袁曉燕徐文豪 金 典 母育成 諶立巍 陳彥清*

（1.攀枝花市中心醫(yī)院，四川 攀枝花617067； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137）

感染源性肺炎是臨床常見病，多發(fā)?。?］。抗感染治療是臨床最為主要的治療思路［2］。由于我國獨(dú)特的中醫(yī)藥資源，國內(nèi)臨床實(shí)踐中也常合用以清熱解毒為代表的各類中藥制劑。多年的臨床實(shí)踐也證實(shí)中西藥合用可顯著改善患者的一些體感癥狀，縮短損傷性反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，最終有助于提高治愈率和治愈速度［3］。

藥物合用具有極其復(fù)雜的表征，其合理性除從臨床觀察性資料匯總以評價(jià)外，近年來使用定量藥理學(xué)手段結(jié)合實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)方法，量化得出的相關(guān)結(jié)論也可精確區(qū)分合用對療效的改善類型，并能指出其相關(guān)聯(lián)的作用機(jī)制。合用后，理論認(rèn)為藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)均可影響療效。本研究對臨床治療感染性肺炎的常見中西藥合用阿奇霉素聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯［4?5］采用微分量效方程的方法，從藥效學(xué)的角度闡述其合用的臨床機(jī)制。

1 材料

1.1 受試藥物 穿心蓮內(nèi)酯對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF8072353，純度＞99%）；阿奇霉素對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)810A031，純度＞99%）。

1.2 儀器 全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（Vitek 2compact，法國生物梅里埃公司）；液相芯片儀（MAGPX12157001，美國Luminex 公司）；生物安全柜（1300，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；導(dǎo)尿管（14，揚(yáng)州市桂龍醫(yī)療器械有限公司）；麥?zhǔn)媳葷醿x（DEN?1，英國Grant Instruments 公司）；細(xì)胞因子多指標(biāo)液相芯片（RECYTMAG?65 K?07，美國Merck Millipore 公司）；非線性混合效應(yīng)群體藥效藥動(dòng)計(jì)算軟件Monolix（version 2019R2，法國Lixoft 公司）。

1.3 菌株 2018年12 月于攀枝花中心醫(yī)院住院患者呼吸道送檢痰液中分離，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定為肺炎克雷伯菌Klebsiella Pneumoniae，紙片保存法保存于－80 ℃。試驗(yàn)前2 天，將含菌紙片緊密貼于無菌LB 瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育18 h 以上。用無菌接種環(huán)圈選擇單一并長勢良好的菌團(tuán)，均勻涂抹于新鮮LB 培養(yǎng)基平板，相同條件繼續(xù)孵育18 h，得到足量、純化的受試菌，備用。

1.4 動(dòng)物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，180～200 g，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2018?0003，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院IVC 動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，恒溫恒濕［（25±1）℃，80%］。

1.5 試劑 水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基（Mueller?Hinton，MH培養(yǎng)基，批號(hào)20171026）、普通肉湯培養(yǎng)基（Luria?Bertani Broth，LB 培養(yǎng)基，批號(hào)20190129）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptone Soy Broth，TSB 培養(yǎng)基，批號(hào)20190726）均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；烏來糖（批號(hào)20190726，成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法

2.1 細(xì)菌感染性肺炎模型的構(gòu)建 模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)［6?7］。受試大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、穿心蓮內(nèi)酯組、阿奇霉素組、穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合阿奇霉素低、中、高劑量組，共7組。將純化后增毒肺炎克雷伯菌溶于2 mL 生理鹽水中，振蕩至完全分散，配置成終濃度為0.5 麥?zhǔn)蠞舛龋?×108CFU／mL）的懸液，并經(jīng)麥?zhǔn)媳葷醿x比濁確定。除空白組，其余動(dòng)物20%烏來糖水溶液腹腔注射麻醉后，經(jīng)氣管導(dǎo)管注入配置好的細(xì)菌液400 μL（1×108CFU／mL），輕輕晃動(dòng)大鼠身體確保菌液均勻分散至兩側(cè)肺部。同時(shí)觀察呼吸以及心臟跳動(dòng)情況，待大鼠蘇醒并能活動(dòng)后，裝箱，將大鼠放回至IVC 獨(dú)立換氣籠中飼養(yǎng)。造模當(dāng)天計(jì)為0 d，連續(xù)觀察3 d，以大鼠出現(xiàn)寒顫、抓耳撓鼻、毛發(fā)浸濕，部分出現(xiàn)鼻腔、眼角出血為指征，提示造模成功。全程檢測大鼠體質(zhì)量和飲水飲食情況。最終，各造模組選取6 只感染性肺炎大鼠進(jìn)入下一階段實(shí)驗(yàn)。以上所有實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》 及《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》 進(jìn)行，并盡一切努力將動(dòng)物的不適和痛苦降至最低。

