牟佳，孫巨勇，牟娜，徐燕>

(1.衡水市婦幼保健院 檢驗(yàn)科，河北 衡水 053000； 2.衡水市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 衡水 053000)

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是一種與早產(chǎn)相關(guān)的慢性肺部疾病，對患兒的不良影響可延續(xù)至成年[1]。近年來，吸氧治療在新生兒科的使用越來越普遍，雖然大大提高了早產(chǎn)兒的存活率，但是長期暴露在高氧環(huán)境中會干擾肺的發(fā)育，導(dǎo)致不可逆的發(fā)育異常[2]。微小RNA(miRNAs)在其中發(fā)揮著重要作用，例如miR- 30a、miR- 34a等都通過調(diào)控HIF- 1α/SIRT1信號通路參與高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡過程[3- 4]。外泌體作為一種豐富而穩(wěn)定的循環(huán)生物標(biāo)志物來源，攜帶并保護(hù)著不同的分子信息(包括miRNAs、mRNA等)不被降解，在疾病診斷和預(yù)后評估方面具有不可忽視的優(yōu)勢[5]。本研究擬選取接受吸氧治療的極低體重早產(chǎn)兒作為研究對象，分析外泌體miR- 30a、miR- 34a與BPD發(fā)生以及患兒短期預(yù)后的相關(guān)性，為BPD的診斷和治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究屬于一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究。選取2018年1月至2020年1月在衡水市婦幼保健院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(neonatal intensive care unit，NICU)住院>28 d的極低體重早產(chǎn)兒作為研究對象，胎齡<320/7周、出生體重<1 500 g，接受有創(chuàng)或無創(chuàng)通氣的呼吸支持。根據(jù)《實(shí)用新生兒學(xué)》[6]關(guān)于BPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合肺部影像學(xué)特征，且出生后吸氧體積分?jǐn)?shù)(fraction of inspiration oxygen，F(xiàn)iO2)>21%、氧依賴超過28 d，則確診為BPD。最終56例BPD患兒(BPD組)和50例非BPD早產(chǎn)兒(非BPD組)納入研究。排除存活時(shí)間<28 d、先天性心肺發(fā)育異常、染色體異常、重大先天性畸形、肺炎、敗血癥(采集血清樣本時(shí))新生兒。另外，根據(jù)《新生兒學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，如果新生兒出生28 d需要氧療，但糾正胎齡36周后不需要氧療則判斷為輕度BPD；而對于糾正胎齡36周后仍然需要氧療的新生兒，則為中重度BPD(FiO2<30%則為中度BPD，F(xiàn)iO2≥30%或需機(jī)械通氣則為重度BPD)。

1.2 方法

1.2.1 新生兒資料調(diào)取 從新生兒出生檔案中調(diào)取相關(guān)產(chǎn)科記錄，包括新生兒性別、出生體重、分娩方式、1 min和5 min Aapgar評分、產(chǎn)前使用激素比例、完全腸道喂養(yǎng)、機(jī)械通氣時(shí)間、合并癥[包括動脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus，PDA)、腦室內(nèi)出血(intraventricular hemorrhage，IVH)、壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)、呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome，RDS)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)]和NICU住院時(shí)間。

1.2.2 血液樣本收集 收集早產(chǎn)兒出生后1、7、14、28 d時(shí)常規(guī)臨床化驗(yàn)后廢棄的靜脈血液標(biāo)本，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清樣本，用于分離血清外泌體。未鑒定的樣品保存在-80 ℃，直至分析。

