盧 丹，陳 琴，易和平

（1.鄂州市中心醫(yī)院急診科，鄂州 436000；2.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院急診科，宜昌 443005；3.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，武漢 430000）

心肌炎為一種致病原因復(fù)雜的疾病，病毒、細菌、真菌或支原體都能引起急性或慢性心肌炎癥。其中，以病毒性心肌炎最為常見[1]?？扑_奇病毒（coxsackie virus,CV）為一種腸病毒，可分為A、B兩類，主要經(jīng)呼吸道和消化道感染人體?？梢鸩《拘孕募⊙?、心律失常、慢性腎炎及慢性疲勞綜合征等?？扑_奇病毒B 組3 型（coxsackievirus type B3,CVB3）被證實是引起病毒性心肌炎的主要病原體，造成患者心肌炎和擴張性心肌病，嚴重者可致猝死[2]。目前針對CVB3的治療尚無特效藥物，但關(guān)于抗CVB3的有效中藥成分報道日益增多。姜黃素是提取于姜黃和郁金等姜黃屬植物根莖的含酚基和醌基的天然藥物，中醫(yī)認為其可行氣活血，通經(jīng)止痛[3]。研究表明，姜黃素具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激以及神經(jīng)保護等[4-5]。有報道證實，姜黃素可通過抑制心肌組織炎癥反應(yīng)以及增強心肌自噬活性等，改善自身免疫性心肌炎大鼠的心功能[6-7]。但姜黃素是否能通過調(diào)控炎癥因子或細胞凋亡對病毒性心肌炎發(fā)揮一定的藥理活性還鮮有報道。因此，本研究探究姜黃素對CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的防治效果，為病毒性心肌炎的臨床治療提供潛在候選藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

姜黃素（純度≥95%）購自美國Sigma-Aldrich公司；環(huán)孢素軟膠囊（國藥準字H10960009）購自華北制藥公司；CVB3 病毒購自武漢大學(xué)病毒研究所；MEM Eagle 培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher 公司；4%多聚甲醛購自國藥集團；蘇木素和伊紅染液購自武漢谷歌生物公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肌酸激酶同工酶-MB（creatine kinase-MB Isoenzyme,CKMB）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性檢測試劑盒均購自南京建成；NF-κB p65一抗（貨號：8242）、Cleaved caspase-3 一抗（貨號：9661）、iNOS一抗（貨號：13120）均購自美國CST公司。

動物手術(shù)臺購自浙江大學(xué)動物儀器廠；JJ-12J型脫水機和JB-P5 型包埋機購自武漢俊杰公司；DY89-I 型電動勻漿機購自寧波新芝科器研究所；RT 6000 酶標儀購自美國Rayto 公司；ALLC-10.4 型電子天平購自上海精密科學(xué)儀器公司；TDL-40B型離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；D37520型低溫高速離心機購自Heraeus公司；ECLIPSE 80i型熒光顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 實驗動物

3～4 周齡SPF 級雄性Balb/c 小鼠70 只[許可證號：SYXK（京）2019-0052]，體重（12±2）g，購自北京科興中維生物公司。本實驗涉及到的小鼠經(jīng)過動物倫理委員會批準，且遵循動物實驗減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）的3R原則。

1.3 模型構(gòu)建及分組給藥

CVB3 感染誘導(dǎo)心肌炎小鼠模型構(gòu)建：雄性Balb/c 小鼠共70 只于實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實驗，隨機抽取10 只小鼠作為空白對照組，剩下60 只小鼠用于病毒感染誘導(dǎo)心肌炎模型構(gòu)建。根據(jù)文獻[8]，采用10-5濃度TCID50的病毒小鼠腹腔注射100 μL，空白組注射病毒稀釋液MEM Eagle 100 μL。分別于第7 和14 天補充注射病毒150 μL。于末次病毒注射次日隨機取材2 只造模小鼠，觀察其心肌組織H&E染色出現(xiàn)典型的病理變化，視為造模成功。期間記錄小鼠的體重、活動狀態(tài)和毛色變化等一般狀態(tài)，并記錄小鼠的死亡情況。造模成功的小鼠統(tǒng)一采取灌胃給藥治療。

造模成功小鼠隨機均勻分為5 個實驗組：模型組、環(huán)孢素組、姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組，另以10只正常小鼠作為空白對照組。環(huán)孢素的臨床推薦劑量為2～4 mg/kg，根據(jù)第4 版《中國藥理實驗方法學(xué)》，換算小鼠給藥劑量為成人的9.01倍，確定本研究中小鼠每日環(huán)孢素的給藥劑量為18.02 mg/kg；根據(jù)裴永彬等[9]研究姜黃素低、中、高劑量組的給藥劑量，分別設(shè)為25 mg/kg、50 mg/kg 和100 mg/kg，給藥體積均為200 μL/只。環(huán)孢素及姜黃素均溶于0.3%的羧甲基纖維素鈉灌胃給藥，空白對照組小鼠灌胃給予等體積的0.3%的羧甲基纖維素鈉。每日1次，共給藥14 d。

