羅 銳，趙 月，爨向丹，楊星瑩，朱威巍，黃艷蘋，王宣軍*，盛 軍

(1.云南農業(yè)大學普洱茶學教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201; 3. 云南省高原特色農業(yè)產業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】肺癌在全球惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。肺癌是第2大常見癌癥，絕大多數肺癌病例是非小細胞肺癌(NSCLC)[2]。非小細胞肺癌約占所有肺癌病例的85%，其中30%為鱗狀細胞癌(SCC)，70%為腺癌和大細胞癌[3]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，參與細胞生長和存活[4]。人表皮生長因子受體(EGFR)含有一個胞外區(qū)、一個疏水性跨膜段、一個帶有膜旁區(qū)段的胞內區(qū)和一個蛋白激酶活性區(qū)，激酶區(qū)是抗癌藥物開發(fā)中探索最多的結構域之一[5]。EGFR參與影響細胞生長、分化和新陳代謝的磷酸化反應[6]。EGFR的激活始于其胞外區(qū)與內源性表皮生長因子的結合，促進了EGFR 4個成員間不對稱同源和異源二聚體的形成[7]。EGFR的配體激活導致與其家族成員的同源和異源二聚化，這種二聚化導致EGFR磷酸化。EGFR在40%～80%的非小細胞肺癌和許多其他上皮性癌中過表達[8]。靶向EGFR的藥物對于非小細胞肺癌的治療具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】關于Dehydroheliobuphthalmin(Dehy)的研究僅有一篇文獻報道，在側柏葉90%的甲醇組分中分離出3種木脂素類化合物，其中Dehy在原代培養(yǎng)的大鼠皮層細胞中，對谷氨酸誘導的神經毒性具有顯著的神經保護作用[9]。但是在白附子中發(fā)現一種木脂素抑制SGC-7901細胞增殖[10]。木脂素類化合物具有細胞毒作用，可以抑制腫瘤細胞的生長，并且某些木脂素類化合物能導致細胞周期阻滯，木脂素的抗腫瘤作用可能受周期阻滯及其細胞毒性的雙重影響。目前抗腫瘤作用機制大體有如下幾個，抑制細胞增殖，誘導分化；誘導細胞凋亡；抗血管生成；逆轉腫瘤細胞耐藥等，還有許多尚不確定的機制尚待研究。Lapatinib，一種口服酪氨酸激酶抑制劑，能有效抑制人類表皮生長因子受體-1(ErbB1)和人類表皮生長因子受體-2(ErbB2)酪氨酸激酶活性。研究中發(fā)現Lapatinib對EGFR和HER2的雙重抑制效果未在非小細胞肺癌中表現出其更加顯著的效果[11]。在三陰性乳腺癌中，Lapatinib通過抑制三磷酸腺苷(ATP)的結合和抑制磷酸化來抑制腫瘤細胞的增殖和存活[12]。雖然Lapatinib在乳腺癌中的治療效果較好，但在野生型EGFR非小細胞肺癌中并未發(fā)現Lapatinib有治療效果，但是其對EGFR過表達的細胞具有一定的抑制效果?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對比了Dehy聯(lián)合應用Lapatinib對NCI-H441和NCI-H1975細胞的影響，從細胞存活率、克隆形成、細胞凋亡情況、細胞周期進展、細胞信號轉導變化方面闡述了二者聯(lián)合應用的作用機制?！緮M解決的關鍵問題】驗證木脂素類化合物與抑制劑聯(lián)合應用是否具有協(xié)同抑制NCI-H441細胞存活的效果，以期為EGFR野生型非小細胞肺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的化合物Dehy，分子式C22H20O8，來源于植物側柏，純度99%，購于云南西力生物技術股份有限公司，其結構式如圖1所示。實驗用細胞NCI-H441和NCI-H1975購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas, VA, USA)，并在含10% FBS和1%P/S的DEME培養(yǎng)基中于37 ℃下在含5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(BINDER; Tuttlingen, Germany)。實驗用抗體購于Cell Signaling Technology公司。

