?AS1／miR?20b?5p軸有關(guān)，以期為紫草素開發(fā)成抗子宮內(nèi)膜癌藥物奠定理論基礎(chǔ)。