2.2 給藥 除空白組與模型組外，其余各組大鼠第3 天開始連續(xù)3 d 每日灌胃給藥一次。劑量分組為穿心蓮內(nèi)酯組（40.5 mg／kg）、阿奇霉素組（4.5 mg／kg）、40.5 mg／kg 穿心蓮內(nèi)酯＋4.5 mg／kg 阿奇霉素（聯(lián)用高劑量組）、20.25 mg／kg穿心蓮內(nèi)酯＋4.5 mg／kg 阿奇霉素（聯(lián)用中劑量組）、10.125 mg／kg 穿心蓮內(nèi)酯＋4.5 mg／kg 阿奇霉素（聯(lián)用低劑量組）。

2.3 樣本采集及檢測 給藥當(dāng)天開始，每天中午10 時(shí)各組大鼠尾靜脈采血，分離血清；于第6 天處死大鼠，取肺組織，用福爾馬林固定，HE 染色后，行鏡下病理檢測。所有血清樣本采用液相芯片檢測IL?1β、IL?4、IL?6、TNF?α、IFNγ、IL?10、IL?17A 水平。

2.4 量效微分方程模型建立 近年來定量藥理學(xué)對經(jīng)典量效方程中療效作用的評價(jià)從單時(shí)間點(diǎn)發(fā)展為治療階段的全過程檢測，從而引入動(dòng)力學(xué)處理的研究思路，可定量評價(jià)劑量?全療程療效的復(fù)雜情況［8］。同時(shí)，這一方法對聯(lián)用藥物合用結(jié)果的判定也具有較高的分辨能力［9］。參考以上方法，對不同劑量穿心蓮內(nèi)酯與固定劑量的阿奇霉素給藥后建立了如下的量效關(guān)系微分動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)。

采用零級動(dòng)力學(xué)描述細(xì)菌感染后大鼠血清中細(xì)胞因子生成，采用一級動(dòng)力學(xué)描述細(xì)胞因子的消除，則細(xì)胞因子的經(jīng)時(shí)變化，＝k－ ke×R 式中R 代表細(xì)胞因子水平，dR／dT 代表造模后細(xì)胞因子的變化率；k 為零級生成率，ke細(xì)胞因子的一級消除速度；單獨(dú)使用阿奇霉素對細(xì)胞因子變化的抑制效應(yīng)（Azm），采用經(jīng)典抑制描述，＝k×（1?Azm）?ke × R；單獨(dú)使用穿心蓮內(nèi)酯對細(xì)胞因子變化的抑制效應(yīng)（Andr）微分方程，＝k×（1－Andr）?ke×R；穿心蓮內(nèi)酯與阿奇霉素合用后對細(xì)胞因子變化的抑制效應(yīng)（Azm），如具有級聯(lián)作用微分方程，＝k×（1－Azm）×（1?Andr）?ke×R；如符合加和作用即采用的微分方程，＝k×（1?Azm?Andr）?ke×R；以上加和作用具有交互作用即采用的微分方程，＝k×（1?Azm?Andr?Azm×Andr）?ke×R?；谒幬镄?yīng)動(dòng)力學(xué)理論，Andr 和Azm 可采用線性、對數(shù)線性、Emax以及Sigmod Emax不同的PD 模型擬合。

