梁懷盼，陳璐

（南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京）

0 引言

目前，胃癌仍為我國常見的癌癥，致死率排名前五位。經(jīng)各國科學(xué)家的研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌有許多毒力因子，其中CagA、VacA、OipA等為其主要的致病因子[1]。OipA是一種幽門螺桿菌外膜蛋白基因，編碼相對分子量為34 kD，基因位置HP0638，其編碼產(chǎn)物稱為前炎癥蛋白OipA[2]，可在90%以上胃潰瘍和胃癌患者的病變組織中檢測到OipA蛋白，開放性的OipA與中性粒細(xì)胞的浸潤程度以及胃粘膜高水表達(dá)IL-8密切相關(guān)[3-4]。因此，我們來研究OipA通過何種信號通路，釋放細(xì)胞因子IL-8，進(jìn)一步研究OipA蛋白調(diào)控下游因子釋放IL-8的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞為人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1，江蘇大學(xué)教研室保存。OipA融合蛋白由江蘇大學(xué)教研室王華博士饋贈(zèng)。高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（EDTA）購自上海通善公司；RPMI-1640購自鎮(zhèn)江易貝生物公司；RT-PCR Kit購自TOYOBO公司；RNA提取試劑盒購自Fastgen公司；DEPC水、LPS購自TakaRa公司；DMSO（二甲亞楓）購自Sigma公司。P-38、P-ERK、ERK、抗體購自美國Cell signaling公司。特異性抑制劑PD98059和SB203580購自美國Sigma公司。

1.2 方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)，GES-1細(xì)胞用含100%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。經(jīng)37 ℃，5% CO2，95%濕度環(huán)境培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25% EDTA消化傳代。

（2）將GES-1細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)，稀釋至1×106/mL的濃度轉(zhuǎn)種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞生長基本融合時(shí)，加入蛋白終濃度分別為 1、10、20、40、80 μg/mL 目的蛋白 OipA，經(jīng)培養(yǎng)4 h后，離心5 min，1000 rpm，4 ℃，收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA，用LPS做陽性對照，以未處理組為陰性對照。

（3）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測IL-8 mRNA的表達(dá)各組取10 μg總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總體系20 μL，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min cDNA 產(chǎn)物于-80 ℃保存?zhèn)溆?。GADPH和IL-8引物均由上海生工生物工程公司合成，見表1。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、59 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)后；72 ℃再延伸10 min。最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳跑膠、EB染色、Genius凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)分析并鑒定。

表1 RT-PCR應(yīng)用的PCR引物

（4）信號通路抑制試驗(yàn)，為進(jìn)一步驗(yàn)證OipA是否通過MAPK信號通路，來影響炎癥因子IL-8的表達(dá)。待GES-1細(xì)胞貼壁后，先用50 μm SB203580和PD98059預(yù)處理1 h，然后再加入終濃度為80 μg/mL OipA繼續(xù)培養(yǎng)48 h。再檢測其IL-8mRNA的表達(dá)情況。

（5）Western Blot檢測，加入RIPA緩沖液，裂解。取40 g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)4 ℃，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在室溫下，用封閉液封閉3 h。之后換新封閉液加一抗，經(jīng)37 ℃搖床反應(yīng)1 h，于4 ℃過夜。再用1×PBST洗滌3~5次，每次5 min，并將1×PBST中加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，再用37 ℃搖床反應(yīng)1 h，洗滌3~5次，每次5 min。洗滌完畢后將膜放入顯色液中顯色，并輕輕振蕩顯色液。顯色后，即刻清洗，待膜自然干燥，掃描照像并保存。

2 結(jié)果

2.1 OipA對細(xì)胞表達(dá)IL-8mRNA的影響

經(jīng)不同濃度的OipA融合蛋白作用于GES-1細(xì)胞，經(jīng)4 h后，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行檢測IL-8。陰性對照組未檢測到IL-8 mRNA表達(dá)，而陽性對照LPS和OipA蛋白作用后，4 h時(shí)即可檢測到IL-8 mRNA的表達(dá)。低濃度組未檢測到，而隨著濃度的增加IL-8 mRNA的表達(dá)越多，呈濃度依賴性。

2.2 MAPK信號通路對IL-8表達(dá)的影響

MAPK通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的地位。因此，我們用信號通路抑制劑SB203580和PD98059來檢測MAPK信號通路在OipA釋放細(xì)胞因子IL-8中的作用。我們用SB203580檢測P-38/MAPK信號通路。預(yù)處理GES-1細(xì)胞1 h后，來檢測IL-8 mRNA表達(dá)情況。同樣的方法用PD98059來檢測ERK/MAPK信號通路。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用信號抑制劑后，IL-8 mRNA的表達(dá)沒有明顯差異。

2.3 OipA對MAPK信號通路的影響

將80 μg/mLOipA蛋白作用于GES-1細(xì)胞后，檢測P-38和P-ERK 的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)OipA可以使P-38和ERK磷酸化，上調(diào)其表達(dá)。因此，OipA可通過MAPK信號通路釋放IL-8。

3 討論

近年來，前炎癥蛋白（Outer Imflammatory Protein）及其表達(dá)產(chǎn)物OipA在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的意義逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。OipA是幽門螺桿菌中一種編碼相對分子量為34 kD的外膜蛋白基因，又稱HopH，其是基因位置HP0638編碼產(chǎn)物，又稱為前炎癥蛋白OipA。外國專家Yamaoka[5]發(fā)現(xiàn)在CagA表達(dá)陰性的情況下，HP0638陽性的菌株誘導(dǎo)IL-8的能力比HP0638陰性的菌株強(qiáng)3倍。在對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究中發(fā)現(xiàn)，完全激活I(lǐng)L-8啟動(dòng)子，OipA和CagA是必備條件。但是OipA的作用更為重要，并與IL-8的表達(dá)水平呈正相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OipA參與IL-8的表達(dá)，并且呈劑量依賴性的。IL-8的產(chǎn)生而促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，與NO等炎癥因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在胃癌病變前期，增殖和凋亡可處于相對平衡狀態(tài)，而隨著幽門螺旋桿菌感染長期持續(xù)的感染，血清中IL-8和NO濃度發(fā)生了變化，使增殖與凋亡逐漸失衡，最終發(fā)展成為胃癌。

目前已有研究證實(shí)Hp及其菌體成份，如脂多糖、熱休克蛋白60可經(jīng)激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase, MAPK）啟動(dòng)一系列的轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)胃黏膜的增殖反應(yīng)[7]。然而，OipA促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制目前仍不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OipA可通過P-38和P-ERK通路的活化介導(dǎo)了其對胃癌細(xì)胞的促增殖作用和影響IL-8的表達(dá)。這與Yamaoka報(bào)道的CagA蛋白可以激活ERKl/2通路促進(jìn)細(xì)胞增殖結(jié)果一致[8]。這些結(jié)果提示P-38和P-ERK 信號通路在OipA促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的信號傳導(dǎo)中起重要作用。