1.2 試驗設計

首先計算化合物Dehy的IC50值，確定Dehy對NCI-H441細胞的最大無顯著性抑制的濃度，利用該濃度的Dehy和Laptinib分別處理NCI-H441細胞和NCI-H1975細胞；試驗設4個處理組，對照組：con；Dehy組：Dehy；Lapatinib組：Lap；Dehy聯(lián)合應用Lapatinib組：Dehy+Lap。并依次測定4個處理的2種細胞存活率、克隆形成；檢測4個處理組的NCI-H441細胞中EGFR信號轉導變化；檢測4個處理的2種細胞凋亡水平和周期進展情況。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與傳代 當細胞匯合度達到85%～90%時，在超凈工作臺中，吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，無菌PBS清洗；培養(yǎng)皿中加入無菌的胰蛋白酶-EDTA(0.25%)1 mL，混勻，放置于恒溫培養(yǎng)箱消化，吹打細胞將懸液移至離心管中，1500 r/min，離心3 min，吸去上清，加入培養(yǎng)基吹打均勻，將細胞懸液按照1∶5的比例，滴入100 mm培養(yǎng)皿，移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT檢測細胞增殖 將細胞接種于96孔無菌培養(yǎng)板中，恒溫培養(yǎng)箱中過夜；然后按照每孔200 μL的規(guī)格加入相應的配好的藥，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，避光4 h；4 h后，吸去每個孔的上清，每孔加入150 μLDMSO，在微孔板震蕩儀上震蕩使孔中的紫色沉淀完全溶解；將96孔板放于酶標儀中，在492 nm處讀取細胞的吸光值。

1.3.3 集落形成實驗 將1×105個NCI-H441細胞和NCI-H1975細胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，過夜，標記并加入相對應的藥，隔2 d換1次新的培養(yǎng)基并重新加入相對應的藥，連續(xù)培養(yǎng)14 d左右；14 d后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，然后每板加入3 mL甲醇固定15 min，棄去甲醇后，再用0.1%結晶紫溶液避光染色20 min，用靜止的水緩慢洗去結晶紫，室溫晾干后拍照；拍照后，加入5%的冰乙酸溶解細胞，溶解轉移至96孔板中，于570 nm處讀取吸光值，設3組平行實驗。

1.3.4 細胞蛋白表達檢測方法 吸光度測定：37 ℃恒溫孵育30 min，將96孔板取出，轉移至多通道酶標儀中，測定其吸光度。測定波長分別為560 nm和630 nm，測定數值均扣除空白孔吸光值，即得到樣品吸光值。樣品濃度的計算：將樣品的吸光度代入公式，計算樣品總蛋白濃度。化學顯影：將A液和B液按1∶1配置，混勻；將膜與AB混合液充分接觸；點擊“Expose”開始曝光。曝光時間根據出現條帶的曝光程度自動選擇曝光停止時間，曝光停止后選擇合適的圖片拷貝。

1.4 數據分析與統(tǒng)計

采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析(mean+SEM，one-way ANOVA)，*P<0.05為差異有顯著性，**P<0.01為差異有明顯顯著性，***P<0.001為差異極顯著。使用GraphPad Prism5作圖軟件，對實驗數據進行作圖。細胞存活率=[(As-Ab)]/[(Ac-Ab)]×100%，As：實驗孔吸光度；Ac：對照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度。細胞抑制率=1-細胞存活率。IC50值計算方法：將濃度轉換未log10，存活率更換為抑制率，利用Graphpad Prism5軟件選擇第一個散點圖，數據錄入表格，選擇“Analyze”，在“XY analyses”中選擇“Nonlinear regression”，選擇“l(fā)og(inhibitor) vs.response”。

2 結果與分析

2.1 Dehy對NCI-H441細胞存活率的影響

隨濃度的增加NCI-H441細胞的存活率逐漸降低；試驗發(fā)現10 μmol是當前的最大無效濃度(P>0.05，圖2)，通過計算得出Dehy的IC50值為14.08 μmol(圖3)，因此Dehy對細胞存活存在一定的抑制效應，試驗濃度確定為10 μmol。

2.2 Dehy+Lap對NCI-H441和NCI-H1975細胞增殖率的影響

Dehy和Lap都分別抑制了NCI-H441細胞的存活率，Dehy +Lap組的NCI-H441細胞存活率要極顯著低于Dehy組和Lap組(P<0.001，圖4)。Lap組與對照組相比NCI-H1975細胞存活率無顯著降低(P>0.05)，并且Dehy+Lap組與對照組(Con)相比NCI-H1975細胞的存活率也未受到顯著抑制(P>0.05，圖5)。

Dehy+Lap組對NCI-H441細胞的抑制率大于Dehy組和Lap組，由于Dehy+Lap僅對EGFR(wild-type)細胞具有抑制效應，而對EGFR(mutant)無抑制這一結果，試驗猜測Dehy聯(lián)用Lap是具有靶向性的。