1.4 心肌組織H&E染色

給藥結(jié)束后，頸椎脫臼處死各處理組小鼠，采用酒精消毒小鼠后，固定四肢，取材心臟組織；然后將其放入預(yù)先準備好的生理鹽水中，漂去多余血液，濾紙吸干水分；然后再沿心臟左室長軸部位將其分成兩份，一份采用4%多聚甲醛固定24h 后，進行常規(guī)石蠟包埋，制作組織切片和H&E染色。另一份采用液氮速凍存入-80 ℃冰箱用于組織蛋白檢測。

1.5 生化指標相關(guān)檢測

給藥結(jié)束后，每組小鼠隨機選取5只，摘眼球方式采集小鼠全血。靜置后6 000 g 離心10 min 分離血清。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書進行炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 及心肌損傷相關(guān)分子CKMB和LDH的含量測定。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印記法檢測心肌組織炎癥及凋亡相關(guān)分子的表達情況

根據(jù)方法“1.4”項，每組小鼠隨機選取5只取出低溫保存的心臟。采用電動勻漿機打碎心臟組織。準備預(yù)冷的1×PBS，將待勻漿組織置于其中漂洗數(shù)次，洗去殘余血液并用濾紙擦拭干凈，稱重計量。定量加入PBS，按組織重和1×PBS體積比為1∶9 的比例完成待測組織的勻漿準備。然后在4 ℃條件下，采用電動勻漿機進行心臟組織勻漿制備。以3 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP 管中。采用BCA 法測定蛋白濃度，然后按照配膠、上樣、電泳、電轉(zhuǎn)和封閉的步驟分別進行SDSPAGE 電泳。通過目的蛋白Cleaved caspase-3、p-NF-κB和iNOS與內(nèi)參蛋白GADPH灰度值的計算，觀察心肌組織目的蛋白的表達情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism5軟件作圖，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般狀態(tài)觀察

對實驗小鼠的狀態(tài)觀察可見，空白對照組10只小鼠均正常飲食、皮毛光澤、活動正常、體重穩(wěn)定升高，且無死亡出現(xiàn)；60只造模小鼠在首次注射CVB3病毒后第4天即出現(xiàn)飲食下降、皮毛粗糙無光澤，活動減少，體重也開始減輕，形態(tài)消瘦；第5 天出現(xiàn)死亡，至3 次病毒注射完成，造模小鼠共計死亡8 只，隨機選取2只存活的模型小鼠進行組織學(xué)觀察造模是否成功。剩余小鼠進行隨機分組，模型組、環(huán)孢素組和姜黃素組分別10只，然后開始灌胃給藥。給藥期間，姜黃素組小鼠較模型組和環(huán)孢素組小鼠狀態(tài)好，給藥期間模型組小鼠死亡5 只，環(huán)孢素組3只，姜黃素低、中劑量組各1只，姜黃素高劑量組無死亡情況。

2.2 姜黃素對小鼠心肌組織病理學(xué)的影響

小鼠心肌組織H&E染色結(jié)果表明，空白對照組小鼠心肌細胞無明顯損傷，形態(tài)完整，細胞核清晰可見，心肌排列整齊，紋理清晰，未見炎性細胞的浸潤；與空白對照組比較，模型組小鼠則可見心肌組織的破壞，部分橫紋肌發(fā)生斷裂溶解，紋理錯亂；給予姜黃素灌胃治療后，可見心肌纖維排列相對整齊，心肌紋理恢復(fù)，心肌細胞的斷裂溶解明顯改善，其對心肌組織的保護作用較環(huán)孢素明顯，見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織H&E染色結(jié)果（×200）

2.3 姜黃素對小鼠血清炎癥相關(guān)因子的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（均P＜0.001）；與模型組比較，姜黃素低、中、高劑量組均可顯著降低小鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平（均P＜0.001），姜黃素高劑量組與環(huán)孢素組作用無明顯差異（均P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 ,n=5

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 ,n=5

與空白對照組比較，#P＜0.01，##P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.001；與環(huán)孢素組比較，&P＜0.001。

2.4 姜黃素對小鼠血清心肌損傷相關(guān)標記物表達的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清CK-MB和LDH 含量顯著升高（均P＜0.001）；與模型組比較，姜黃素低、中、高劑量組小鼠血清CK-MB 和LDH 水平則明顯降低（均P＜0.001），且姜黃素中、高劑量組下調(diào)CK-MB及高劑量組下調(diào)LDH的作用較模型組更明顯（均P＜0.01），見表2。

表2 各處理組小鼠血清CK-MB和LDH水平比較 ,n=5

表2 各處理組小鼠血清CK-MB和LDH水平比較 ,n=5

與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.001；與環(huán)孢素組比較，&P＜0.01，&&P＜0.001。

