陳 華，葉 菁，林 怡，王義祥，劉朋虎

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350003；2.福建省紅壤山地農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，福建福州 350003；3.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】姬松茸（Agaricus blazeiMurrill）又名巴西蘑菇，屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，是一種名貴的食藥兼用型真菌。姬松茸具杏仁香味，味純鮮香，口感脆嫩，不僅是味道獨特鮮美與食用價值頗高的食品，而且子實體富含多糖、糖蛋白復(fù)合體、核酸等生物活性物質(zhì)，具有很高的藥用價值[1]。姬松茸原產(chǎn)巴西、秘魯，它是一種夏秋生長的腐生菌，生活在高溫、多濕、通風(fēng)的環(huán)境中，引進國內(nèi)栽培多年，具有較好的適應(yīng)性與豐產(chǎn)性。20 世紀90 年代初，福建省率先從日本引進姬松茸品種，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種栽培獲得成功[2]，此后逐步推廣到各地。經(jīng)過多年發(fā)展，姬松茸已成為福建省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要增長點之一。目前，姬松茸產(chǎn)業(yè)發(fā)展中存在子實體重金屬鎘富集致使鎘含量超標問題[3]，阻礙了姬松茸的高優(yōu)生產(chǎn)與出口貿(mào)易，影響食品安全與農(nóng)民增收。因此，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低重金屬含量的姬松茸新品種，是亟待協(xié)同攻關(guān)的技術(shù)難題之一，其深入探索與技術(shù)突破將對姬松茸產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量綠色發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】有關(guān)姬松茸鎘富集與影響因素及其響應(yīng)機制研究取得一定的進展與成效；黃建成等[4-5]探討了姬松茸鎘累積特性，闡述了鎘脅迫對菌絲及子實體生長發(fā)育的影響，楊春香等[6]系統(tǒng)開展了鎘對姬松茸菌絲生長影響的研究，徐麗紅等[3]闡述姬松茸對有害重金屬鎘的吸收富集規(guī)律并研究了控制技術(shù)，江枝和等[7-8]、劉朋虎等[9]人先后開展了60Co 輻射誘變姬松茸突變株選育及其子實體營養(yǎng)評價研究，并成功獲得產(chǎn)量高且鎘含量相對較低的姬松茸新菌株。【本研究切入點】項目組以姬松茸菌株J1 為出發(fā)菌株，采用60Co 輻射誘變技術(shù)進行不同輻射劑量梯度處理，通過對不同輻射劑量梯度處理的菌絲顯微結(jié)構(gòu)觀察、分子標記驗證和栽培試驗對比，選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的姬松茸新菌株。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過60Co 輻射誘變姬松茸J1，系統(tǒng)篩選產(chǎn)量高且子實體重金屬含量明顯低于J1 的若干新菌株，并進行一系列的遺傳穩(wěn)定性驗證試驗，系統(tǒng)觀測并有效選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新菌株。本文將總結(jié)并報道姬松茸新菌株（J37）選育過程及其農(nóng)藝性狀與降低重金屬含量的效應(yīng)，以期為姬松茸新品種選育及其綠色生產(chǎn)提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

姬松茸J1，由福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心項目組提供。

1.2 技術(shù)路線

將姬松茸菌株J1 轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基試管上，置于23～26 ℃培養(yǎng)，菌絲滿管1 周后進行60Co 輻射，輻射劑量為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 KGy，劑量率為11.36 Gy·min-1。將經(jīng)過60Co 照射后的菌絲試管置于26 ℃培養(yǎng)箱再培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接到PDA 試管中于23～26 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌絲致死（全部干癟）及其半致死（一半干癟）狀況并分別明確其原先相對應(yīng)的輻射劑量。在半致死劑量條件下再輻照10 支，輻射后轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接4 次，每次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)300 根，挑選菌絲生長均勻、粗壯、扭結(jié)點多，且與原菌株差異明顯的菌株進行后續(xù)的栽培試驗與篩選，同時進行菌絲超微結(jié)構(gòu)、SSR 標記驗證試驗，并通過產(chǎn)量、品質(zhì)、低重金屬含量等主要參數(shù)的比較及其綜合評價，選出姬松茸新菌株J37。

1.3 出菇試驗

將J1、J37 菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，分別觀察姬松茸J1（對照品種）、J37 的菌落形態(tài)，然后進行床栽出菇試驗，觀察誘變菌株J37 與原菌株J1 子實體形態(tài)，對比2 個菌株子實體農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量與若干重金屬吸收累積狀況等。