1.2.3 分離血清外泌體并鑒定 用超速離心法分離外泌體，將血清在4 ℃下3 200 r·min-1離心15 min去除血清中的細(xì)胞和死亡細(xì)胞，5 000 r·min-1離心30 min去除細(xì)胞碎片，然后100 000 r·min-1超速離心2 h得到沉淀。將外泌體用鈾酰- 草酸鹽水溶液(pH 7.0)染色5 min，并用JEM- 1200型透射電子顯微鏡在185 kV電壓下進(jìn)行觀察。應(yīng)用Nanosight NS300納米粒徑跟蹤分析儀采用納米粒徑跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)技術(shù)測定外泌體粒徑大小。另外，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法將等量外泌體通過SDS- PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用含0.1%Tween- 20的5%脫脂牛奶緩沖生理鹽水封閉細(xì)胞膜1 h，用CD63、TSG101、GM130的鼠抗人初級抗體在4 ℃條件下培養(yǎng)4 h，然后與HRP結(jié)合的次級抗體在室溫下孵育1 h。免疫反應(yīng)條帶用電化學(xué)印跡檢測試劑顯示，并顯影固定在X射線片上。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR- 30a、miR- 34a水平 用Qiagen miRNeasy試劑從血清外泌體中提取總RNA。用 NanoDrop ND- 1000分光光度計(jì)對分離RNA的濃度和純度進(jìn)行了評價(jià)。利用TaqManTMMicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對1 μg RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA模板。使用TaqMan miRNA assay試劑盒在7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)。首先，1.5 μl cDNA模板與TaqMan Universal PCR master mix及0.5 μl探針混合。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μl，將反應(yīng)體系在95 ℃下預(yù)變性10 min，然后94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復(fù)進(jìn)行36個(gè)熱循環(huán)。用RQ manager 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，以cel- miR- 39作為內(nèi)部對照，將miR- 30a、miR- 34a的表達(dá)值歸一化為cel- miR- 39，用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 臨床基本資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果

比較BPD組和非BPD組早產(chǎn)兒臨床基本資料，兩組性別構(gòu)成、剖宮產(chǎn)、產(chǎn)前激素使用、胎膜早破發(fā)生率、完全腸道喂養(yǎng)時(shí)長、肺表面活性劑使用以及合并PDA、IVH、NEC發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；但是與非BPD組早產(chǎn)兒比較，BPD組早產(chǎn)兒胎齡、出生體重、1 min和5 min Apgar評分較低，同時(shí)機(jī)械通氣時(shí)長以及RDS、ROP合并癥比例較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 BPD組和非BPD組早產(chǎn)兒臨床資料比較

2.2 血清外泌體提取和鑒定

采用透射電鏡、 NTA技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法對用超速離心法從早產(chǎn)兒外周循環(huán)血血清中分離得到的外泌體進(jìn)行了表征，在透射電鏡視野下外泌體呈典型的圓形或橢圓形、雙層膜結(jié)構(gòu)的囊狀小泡。經(jīng)NTA分析，新生兒靜脈血血清外泌體平均粒徑約為(153.0±3.2)nm，粒子濃度約為(9.45±1.23)×108ml-1。此外，外泌體蛋白標(biāo)志分子CD63和TSG101呈陽性表達(dá)，而GM130則呈陰性表達(dá)。這些結(jié)果均證實(shí)了超速離心法分離的囊泡是外泌體。見圖1。

A.外泌體在透射電鏡下的形態(tài)；B.外泌體粒徑分布曲線；C.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測CD63、TSG101、GM130蛋白表達(dá)

2.3 BPD組和非BPD組早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化

經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，外泌體miR- 30a、miR- 34a水平隨時(shí)間不斷波動變化，在各個(gè)時(shí)間存在水平差異，且這種波動變化可能對BPD的發(fā)生存在一定影響：(1) 時(shí)間效應(yīng)：對于BPD組和非BPD組患兒，組內(nèi)時(shí)間因素對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化具有一定的影響(F時(shí)間值分別為133.968、212.605，均P<0.001)；(2) 組間效應(yīng)：BPD組患兒外泌體miR- 30a、miR- 34a波動范圍較非BPD組患兒更大(F組別值分別為10.088、23.208，均P<0.05)；在產(chǎn)后14、21、28 d時(shí)，BPD組外泌體miR- 30a水平均低于非BPD組(P<0.05)，同時(shí)外泌體miR- 34a水平均高于非BPD組(P<0.05)；(3) 兩組外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化存在時(shí)間和組間交互效應(yīng)(F時(shí)間×組別值分別為13.001、73.826，均P<0.001)，即組間與組內(nèi)因素檢測時(shí)間點(diǎn)的交互作用對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明時(shí)間因素對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平的影響會因BPD的發(fā)生而不同，應(yīng)分析各組的單獨(dú)效應(yīng)。見表2。

