卜 蘭 熊 亮 劉 菲張 瀟蒙春旺*郭 力*

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，教育部中藥材標準化重點實驗室，四川 成都611137； 2.西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都611137）

KEY WORDS：Lonicera similisHemsl.；the buds；hexanor?triterpenoid；chemical constituents；isolation and identification

忍冬科忍冬屬植物細氈毛忍冬Lonicera similisHemsl.在我國西南地區(qū)作為金銀花使用，其性寒味甘，具有清熱解毒、疏散風熱的功效［1］。細氈毛忍冬與金銀花在功效主治上有極高的相似性，且其有效成分綠原酸的含量遠高于《中國藥典》 金銀花的收載品種忍冬［2］，在西南地區(qū)，細氈毛忍冬作金銀花使用具有悠久的歷史。近年來關(guān)于忍冬屬植物化學成分及藥理作用的研究較為豐富，主要集中于環(huán)烯醚萜苷、三萜皂苷等活性成分［3?5］及其抗炎解熱、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性［6?9］。課題組前期從細氈毛忍冬乙醇提物中分離得到一系列新的皂苷類化合物，其中一個單糖皂苷顯示顯著的腫瘤細胞毒作用［10］。為進一步研究細氈毛忍冬的藥效物質(zhì)基礎，本實驗結(jié)合多種現(xiàn)代分離純化技術(shù)及波譜技術(shù)，在細氈毛忍冬的乙醇冷浸液中分離得到一個罕見的六降三萜，鑒定為3β，20?二羥基?22，23，24，25，26，27?六降羊毛脂烷?8?烯?11?氧代?29?酸。

1 材料

中壓液相色譜儀（Búchi Gradient Former B?687，Rp C18，40～60 μm，瑞士Welch 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器生化廠）；紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；Milli?Q 超純水儀（美國Milli?pore 公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Bruker?600 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Waters Synapt G2 高分辨質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）。

柱色譜硅膠（200～300 目，H 硅膠、GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；D101 大孔吸附樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；葡聚糖凝膠Sephadex LH?20（瑞典Amershan Pharmacia 公司）；色譜甲醇（美國Sigma 公司）；所用常規(guī)試劑均為分析純，購自成都科龍化學品有限公司。

細氈毛忍冬由四川南江縣百草藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院龍飛老師鑒定為忍冬科植物細氈毛忍冬Lonicera similisHemsl.的干燥花蕾，標本（XZMRD?1）存放于成都中醫(yī)藥大學西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所。