2.3 Dehy與Lap聯(lián)合應用對NCI-H441和NCI-H1975細胞集落形成的影響

Dehy+Lap組NCI-H441細胞的集落數量顯著減少(圖6)，并且Dehy+Lap組細胞存活率顯著低于Dehy組和Lap組(P<0.001，圖7)；在NCI-H1975細胞中，Dehy+Lap組和其它3組染色結果無明顯變化(圖6)，經SPSS分析也無顯著性差異(P>0.05，圖7)。

2.4 Dehy與 Lap聯(lián)合應用對NCI-H441細胞EGFR信號通路的影響

Dehy+Lap組顯著抑制NCI-H441細胞p-EGFR、p-JNK、p-JAK、p-Stat3、p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平。這表明Dehy聯(lián)用Lap抑制EGFR下游的2條信號通路相關蛋白的表達水平。

2.5 Dehy與 Lap聯(lián)合應用對NCI-H441凋亡率的影響

Lap處理細胞后凋亡總數少于對照(Con)，Dehy+Lap處理后，細胞早期凋亡和晚期凋亡的數量都大于對照組(Con)、Dehy組和Lap組(P<0.001，圖9)。這表明Dehy聯(lián)用Lap具有增加NCI-H441細胞凋亡率的效果。

2.6 Dehy 與Lap聯(lián)合應用對NCI-H441和NCI-H1975細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

由圖10可知，與對照組(Con)、Dehy組和Lap組相比，Dehy+Lap組cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著增加；Bcl-2蛋白表達降低；Bax蛋白表達增加；cleaved-PARP蛋白表達增加。這表明Dehy聯(lián)用Lap通過激活Bcl-2家族、Caspase家族相關蛋白，并通過PARP和Caspase-3來執(zhí)行NCI-H441細胞的凋亡。Dehy+Lap處理NCI-H1975細胞24 h后，未能激活Bcl-2家族、Caspase家族相關蛋白。這表明在NCI-H1975細胞中Dehy聯(lián)用Lap不能調節(jié)相關細胞凋亡蛋白水平。

2.7 Dehy與Lap聯(lián)合應用對NCI-H441和NCI-H1975 細胞周期相關蛋白表達水平的影響

由圖11可知，在NCI-H441細胞中Dehy+Lap組與對照組(Con)、Dehy和Lap組相比，其增加p21蛋白表達水平，因此抑制CDK2蛋白表達水平，進而抑制CyclinE蛋白表達水平；并且增加p27蛋白表達水平，因此抑制CDK4蛋白表達水平，進而抑制CyclinD蛋白表達水平；p53蛋白與細胞周期阻滯、DNA修復相關，在此次實驗中Dehy聯(lián)用Lap后NCI-H441細胞p53蛋白表達水平增加。這表明Dehy聯(lián)用Lap能夠阻礙NCI-H441細胞從S期至G2期。Dehy+Lap處理NCI-H1975細胞后，細胞周期蛋白(CyclinE、CyclinD)未受到抑制、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK2、CDK4)未受到抑制，并且 (p21Waf1/Cip1、p27Kip1)蛋白表達也未增加。這表明在NCI-H1975細胞中Dehy聯(lián)用Lap對細胞周期進展無明顯影響。

3 討 論

3.1 抑制劑對EGFR野生型非小細胞肺癌治療效果差

表皮生長因子受體(EGFR)在多種腫瘤的增殖和轉移中起關鍵作用。EGFR 40%～80%在NSCLC過表達[13]。當EGF等配體與EGFR結合之后，EGFR與ErbB家族其他成員發(fā)生同源或異源二聚化，導致其胞漿尾部特定酪氨酸殘基的磷酸化，從而激活細胞下游信號通路，促進細胞增殖、分化、血管生成和運動[14]。酪氨酸激酶抑制劑在EGFR活性激酶結構域ATP結合位點結合，但由于其作用效率低，并會發(fā)生獲得性耐藥和點突變的原因，第一代酪氨酸激酶抑制劑不能完全的抑制EGFR(wild-type)活化，慢慢的(TKIs)成了EGFR野生型非小細胞肺癌患者二線或三線環(huán)境中的治療選擇。然而，其反應率很低，只有大約25%能達到疾病控制[15]。

