陳靜文 陳先勇 趙龍飛 柳蔚李世剛喻玲玲*

［1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌443002； 2.三峽大學(xué)人民醫(yī)院（宜昌市第一人民醫(yī)院） 病理科，湖北宜昌443000； 3.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌443002； 4.國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理（腫瘤） 科研三級實驗室，湖北 宜昌443002］

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一［1］，嚴(yán)重威脅人類健康?；熑允侵委熃Y(jié)腸癌的主要手段，但化療藥物嚴(yán)重的不良反應(yīng)等問題使其臨床應(yīng)用受到很大的限制。因此尋找能高效殺傷腫瘤細胞同時毒副作用小的藥物，是當(dāng)今抗腫瘤新藥研發(fā)的熱點。

延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.是土家族四大名藥之一，別名“頭頂一顆珠、芋兒七”。其味甘性溫，有消痛去腫、止血解毒、安神活血等功效，主治肺癰瘡腫、疔瘡腫毒、頭痛眩暈、神經(jīng)衰弱等疾病，因其果實呈圓球形生長在上部故得名“天珠”。而其根莖下方生多數(shù)細根，加工成藥材時常將其編扎在根莖之外方，形成球狀，又因其生長在地下，又稱“地珠”［2］。延齡草總皂苷是其主要的化學(xué)成分［3］。研究表明，延齡草總皂苷（Trillium Total Saponins，TTB）對結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等均有顯著抑制作用［4］。RAS是目前所知最保守的癌基因之一，參與細胞生長、增殖、發(fā)育及分化調(diào)控等重要生理過程，也在細胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。RAS 蛋白的持續(xù)活化可引起細胞快速增殖和抗凋亡信號亢進，由此導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Hans Raskov 等［5?6］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌的發(fā)生與K?ras、APC和P53 基因突變高度相關(guān)。目前，已有許多研究證實延齡草總皂苷可以顯著抑制結(jié)腸癌細胞增殖［7］，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡［8］，抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移［9］，但其可能的分子機制尚未闡明。因此，本課題組觀察了延齡草總皂苷對裸鼠皮下腫瘤的抑制作用以及其對結(jié)腸癌CT26細胞增殖的抑制作用，探討其可能發(fā)生的作用機制，以期為結(jié)腸癌的臨床治療提供基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料

1.1 藥材 本實驗所用中藥延齡草地珠采摘于神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心陳發(fā)菊教授鑒定為延齡草地珠Trillium tschonoskiiMaxim.，植物標(biāo)本保存于三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室（編號TT200509SNJ）。

1.2 試劑 甲醇購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司（批號20180708）；乙醇購自上海滬試化學(xué)試劑有限公司（批號20190123）；石油醚購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司（批號20161207）；乙酸乙酯購自廣東西隴科學(xué)股份有限公司（批號160805）；正丁醇購自廣東華大化學(xué)試劑有限公司（批號20130810）；RPMI?1640 培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司（批號WHO1111803SP）；胰蛋白酶購自杭州吉諾生物有限公司（批號20180806）；胎牛血清（批號1856032）購自美國gibco 公 司；二甲基亞 砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司（批號20160704）；MTT 試劑購自武漢塞維爾生物科技有限公司（批號180909）；BCA 試劑盒（批號RC230516）購自美國Thermo Scientific 公 司；β?actin 抗 體（批號181109）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；RAS 抗體（批號5）、Akt 抗體（批號20）、p?Akt 抗體（批號23）、ERK1／2 抗體（批號21）、p?ERK1／2 抗體（批號17）均購自美國CST 公司。

1.3 儀器 EYELAN?1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海愛郎儀器有限公司；電子天平購自上海天平儀器廠；全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo Electron 公司；MCD175型CO2培養(yǎng)箱購自日本Sanyo 公司；Eppendorf centrifuge 5804R型低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司；超凈臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微型瞬時離心機、免疫印跡儀，凝膠成像儀購自美國Bio?Rad 公司。