由于本實(shí)驗(yàn)用液相芯片法同時(shí)測定了7種細(xì)胞因子的水平，如所有細(xì)胞因子數(shù)據(jù)全部用于全模型比較和參數(shù)擬合，計(jì)算壓力和時(shí)長均較大，也容易出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。因此，我們對全部個(gè)體所有時(shí)間點(diǎn)測定的細(xì)胞因子首先進(jìn)行相關(guān)性分析，采用R3.11 中基礎(chǔ)包的scatterplot 函數(shù)進(jìn)行進(jìn)入最終量效微分動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合藥效數(shù)據(jù)的篩選。確定藥效指標(biāo)后，所有個(gè)體的劑量?時(shí)間?細(xì)胞因子含量模型參數(shù)擬合按以上微分方程以非線性混合效應(yīng)算法求解，模型中個(gè)體參數(shù)均假定服從對數(shù)正態(tài)分布，誤差模型均采用線性比例模型。低于定量限的濃度點(diǎn)在擬合時(shí)標(biāo)注為LLQ，于擬合時(shí)采用半定量已知加以處理。以?2 對數(shù)似然值（?2LL）、最小化信息量（AIC）、貝葉斯信息準(zhǔn)則（BIC）、模型間Fisher 檢驗(yàn)為主要擬合優(yōu)度參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，選擇擬合優(yōu)度最高的模型報(bào)道相關(guān)參數(shù)。所有組別，含空白（劑量數(shù)據(jù)設(shè)定為0）、模型（劑量數(shù)據(jù)設(shè)定為0）、阿奇霉素、穿心蓮內(nèi)酯、阿奇霉素聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯各劑量組，所有個(gè)體數(shù)據(jù)采用一步法方法計(jì)算。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 for windows 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般藥理學(xué)指標(biāo) 造模及給藥后，各組大鼠觀測期間的體質(zhì)量及飲水、飲食變化如圖1 所示。結(jié)果表明感染后的各組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量、飲食和飲水量下降；模型組體質(zhì)量在造模后呈連續(xù)下降趨勢，其余5組大鼠在造模后第3 天即開始給藥后體質(zhì)量和飲水、飲食量呈上升趨勢。聯(lián)合用藥的3組大鼠在給藥后與空白組基本生理狀態(tài)較為接近。

圖1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)程中體質(zhì)量、飲食和飲水量變化（n＝6）

3.2 肺組織的病理檢測 典型病理照片如下圖2 所示，空白組動(dòng)物肺組織各級支氣管及肺泡組織結(jié)構(gòu)均正常，未見明顯組織病理學(xué)損傷。模型組動(dòng)物肺組織結(jié)構(gòu)消失，大量中性粒細(xì)胞浸潤并填充整個(gè)肺泡腔及各級支氣管，壞死崩解的中性粒細(xì)胞形成膿汁蓄積整個(gè)肺臟組織，呈典型的化膿性肺炎狀態(tài)。各給藥組相對模型組病理損傷均有顯著改善，但給藥組之間的統(tǒng)計(jì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 各組大鼠給藥3 d 后的肺部病理HE 染色圖（HE×40）

3.3 血清中炎癥因子水平 從圖3 可見，造模后檢測的7種細(xì)胞因子均升高，但隨著模型動(dòng)物的自我恢復(fù)，其數(shù)值出現(xiàn)明顯的回復(fù)，因此從任一時(shí)間點(diǎn)評價(jià)藥物的療效強(qiáng)度均有不妥，這一現(xiàn)象采用含時(shí)間變量的動(dòng)力學(xué)方程加以描述是系統(tǒng)性評價(jià)的良好手段。從圖4 可見，IL?4、IL?6 和TNF?α 呈明顯線性同步趨勢，IL?1β 和IL?10 也呈現(xiàn)出較明顯的線性趨勢。提示以下步驟的動(dòng)力學(xué)建?？梢跃喯嚓P(guān)指標(biāo)后進(jìn)行。結(jié)合圖3～4，考慮指標(biāo)變化明顯、劑量?效應(yīng)梯度顯著，最終選擇IL?4 和IL?17 A 作為最終量效微分方程的藥效學(xué)指標(biāo)。

圖3 觀測時(shí)間段內(nèi)各組大鼠各細(xì)胞因子時(shí)程圖（n＝6）

圖4 炎癥因子的相關(guān)性評價(jià)圖

3.4 量效微分方程評價(jià)藥物合用原理 采用非線性混合效應(yīng)群體方法計(jì)算，模型竟?fàn)幗Y(jié)果表明兩種藥物作用函數(shù)均為Emax×Dose／（IC50＋Dose），即Emax型；合用組作用機(jī)制以加和性擬合較優(yōu)。最終以IL?4 和IL?17A 為藥效指標(biāo)，一步求解所有個(gè)體時(shí)間、各藥物劑量的量效微分方程組。最終模型擬合值與實(shí)測值比較圖如圖5 所示，表明采用的最終模型以較高的優(yōu)度表征了兩者合用對炎癥因子抑制的合用機(jī)制，即合用以兩者作用的相加為主，不具有級聯(lián)放大作用，也不具有相互的交互影響。擬合參數(shù)如表1 所示。從表1 可見，對于IL?4 和IL?7 兩炎癥指標(biāo)，穿心蓮內(nèi)酯的Emax值均大于阿奇霉素Emax值，提示穿心蓮內(nèi)酯效能優(yōu)于阿奇霉素，特別是抑制IL?4 生成的作用；但是穿心蓮內(nèi)酯的IC50均大于5 mg／kg，說明藥物要較大劑量時(shí)才能發(fā)揮最大效應(yīng)，因此效價(jià)強(qiáng)度較差。