表2 BPD組和非BPD組早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化

2.4 輕度和中重度BPD早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化

根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)，BPD組早產(chǎn)兒中有34例為輕度BPD，22例為中重度BPD。經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，外泌體miR- 30a、miR- 34a水平隨時(shí)間不斷波動變化，且這種波動變化可能對BPD的嚴(yán)重程度存在一定影響：(1) 時(shí)間效應(yīng)：對于輕度亞組和中重度亞組患兒，組內(nèi)時(shí)間因素對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化具有一定的影響(F時(shí)間=8.768，P=0.002；F時(shí)間=6.594，P=0.014)；(2) 組間效應(yīng)：重度亞組患兒外泌體miR- 30a、miR- 34a波動范圍較輕度亞組患兒更大(F組別值分別為36.718、19.350，均P<0.001)；在產(chǎn)后21、28 d時(shí)中重度BPD亞組外泌體miR- 30a水平低于輕度BPD亞組(P<0.05)，同時(shí)外泌體miR- 34a水平高于輕度BPD亞組(P<0.05)；(3) 兩個(gè)亞組外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化存在時(shí)間和組間交互作用(F時(shí)間×組別值分別為67.902、33.189，均P<0.001)，即組間與組內(nèi)因素檢測時(shí)間的交互作用對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明時(shí)間因素對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平的影響會隨著BPD嚴(yán)重程度而不同，應(yīng)分析各亞組的單獨(dú)效應(yīng)。見表3。

表3 輕度和中重度BPD早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化

2.5 根據(jù)性別分層分析外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化

輕度BPD亞組和中重度BPD亞組性別構(gòu)成無差別(c2=1.005，P=0.316)。對兩個(gè)亞組進(jìn)行性別分層分析，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，外泌體miR- 30a水平隨時(shí)間不斷波動變化，且這種波動變化可能對不同性別的新生兒BPD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在一定影響：(1) 時(shí)間效應(yīng)：對于男性和女性患兒，組內(nèi)時(shí)間因素對外泌體miR- 30a水平變化具有一定的影響(輕度：F時(shí)間=6.985，P=0.017；中重度：F時(shí)間=9.872，P=0.001)；而不同時(shí)間點(diǎn)外泌體miR- 34a水平差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(輕度：F時(shí)間=2.831，P=0.274；中重度：F時(shí)間=3.159，P=0.133)；(2)組間效應(yīng)：對于輕度亞組和中重度亞組患兒，男性患兒外泌體miR- 30a水平波動范圍較女性患兒更大(輕度：F組別=7.135，P=0.022；中重度：F組別=9.847，P=0.013)；在產(chǎn)后21、28 d時(shí)，輕度BPD亞組女性早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a水平高于男性(P<0.05)，同樣在產(chǎn)后14、21、28 d時(shí)，中重度BPD亞組女性早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a水平高于男性(P<0.05)；而兩個(gè)亞組分層分析外泌體miR- 34a水平差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(輕度：F組別=1.261，P=0.736；中重度：F組別=1.587，P=0.477)；(3) 對于輕度亞組和中重度亞組患兒，不同性別分層的患兒外泌體miR- 30a水平變化存在時(shí)間和組間交互作用(輕度：F時(shí)間×組別=9.305，P=0.017；中重度：F時(shí)間×組別=11.855，P=0.010)；而外泌體miR- 34a水平變化則不存在時(shí)間和組間交互作用(輕度：F時(shí)間×組別=3.496，P=0.473；中重度：F時(shí)間×組別=4.182，P=0.410)。見表4。

表4 輕度和中重度BPD亞組男性、女性患兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化

2.6 產(chǎn)后28 d外泌體miR- 30a、miR- 34a對BPD的診斷價(jià)值

繪制ROC曲線，產(chǎn)后28 d血清外泌體miR- 30a、miR- 34a診斷BPD的AUC分別為0.868(95%CI：0.795～0.915)和0.798(95%CI：0.703～0.854)，閾值為2.14和1.94，在該閾值下靈敏度為72.3%和72.3%，特異度為94.4%和87.8%。見圖2。