1.4 瘤株 小鼠CT26細胞購自上?？吕咨锛夹g(shù)有限公司。

1.5 動物 BALB／c?nu 雌性鼠與雄性鼠各20 只，SPF 級，體質(zhì)量18～20 g，由湖北省實驗動物研究中心供應(yīng)，由三峽大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證編號為SYXK（鄂）2011?0061。

2 方法

2.1 延齡草總皂苷制備 取延齡草地珠于48 ℃恒溫干燥，粉碎后過60 目篩，得到6.4 kg 原藥材粉末。以甲醇為溶劑，利用多功能強制滲漉罐（常壓，65 ℃）提取，每2 h提取1 次，反復(fù)3 次。提取液過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮（溫度48 ℃），干燥得深棕色醇提物浸膏共2.4 kg。甲醇提取浸膏和蒸餾水以1∶1 比例充分混勻，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮（0.1 mPa，50 ℃），真空冷凍干燥得各個萃取物。其中正丁醇萃取部分浸膏723 g，為延齡草總皂苷。經(jīng)比色法測定延齡草中總皂苷的含有量為19.78%。

2.2 建立移植瘤小鼠模型 BALB／c?nu 鼠在三峽大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實驗（體質(zhì)量18～20 g）。取對數(shù)生長期結(jié)腸癌CT26細胞，臺盼藍拒染顯示活細胞＞95%，調(diào)整細胞濃度至4×106／ L，制成細胞懸液，于右腋皮下接種0.2 mL 形成實體瘤。待腫瘤大小約為100 mm3后將荷瘤小鼠隨機分為對照組、5?FU組及高、中、低濃度組，每組8 只。模型組給予生理鹽水灌胃（0.2 mL），低、中、高劑量組分別用延齡草總皂苷水溶液（5、10、15 mg／kg）灌胃。每天給藥1 次，共9 d。

2.3 腫瘤抑制率的計算 每2 天測量1 次體質(zhì)量，觀察給藥組和對照組荷瘤小鼠體征和體質(zhì)量變化情況，并繪制出體質(zhì)量變化圖。給藥第9 天，處死荷瘤小鼠，剝?nèi)×鼋M織并稱取質(zhì)量，計算腫瘤抑制率。抑瘤率＝［（對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）／對照組平均瘤重］×100%。

2.4 病理切片HE 染色 荷瘤小鼠稱定質(zhì)量處死后，剝離瘤體組織，剪取1 cm×1 cm組織固定于10% 甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精?伊紅染色法（hematoxylin?eosin staining，HE）染色，鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。

2.5 RT?PCR 檢測瘤體組織細胞RAS基因表達 稱取150 mg瘤組織置于干燥的玻璃勻漿器內(nèi)，加1 mL TRIzol，充分研磨，提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)為cDNA，然后RT?PCR 的方法檢測RAS基因的表達。采用2－△△CT法分析實驗組和對照組細胞之間RASmRNA 表達的相對差異。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 MTT 法檢測延齡草總皂苷對CT26 體外增殖抑制作用 將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌CT26細胞以5×104／mL 接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入含有不同濃度的延齡草總皂苷（0、3.125、6.25、12.5、25、50 μg／mL）的培養(yǎng)液100 μL，溶劑對照組僅加入含有0.054% DMSO 的培養(yǎng)液，每孔設(shè)置3個平行復(fù)孔，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g／L 的MTT 溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，棄去留存的孵育液，每孔加入150 μL DMSO 置搖床低俗振蕩10 min使得結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀上檢測各孔490 nm 處吸光度值（OD）。計算細胞增殖率＝［（OD給藥組－OD對照組）／OD對照組］×100%。