3.2 EGFR野生型非小細胞肺癌治療趨向于聯(lián)用

目前EGFR(wild-type)的治療趨向于聯(lián)合治療，且治療方案較少。Jian-Shu Lou發(fā)現銀杏黃酮和順鉑聯(lián)合處理后，銀杏黃酮誘導的鐵下垂和順鉑誘導的細胞凋亡效應均被聯(lián)合用藥放大，對EGFR野生型非小細胞肺癌細胞毒作用增強[16]。Ke Li研究發(fā)現在A549細胞中，Quinalizarin抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，與Icotinib聯(lián)用部分恢復了細胞對Icotinib的敏感性，聯(lián)合使用CK2抑制劑(Quinalizarin)和伊考替尼比單獨使用伊考替尼有更好的抗腫瘤活性[17]。YM155和厄洛替尼的聯(lián)合應用,顯著提高了Erlotinib對A549(EGFR野生型)的敏感性[18]。Taichi Takashina 等利用EZH2抑制劑3-deazaneplanocin A與HDAC抑制劑 (SAHA)聯(lián)合處理抑制了H1299細胞和A549細胞EGFR信號轉導，并且聯(lián)合處理協(xié)同抑制了所有受試NSCLC細胞系的增殖[19]。EZH2抑制劑GSK343和DZNep聯(lián)合吉非替尼能逆轉H1299細胞和A549細胞對EGFR-TKIs的耐藥性[20]。Jade H.-M. Hsu 發(fā)現Withaferin A與常規(guī)化療藥物聯(lián)合治療EGFR野生型肺癌患者[21]。Lecia V. Sequist 發(fā)現Seribantumab聯(lián)合Erlotinib治療EGFR野生型非小細胞肺癌患者的隨機II期試驗中，Seribantumab和Erlotinib的聯(lián)用改善了患者PFS(無進展生存期)[22]。Chun-Hau Dai 研究發(fā)現Afatinib和雷公藤紅素聯(lián)合應用可有效抑制H23和H292細胞存活，其機制可能與誘導細胞凋亡有關[23]。

3.3 天然化合物的抗癌前景廣闊，但缺乏機理驗證

由于替代藥物未能發(fā)現免疫抑制和癌癥等關鍵治療領域的新實體，人們對天然產物的研究重新產生了興趣[24]。目前近63%的抗癌藥物是天然產物，或者可以追溯到天然產物來源[25]。對于野生型非小細胞肺癌，利用Lap就可以沿著活化的EGFR下游蛋白尋找其作用靶點。結合Dehy這一天然產物具有多種生物活性，其抗癌作用已有部分研究成果，但都是單獨用藥，由于該類化合物的種類較多，其對細胞的作用機理尚不清楚。因此，筆者猜測Dehy可能存在類似EGFR配體的功能，其能結合到EGFR胞外結構域，進而減少EGFR的激活，因此當Dehy與Lap聯(lián)合應用時，該組合具有協(xié)同效應。但由于此實驗缺少動物實驗的進一步驗證，因此對Dehy是否與EGFR存在具體的結合位點還有待驗證。

3.4 EGFR野生型非小細胞肺癌患者占比高

當前以EGFR(wild-type)的患者仍然占大多數。EGFR突變陽性患者的發(fā)病率在亞洲人群中約為30%，在西方國家中僅為10%～15%[26]。非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的比率為85%，其中超過60%表達野生型EGFR[27]。以EGFR(wild-type)為焦點是研究新的治療策略的開端，本研究利用天然化合物Dehy的抗癌活性為起點，聯(lián)合應用第一代酪氨酸激酶抑制劑Lap，不僅提高了Lap 的利用率，還發(fā)現了聯(lián)合用藥后僅對EGFR(wild-type)細胞NCI-H441有抑制效應，而對NCI-H1975無效這一現象，并解釋了其作用機制為：從細胞EGFR的信號轉導開始，到最終作用細胞核中的關鍵蛋白，整個信號傳遞鏈上都發(fā)現Dehy+Lap的組合調節(jié)了重點的關鍵蛋白，最終影響細胞的增殖分化，這對靶向EGFR(wild-type)細胞NCI-H441的治療方式的更新和作用機制具有重要意義。

4 結 論

經多種細胞實驗證明，Dehy聯(lián)用Lap抑制EGFR及下游相關蛋白磷酸化的表達水平，通過調節(jié)凋亡相關蛋白和增加細胞的凋亡率、調節(jié)周期相關蛋白導致細胞周期阻滯的方式最終抑制EGFR(wild-type)細胞NCI-H441的存活。本研究為野生型非小細胞肺癌臨床應用提供了可能的新的治療策略和新的研究方向。