表1 量效微分方程模型擬合的穿心蓮內(nèi)酯和阿奇霉素合用對IL?4 和IL?17A 的效應(yīng)參數(shù)表（， n＝6）

表1 量效微分方程模型擬合的穿心蓮內(nèi)酯和阿奇霉素合用對IL?4 和IL?17A 的效應(yīng)參數(shù)表（， n＝6）

圖5 量效微分方程擬合優(yōu)度圖

4 討論

感染性肺炎已成為影響社會(huì)秩序的重大疾病，不論何種感染源，由于呼吸道的開放性和自身定殖菌的存在，幾乎所有的患者疾病進(jìn)展中均會(huì)合并一定的細(xì)菌感染。阿奇霉素由于其廣譜、高效、良好的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和極好的安全性，已成為肺炎相關(guān)病的重要用藥之一。近年來，除直接的抗菌作用外，阿奇霉素也被證實(shí)具有一定的抗炎作用［10］。其直接抗菌而間接降低炎癥的刺激源，同時(shí)抑制STAT1 和NF?κB 等炎癥通路，降低相應(yīng)的炎癥因子產(chǎn)生和分泌，避免機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴［11］。當(dāng)肺部受到細(xì)菌侵襲時(shí)，機(jī)體全面啟動(dòng)免疫應(yīng)答，誘發(fā)炎癥。在炎癥反應(yīng)的早期階段，TNF?α 是最早出現(xiàn)且最重要的炎癥因子，可進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞［12］；單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成IL?1β 介導(dǎo)外周循環(huán)的炎癥因子在肺泡和肺間質(zhì)聚集，加重炎癥反應(yīng)［13］；IFN?γ 可增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性［14］；IL?4、IL?6、IL?10 發(fā)揮免疫刺激效應(yīng)，是反映肺部感染及疾病嚴(yán)重程度的重要參考指標(biāo)［15?17］。在此過程中，Th17細(xì)胞分泌的IL?17A 在中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化作用中扮演了重要角色，并與肺炎感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［18］。

本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)使用阿奇霉素可降低INF?γ、IL?10 和IL?17A 給藥時(shí)程的整體濃度。在阿奇霉素給藥中段TNF?α、IL?4、IL?6 的濃度具有反彈現(xiàn)象，這可能與其殺菌后死亡菌體刺激體內(nèi)免疫反應(yīng)，并強(qiáng)于其直接抗炎反應(yīng)有關(guān)。合并使用穿心蓮內(nèi)酯后這一現(xiàn)象得到了極大緩解。既往研究表明穿心蓮抗菌作用較差，但對炎癥等體細(xì)胞反應(yīng)在較低劑量時(shí)仍具有極強(qiáng)的抑制作用［19］。因此，抗菌藥物與穿心蓮內(nèi)酯合用對感染性肺炎可能是雙作用的整合，即抗菌藥物發(fā)揮對抗感染源，降低肺部病原微生物數(shù)量，而穿心蓮內(nèi)酯作用于感染引起的機(jī)體炎癥與免疫環(huán)節(jié)，減輕病理損傷，整體性地改善了患者的臨床表現(xiàn)。本研究表明，引入穿心蓮內(nèi)酯可顯著增加對相關(guān)炎癥因子的分泌抑制，這一作用符合加和原理，即合用雖不產(chǎn)生級聯(lián)放大的增效作用，但也沒有影響療效的交互影響。

同時(shí)，本研究表明穿心蓮內(nèi)酯與阿奇霉素的作用強(qiáng)度存在顯著區(qū)別。對IL?4，穿心蓮內(nèi)酯的價(jià)效約為阿奇霉素的200 倍。但兩者針對IL?17 A 的作用強(qiáng)度相似。模型揭示穿心蓮內(nèi)酯的IC50較大，效價(jià)強(qiáng)度較低，具有低效價(jià)高效應(yīng)的作用特點(diǎn)。這也說明了穿心蓮內(nèi)酯在保證足夠的給藥量或改善相關(guān)生物利用度后，其最終作用仍較為明顯。提示中藥應(yīng)用時(shí)，相關(guān)量效的研究具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值，基于量效微分藥效動(dòng)力學(xué)的群體建模與參數(shù)擬合可以較準(zhǔn)確的獲取具有參考意義的相關(guān)參數(shù)，可作為一個(gè)判斷藥物聯(lián)用合理性的一個(gè)重要應(yīng)用方法加以深入探索。