2.7 Western blot 測定結(jié)腸癌細胞中RAS、Akt、p?Akt、ERK1／2、p?ERK1／2 的表達以及瘤體組織細胞RAS 蛋白的表達 收集對照組和延齡草總皂苷處理各組結(jié)腸癌CT26細胞，用細胞刮收集后加入RIPA細胞裂解液提取總蛋白，用BCA 試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加兔抗RAS（1∶ 1 000）、Akt（1∶ 1 000）、p?Akt（1∶ 1 000）、ERK1／2（1∶ 1 000）、p?ERK1／2（1∶ 1 000）及兔抗β?actin（1∶ 1 000）一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后加對應(yīng)HRP 標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜后，進行化學(xué)發(fā)光。瘤體組織細胞的處理與之類似，取0.1 g 瘤組織放入玻璃勻漿器，加入1 mL RIPA 裂解液，冰上充分研磨，提取蛋白，用相同的方法檢測其中RAS 蛋白的表達。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Western blot 采用Image J 進行灰度分析。定量數(shù)據(jù)以（）表示，n為樣本數(shù)量，兩組間計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腫瘤抑制率 如表2 所示，5?FU組腫瘤抑制率最高為65.15%，延齡草總皂苷高、中、低濃度組也都表現(xiàn)出較好的抑制率，分別為51.22%、34.88%和25.02%，呈一定的濃度依賴趨勢。此結(jié)果說明延齡草總皂苷對小鼠體內(nèi)腫瘤的生長有抑制效果。

表2 延齡草總皂苷對小鼠瘤重的影響（， n＝8）

表2 延齡草總皂苷對小鼠瘤重的影響（， n＝8）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

3.2 延齡草總皂苷對RAS基因表達的影響 如圖2 所示，與對照組相比，延齡草總皂苷的低、中、高濃度組均能降低RAS基因的表達（P＜0.05，P＜0.01），呈濃度依賴性。因此推測延齡草總皂苷抑制腫瘤的生長與抑制RAS基因表達或者其下游通道基因相關(guān)聯(lián)。

圖2 延齡草總皂苷對RAS 基因表達的影響（n＝8）

3.3 延齡草總苷作用腫瘤組織及脾組織HE 染色結(jié)果 與對照組相比，延齡草總皂苷的低、中、高濃度組均可見腫瘤細胞壞死，尤其以中高濃度組明顯，其中可見大片腫瘤細胞壞死。由此說明延齡草總皂苷可促進結(jié)腸癌細胞的凋亡（圖3）。結(jié)果顯示多數(shù)細胞核顯深色，且胞質(zhì)致密、嗜酸性染色（伊紅染色）增強，呈凋亡狀態(tài)。同時，為了觀察延齡草總皂苷對小鼠是否有器質(zhì)性的影響，對荷瘤鼠的脾臟進行切片。如圖4 所示，與對照組相比，各組脾臟切片均未見明顯病變，無明顯差異，說明延齡草總皂苷對正常組織的毒副作用小。

圖3 延齡草總苷作用后腫瘤組織HE 染色（×40）

圖4 延齡草總苷作用后脾臟組織HE 染色（×40）

3.4 延齡草總皂苷降低體內(nèi)RAS 蛋白的表達 如圖5 所示，與對照組相比，延齡草總皂苷的低、中、高濃度組均能降低RAS 蛋白的表達（P＜0.01），而且呈劑量依賴性。

圖5 延齡草總苷對腫瘤組織RAS 蛋白表達的影響（n＝8）

3.5 延齡草總皂苷抑制結(jié)腸癌CT26細胞增殖 延齡草總皂苷處理體外培養(yǎng)CT26細胞24 h 后，MTT 法分析藥物對細胞增殖能力的影響，圖6 顯示延齡草總皂苷對CT26細胞增殖具有抑制作用，抑制效果隨總皂苷濃度的增加而增強。在處理24 h 條件下，延齡草總皂苷作用于CT26細胞的IC50為（10.23±1.02）μg／mL。依據(jù)上述結(jié)果，后續(xù)實驗使用終質(zhì)量濃度分別為5、10 μg／mL 延齡草總皂苷處理的細胞作為實驗組，以0 μg／mL 處理的細胞作為對照組。