圖2 產(chǎn)后28 d外泌體miR- 30a、miR- 34a診斷BPD的ROC曲線

3 討 論

3.1 miR- 30a、miR- 34a與BPD發(fā)生的關(guān)系

BPD是一種慢性肺部疾病，嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的預(yù)后，特別是極低出生體重兒。楊蛟等[7]通過多因素Logistic回歸分析證實(shí)，用氧時(shí)間、最高吸入氧濃度超過40%等是早產(chǎn)兒BPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此高氧致急性肺損傷是新生兒BPD發(fā)病的重要原因，目前尚無特異性的預(yù)防和治療方法。

近年來很多研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在高氧暴露致BPD發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如Zhang等[3]通過動物研究發(fā)現(xiàn)，miR- 30a與新生小鼠肺血管生成密切相關(guān)，將新生C57BL/6小鼠暴露于高氧環(huán)境中，miR- 30a在正常肺發(fā)育過程中處于高表達(dá)狀態(tài)，而在高氧誘導(dǎo)的BPD小鼠模型肺組織中的水平則顯著下調(diào)，并且其調(diào)控機(jī)制與HIF- 1α/Snail1軸有關(guān)。此外，Das等[8]也發(fā)現(xiàn)，在高氧致急性肺損傷的新生小鼠模型肺組織中miR- 34a水平顯著增加，而miR- 34a表達(dá)缺失或抑制可改善BPD小鼠模型的肺表型和BPD相關(guān)性肺動脈高壓，反之，miR- 34a過度表達(dá)則會加重肺動脈高壓，其可能的作用機(jī)制與miR- 34a抑制下游促血管生成素- 1的合成和分泌有關(guān)。上述基礎(chǔ)研究均證實(shí)miR- 30a、miR- 34a均與BPD的發(fā)生過程有關(guān)，兩者有可能成為診斷或防治新生兒BPD的治療選擇。

在本研究中，我們通過對比BPD組和非BPD組早產(chǎn)兒血清外泌體中miR- 30a、miR- 34a的水平變化發(fā)現(xiàn)，隨著氧療的進(jìn)行，兩組早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平均出現(xiàn)波動，且BPD組患兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平波動范圍較非BPD組患兒更大；在產(chǎn)后14、21、28 d時(shí)BPD組外泌體miR- 30a水平均低于非BPD組，同時(shí)外泌體miR- 34a水平均高于非BPD組(P<0.05)。推測外泌體miR- 30a水平下降過快或者miR- 34a水平升高過快可能是影響肺發(fā)育成熟的重要機(jī)制之一。隨著吸氧時(shí)間的延長，肺組織持續(xù)處于高氧狀態(tài)下，NAPDH氧化酶合成增加和活性增強(qiáng)導(dǎo)致大量超氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生，但早產(chǎn)兒的抗氧化酶系統(tǒng)尚未成熟，使肺組織極易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。而miR- 30a具有促血管生成和抗氧化、抗纖維化作用，miR- 30a表達(dá)下調(diào)則意味著肺組織更易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和纖維化進(jìn)展。同樣，miR- 34a也是BPD發(fā)病機(jī)制的主要調(diào)節(jié)因子。Syed等[9]利用基因功能增強(qiáng)和功能喪失策略證實(shí)miR- 34a表達(dá)增強(qiáng)不利于肺組織發(fā)育，相反，沉默miR- 34a表達(dá)則對BPD肺組織相關(guān)表型具有保護(hù)作用，這主要因?yàn)閙iR- 34a下游主要的調(diào)控靶點(diǎn)是Ang1和Tie2，miR- 34a可抑制Ang1和Tie2表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和血管生成水平顯著降低，而細(xì)胞凋亡顯著增加。因此本研究對BPD患者進(jìn)行亞組分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，輕度亞組和中重度亞組患兒外泌體miR- 30a、miR- 34a水平變化存在時(shí)間和組間交互作用，說明組內(nèi)時(shí)間因素對外泌體miR- 30a、miR- 34a水平的影響會隨著BPD嚴(yán)重程度而不同，尤其是在產(chǎn)后21、28 d時(shí)，中重度BPD亞組外泌體miR- 30a水平低于輕度BPD亞組，同時(shí)外泌體miR- 34a水平高于輕度BPD亞組，說明在臨床確診前，BPD新生兒體內(nèi)與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的一些因子已經(jīng)出現(xiàn)表達(dá)異常，這有望成為預(yù)防或延緩BPD進(jìn)展的重要靶標(biāo)。