2 提取與分離

細氈毛忍冬干燥花蕾9.5 kg 用70%乙醇冷浸法提取3 次，1 次24 h，將提取液合并，減壓濃縮得到總浸膏。將乙醇總浸膏用蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將正丁醇萃取液濃縮成浸膏，得到細氈毛忍冬正丁醇萃取部位（650 g）。將正丁醇萃取物（650 g）經(jīng)D101 大孔吸附樹脂富集，用10%、30%、50%、70%、95%乙醇進行梯度洗脫，回收溶劑得到5個洗脫部分（A～E）。采用硅膠柱對E 部分（8.35 g）進行色譜分離，經(jīng)二氯甲烷?丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并組成相似的餾分，回收溶劑得到5個洗脫部分（E1～E5）。取E1部分經(jīng)Sephadex LH?20 凝膠柱氯仿?甲醇（1∶1）分離得到6個洗脫部位（E1?1～E1?6），取E1?2 部分經(jīng)制備薄層色譜氯仿?甲醇?水?冰乙酸（7∶3∶0.5∶0.1）及半制備HPLC 色譜甲醇?水（55∶45）分離純化得化合物1（9 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。HR?ESI?MSm／z：405.264 9［M＋H］＋（計算值C24H37O5，405.264 1）分子式C24H36O5，不飽和度為7。其1H?NMR 顯示有5個甲基質(zhì)子信號，分別為δH0.82（s，H3?18）、δH1.17（d，H3?21）、δH1.18（s，H3?19）、δH1.19（s，H3?30）、δH1.36（s，H3?28）；有4個次甲基信號，其中2個氧代次甲基［δH3.61（m，H?20）、δH3.05（dd，H?3）］；剩下的質(zhì)子信號歸屬為7個亞甲基。此外，化合物1的13C?NMR 數(shù)據(jù)表明共24個碳原子，1個特征的α，β 不飽和酮片段［δC201.3（C?11）、δC167.6（C?8）、δC140.0（C?9）］，有2個連氧叔碳δC71.2（C?20）和δC79.6（C?3），1個羧羰基δC186.2（C?29），5個甲基碳δC17.5（C?18）、δC18.0（C?19）、δC23.8（C?21）、δC25.6（C?28）和δC26.1（C?30），7個亞甲基碳δC36.2（C?1）、δC30.4（C?2）、δC26.4（C?6）、δC31.9（C?7）、δC52.0（C?12）、δC32.0（C?15）和δC20.7（C?16），2個次甲基碳δC55.5（C?5）和δC53.7（C?17），以及4個季碳δC49.6（C?4）、δC39.5（C?10）、δC47.3（C?13）和δC53.1（C?14）。為進一步確定化合物結(jié)構(gòu)，進行了2D?NMR 實驗，根據(jù)HSQC 譜對1H 及13C 信號進行了準確歸屬，見表1。通過1H?1H COSY 歸屬出3個自旋耦合片段，分別是H?1／H?2／H?3；H?5／H?6／H?7；H?15／H?16／H?17／H?20／H?21，見圖1。在HMBC 譜中，顯示H3?28 與C?3、C?4、C?5 和C?29 相關(guān)，H?3 與C?2、C?4、C?28 和C?29 相關(guān)可推出28?CH3和29?COOH連在4 位上；H3?18 與C?12、C?13 和C?14 相關(guān)，H3?19 與C?1、C?5、C?9 和C?10 相關(guān)，H3?30 與C?8、C?13、C?14 和C?15 相關(guān)可推出18?CH3、19?CH3、30?CH3分別與C?13、C?10 和C?14 相連；此外，H3?21 與C?17 和C?20 有BC 相關(guān)，H?17 與C?12、C?13、C?16 和C?20 有BC 相關(guān)推出21?CH3與C?20 相連、C?20 與C?17 相連；根據(jù)上述信號表明化合物1為一個罕見的六降羊毛脂烷三萜。為確定化合物1的構(gòu)型。通過NOESY 譜觀察到H3?30 與H?12b 和H?17 有相關(guān)，H3?21 與H?17 有相關(guān)，H?5 與H?3、H?8a 和H?16b 有相關(guān)，H3?28 與H?3、H?5 和16b 有相關(guān)，表明H?3、H?5、H?17、21?CH3、28?CH3和30?CH3為α 構(gòu)型；另外，H?20 與H3?18 和H3?19 有相關(guān)，H3?18 與H?12a、H?15b 有相關(guān)，同時H?15b 與H?8b 有相關(guān)，表明18?CH3、19?CH3為β 構(gòu)型，因此化合物1的結(jié)構(gòu)得到確定，命名為3β，20?二羥基?22，23，24，25，26，27?六降羊毛脂烷?8?烯?11?氧代?29?酸。

表1 化合物1 的1H?NMR（600 MHz， CD3OD） 及13 C?NMR（150 MHz， CD3OD） 數(shù)據(jù)Tab.1 1H?NMR（600 MHz， CD3OD） and13 C?NMR（150 MHz， CD3OD） data of compound 1

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)和主要HMBC 及1H?1H COSY 相關(guān)Fig.1 Structure， key HMBC and1H?1H COSY correlations of compound 1

4 討論

三萜類是細氈毛忍冬發(fā)揮傳統(tǒng)功效的物質(zhì)基礎之一［11］，其中羊毛脂烷型三萜具有良好的研究價值，如從南五味子［12］、擔子菌地皮［13］、弗氏靈芝［14］中發(fā)現(xiàn)的羊毛脂烷型三萜分別具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒的作用。細氈毛忍冬的抗腫瘤作用與其傳統(tǒng)功效“清熱解毒”有著緊密的聯(lián)系，因此研究細氈毛忍冬的羊毛脂烷三萜可為后期研究其抗腫瘤的活性奠定基礎。

本實驗對細氈毛忍冬70% 乙醇冷浸液進行化學成分研究，并分離得到1個罕見的六降羊毛脂烷三萜。目前報道的降碳羊毛脂烷三萜較多，但多為降一碳，以19 位降碳最常見，而降六碳的羊毛脂烷型三萜十分罕見，僅有Ganoderma cochlear中發(fā)現(xiàn)的ganolearic acid A［15］和在灰氈毛忍冬中分離得到的lonimacranthoidin E［16］，同時lonimacranthoidin E 對HeLa細胞具有明顯的抗增殖作用，推測降六碳羊毛脂烷三萜是灰氈毛忍冬蘊含的一類特殊化學成分，該類成分及其活性值得進一步研究。