圖6 延齡草總皂苷對結(jié)腸癌CT26細胞的增殖抑制作用（n＝3）

圖6 延齡草總皂苷對結(jié)腸癌CT26細胞蛋白表達的影響（n＝3）

3.6 延齡草總皂苷降低結(jié)腸癌CT26細胞RAS 相關(guān)蛋白的表達 進一步分析延齡草總皂苷對于結(jié)腸癌CT26細胞中RAS／AKT／ERK 信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)延齡草總皂苷的高濃度組（10 μg／mL）、低濃度組（5 μg／mL）均能呈濃度依賴性降低RAS 蛋白以及AKT、ERK1／2 及其磷酸化蛋白的表達。由此推測延齡草總皂苷抑制腫瘤生長與抑制RAS／AKT／ERK 信號通路有關(guān)。

4 討論

RAS 基因在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生重要的作用，參與細胞生長、增殖、發(fā)育、分化以及惡性調(diào)控等重要的生理過程，同時RAS 蛋白也是表皮生長因子受體信號通路中的重要成員。表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）參與的細胞信號傳導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌原發(fā)灶形成中扮演著重要角色，其主要通過絲裂原活化蛋白激酶（RAS?RAF?ERK）和磷脂酞肌醇激酶（PI3K?PTEN?AKT）兩條途徑，將細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)細胞核，從而引起核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的增加，進而調(diào)控細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的生理過程［10］。目前也有許多針對RAS／RAF／MEK／ERK 這一信號通路的靶向藥物出現(xiàn)［11］，Jeong 等［12］提出了通過降低蛋白質(zhì)活性從而干預(yù)RAS?ERK 信號通路抗結(jié)腸癌治療的一系列新策略。因此闡明延齡草總皂苷是否通過干擾Ras 信號通路發(fā)揮其抗結(jié)腸癌效果成為本研究的重要內(nèi)容。

在本研究中，體外細胞實驗表明延齡草總皂苷對于體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌CT26細胞的增殖具有抑制作用，其24 h時IC50值為（10.23±1.02）μg／mL，表明其可能是抗結(jié)腸癌的有效成分。體內(nèi)實驗表明延齡草總皂苷有效抑制了裸鼠皮下腫瘤的生長，延齡草總皂苷高、中、低三個濃度也都表現(xiàn)出較好的抑制率，分別為51.22%、34.88% 和25.02%，呈一定的濃度依賴趨勢（見表1）。此結(jié)果說明延齡草總皂苷體內(nèi)對腫瘤的生長有抑制效果，與體外細胞實驗符合。

結(jié)腸癌的發(fā)生與RAS 蛋白的持續(xù)活化有關(guān)，體內(nèi)實驗瘤組織蛋白水平的結(jié)果進一步驗證其劑量依賴性作用（見結(jié)果2），而延齡草總皂苷的高、中、低3個劑量組在mRNA 水平上均能顯著降低RAS基因的表達，而且呈劑量依賴性。因此推測延齡草總皂苷抑制腫瘤的生長與抑制RAS基因表達或者其下游通道有關(guān)聯(lián)。隨后在體外實驗中使用Western blot 法檢測細胞中RAS、AKT、ERK1／2 蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平進一步證實其作用機制，發(fā)現(xiàn)RAS 蛋白、磷酸化AKT 蛋白、磷酸化ERK1／2 蛋白同時呈現(xiàn)濃度依賴性降低趨勢。說明延齡草總皂苷在RAS 信號通路的活化過程中下調(diào)RAS 信號通路下游分子的表達。HE染色結(jié)果同時也提示體內(nèi)中高劑量組延齡草總皂苷可以促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。

綜上所述，延齡草總皂苷在體內(nèi)外均具有抗結(jié)腸癌藥理活性，其機制可能是通過RAS／AKT／ERK 信號通路干擾其下游蛋白的表達，至于其具體的作用靶點還有待進一步研究。本研究有望為抗結(jié)腸癌藥物開發(fā)提供一個新的思路。