2.5 姜黃素對模型小鼠心肌組織炎癥及凋亡相關(guān)分子的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠心肌組織凋亡相關(guān)分子Cleaved caspase-3 及炎癥相關(guān)分子p-NFκB 和iNOS 蛋白表達均顯著上調(diào)（均P＜0.001）；與模型組比較，姜黃素低、中、高劑量組p-NF-κB、iNOS蛋白和姜黃素中、高劑量組Cleaved caspase-3蛋白表達均顯著降低（均P＜0.05），姜黃素高劑量組下調(diào)p-NF-κB較環(huán)孢素組更加明顯（P＜0.05），見圖2和表3。

表3 各組大鼠心肌組織凋亡及炎癥相關(guān)蛋白表達比較 ,n=5

表3 各組大鼠心肌組織凋亡及炎癥相關(guān)蛋白表達比較 ,n=5

與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與環(huán)孢素組比較，&P＜0.05。

圖2 各組小鼠心肌組織炎癥及凋亡相關(guān)分子表達

3 結(jié)論

病毒性心肌炎是一種以病毒感染為病因的心臟局部或彌漫性病變，多見于青少年的CVB3 病毒感染?；颊吒腥竞髸?dǎo)致擴張性心肌病和心肌組織溶解壞死，但其致病的具體機制尚未闡明[10]。研究表明，病毒感染后，機體異常的免疫反應(yīng)是引起該類疾病死亡的主要原因之一。除異常的免疫反應(yīng)之外，心肌組織凋亡的觸發(fā)在疾病的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要的角色[11]。Seko 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠發(fā)生急性病毒感染后，心肌組織首先出現(xiàn)自然殺傷細胞的浸潤，隨后大量激活的T細胞產(chǎn)生，免疫細胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α及TNF-β等也隨之高表達，進而誘導(dǎo)心肌細胞損傷。姜黃素是一種具有廣泛藥理活性的天然藥物活性成分。Ahmed等[13]證實姜黃素可改善大鼠實驗性自身免疫性急性心肌炎，降低其硫氧還蛋白的免疫反應(yīng)性。有報道姜黃素可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡相關(guān)通路[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，模型小鼠在注射CVB3病毒后出現(xiàn)飲食下降、皮毛粗糙無光澤，活動減少，體重也開始減輕，形態(tài)消瘦及死亡等情況出現(xiàn)。給藥后觀察到姜黃素組小鼠較模型組和環(huán)孢素組小鼠狀態(tài)好。小鼠心肌組織H&E染色結(jié)果表明，模型組小鼠相較于空白對照組小鼠可見心肌組織的破壞，部分橫紋肌發(fā)生斷裂溶解，紋理錯亂。給予不同劑量姜黃素灌胃治療后，心肌纖維排列相對整齊，心肌紋理恢復(fù)，心肌細胞的斷裂溶解明顯改善，且在一定范圍內(nèi)，高劑量姜黃素對心肌組織的保護作用更加明顯。此外，血清炎癥及心肌損傷相關(guān)標志分子檢測結(jié)果顯示，相較于空白對照組小鼠，模型組小鼠血清炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平和心肌損傷相關(guān)因子CK-MB和LDH含量均顯著升高；給予CVB3 病毒感染模型小鼠不同劑量姜黃素治療后，可見其血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 及CKMB和LDH含量水平均明顯降低，姜黃素高劑量組與環(huán)孢素組作用無明顯差異。由此可得，CVB3 病毒可致小鼠急性病毒性心肌炎的發(fā)生，影響小鼠心肌的組織結(jié)構(gòu)和免疫穩(wěn)態(tài)，給予姜黃素治療后，可明顯改善病毒所致小鼠心肌損傷。

病毒感染所導(dǎo)致的免疫失調(diào)及心肌細胞的凋亡是影響疾病進展的重要因素。caspase-3 屬半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要基因。且caspase-3為凋亡通路的關(guān)鍵分子[16]。NFκB 和iNOS 均參與介導(dǎo)免疫反應(yīng)，NF-κB 是一種具有多功能調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種細胞因子及炎性介質(zhì)表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此與炎性疾病有著密切的聯(lián)系[17]。iNOS為一種誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，其表達水平與炎性介質(zhì)NO 含量呈正相關(guān)關(guān)系。NF-κB還被證實可調(diào)控iNOS的表達，進一步促進炎癥發(fā)展[18-19]。雷蕾等[20]證實caspase-3分子及NF-κB/iNOS 通路參與了CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎大鼠的心肌損傷過程。本免疫印跡結(jié)果檢測顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠心肌組織凋亡相關(guān)分子Cleaved caspase-3及炎癥相關(guān)分子p-NF-κB和iNOS蛋白表達均顯著上調(diào)；給予姜黃素治療后，可見蛋白Cleaved caspase-3、p-NF-κB 和iNOS 的表達水平較模型組明顯降低，說明姜黃素也可作用于caspase-3、NF-κB和iNOS分子發(fā)揮下游效應(yīng)。

綜上所述，姜黃素可顯著改善CVB3 病毒誘導(dǎo)的小鼠血清高TNF-α、IL-1β、IL-6、CK-MB 和LDH含量變化，且這一作用可能通過抑制caspase-3、NFκB和iNOS分子的蛋白表達實現(xiàn)。