3.2 miR- 30a作為早產(chǎn)兒BPD性別差異的候選因子

在本研究我們通過對BPD患兒進(jìn)一步進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，外泌體miR- 30a水平隨時(shí)間不斷波動變化，且這種波動變化可能對不同性別的新生兒BPD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在一定影響；在產(chǎn)后21、28 d時(shí)，輕度BPD亞組女性早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a水平高于男性(P<0.05)，同樣在產(chǎn)后14、21、28 d時(shí)，中重度BPD亞組女性早產(chǎn)兒外泌體miR- 30a水平高于男性(P<0.05)。O′Connor等[10]通過流行病學(xué)調(diào)查研究證實(shí)，男性早產(chǎn)兒是發(fā)生BPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這種性別差異可能與氧化應(yīng)激、性激素作用、肺血管發(fā)育、炎癥反應(yīng)等有關(guān)。這種性別差異的分子機(jī)制尚不清楚。最近Zhang等[11]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與雄性相比，高氧暴露的雌性新生小鼠肺泡化和肺血管生成得更好，這可能與miR- 30a的作用有關(guān)。HIF- 1α是誘導(dǎo)miR- 30a表達(dá)的重要因子，HIF- 1α在高氧暴露新生小鼠中的過度表達(dá)可減輕肺損傷。而相較于雄性，雌性小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF- 1α表達(dá)量更高，且經(jīng)高氧暴露后肺部HIF- 1α與其靶基因的結(jié)合率也更高，進(jìn)而導(dǎo)致miR- 30a水平高于雄性。上述結(jié)果表明，miR- 30a性別特異性差異表達(dá)可以調(diào)節(jié)暴露于高氧環(huán)境下的新生兒的肺血管發(fā)育，這在一定程度上也解釋了男性早產(chǎn)兒中BPD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相較于女性早產(chǎn)兒更高。

3.3 外泌體miR- 30a、miR- 34a對BPD的診斷價(jià)值

外泌體是由多種活細(xì)胞(包括各種免疫和非免疫細(xì)胞)分泌的膜結(jié)合磷脂小泡，存在于各種體液中，包括血液、尿液、支氣管肺泡灌洗液、腹水和腦脊液等。外泌體攜帶并保護(hù)著不同的分子信息不被降解，可以從儲存和冷凍的生物樣品中進(jìn)行分析[12]，因此不同細(xì)胞釋放的外泌體可能存在特異性表型。外泌體脂質(zhì)雙層膜將外泌體miRNAs包裹在其中，并保護(hù)它們免受酶降解的影響，從而產(chǎn)生一種適合生物標(biāo)志物的長而穩(wěn)定的表達(dá)時(shí)間。在本研究中我們證實(shí)，早產(chǎn)兒血清外泌體中含有miR- 30a、miR- 34a，并且對于BPD具有較高的診斷價(jià)值。除了具有生物標(biāo)志物的潛能外，外泌體miRNAs還可以通過調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中的生物途徑參與疾病的發(fā)生，因此Willis等[13]提出間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)改善實(shí)驗(yàn)性BPD，恢復(fù)肺功能，有望成為BPD治療的新手段。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)隨著氧暴露時(shí)間的延長，極低出生體重早產(chǎn)兒血清外泌體miR- 30a水平逐漸降低，同時(shí)外泌體miR- 34a水平逐漸升高，尤其是BPD患兒變化更明顯。檢測血清外泌體miR- 30a、miR- 34a表達(dá)有助于BPD的診斷以及對病情發(fā)展的評估。此外在氧暴露過程中，女性早產(chǎn)兒血清外泌體miR- 30a水平高于男性早產(chǎn)兒，這可能是女嬰BPD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)略低于男嬰的原因之一。