1.4 原料選擇

栽培原料主要為稻草或蘆葦、牛糞、碳酸氫銨、尿素、過磷酸鈣、石灰、石膏等。前發(fā)酵：先將栽培料堆制發(fā)酵13～18 d，翻堆3～4 次，前發(fā)酵的pH 值為7.3～7.5。后發(fā)酵：將前發(fā)酵的栽培料移到3 層、4 層和5 層滿格堆放，溫度保持57～59 ℃，10 h，后下降到48～52 ℃，保持4～5 d，按照常規(guī)方法進行分床栽培。

1.5 栽培管理

制備麥粒種，播種量為每平方米1.5～2.0 瓶；播種管理：撒播，播種后第1～3 天密閉，促菌絲萌發(fā)，3 d 后開始通風(fēng)讓菌絲往下吃料；覆土的處理：選擇沙壤土為好，適宜含水量為23%～24%，厚度3.5～4.0 cm，促菌絲爬土，爬土后再覆一層 1 cm 細土，通風(fēng)，出現(xiàn)原基后提高菇房空氣相對濕度為88%～92%，有利于出菇整齊，產(chǎn)量提高。

1.6 測定方法

姬松茸不同潮次的主要農(nóng)藝性狀、子實體產(chǎn)量、子實體必需氨基酸總量（按照常規(guī)酸水解方法處理并用島津氨基酸自動分析儀測定）以及子實體鎘（帕金埃爾默PE900Z 石墨爐原子吸收光譜儀）、鉛（石墨爐原子吸收光譜儀）、砷（原子熒光光譜儀）、汞（原子熒光光譜儀）含量測定參照江枝和等[8]的方法操作。采用SPSS19.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長潮次姬松茸新菌株J37 的農(nóng)藝性狀

2.1.1 不同生長潮次姬松茸J37 子實體的朵質(zhì)量 由表1 可知，輻射誘變新菌株J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇的子實體平均朵重，分別比原菌株J1 提高46.81%、42.45%、42.06%和36.84%；不同潮次中，J37 與J1 間的差異均達到顯著或極顯著水平。J37 與J1 子實體朵質(zhì)量都隨著潮次的增加呈逐步降低的趨勢；就第四潮子實體而言，雖然J37 朵質(zhì)量與第一潮子實體相比降幅達52.23%，但仍然比J1 第三潮子實體11.38 g 還高10.9%。

2.1.2 不同生長潮次J37 子實體的蓋質(zhì)量 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均蓋質(zhì)量分別比J1 提高61.68%、71.05%、73.78%和74.60%，J37 與J1 間的差異均達極顯著水平。就第四潮子實體而言，雖然J37 蓋質(zhì)量與第一潮子實體相比降幅達36.42%，但仍然比J1 第一潮子實體蓋質(zhì)量10.70 g 還高2.8%。

2.1.3 不同生長潮次J37 子實體的蓋直徑 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均蓋直徑分別比J1 提高22.86%、39.28%、37.50%和8.57%，第一至三潮菇中J37 與J1 間的差異達到極顯著水平，第四潮菇中J37 與J1 間的差異達到顯著水平。就第四潮子實體而言，雖然J37 蓋直徑與第一潮子實體相比降幅達13.16%，但依然略高于J1 第一潮子實體蓋直徑。

2.1.4 不同生長潮次J37 子實體的蓋厚度 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均蓋厚度分別比J1 提高20.00%、46.55%、15.38%和32.08%，不同潮次中，J37 與J1間的差異均達到顯著或極顯著水平。就第四潮子實體而言，雖然J37 蓋厚度與第一潮子實體相比降幅達22.0%，但仍然與J1 第一潮子實體蓋厚度接近，差異不顯著。

2.1.5 不同生長潮次J37 子實體的蓋高度 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均蓋高度分別比J1 提高29.16%、17.40%、33.33%和16.82%，不同潮次中，J37 與J1 間的差異均達到極顯著水平。就第四潮子實體而言，雖然J37 蓋高度與第一潮子實體相比降幅達19.35%，但仍然比J1 第一潮子實體蓋厚度還高4.16%。

2.1.6 不同生長潮次J37 子實體的柄質(zhì)量 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均柄重分別比J1 提高8.33%、19.17%、10.81%、4.17%，不同潮次中，J37 與J1 間的差異均達到極顯著水平。就第四潮子實體而言，雖然誘變新菌株J37 與第一潮子實體柄質(zhì)量相比降幅達8.33%，但仍然比原菌株J1 第一潮子實體柄質(zhì)量還高1.19%。

表1 不同生長潮次姬松茸J37 菌株的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of J37 harvested in tides

2.1.7 不同生長潮次J37 子實體的柄直徑 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均柄直徑分別比J1 提高27.27%、20.65%、17.24%和15.8%，不同潮次中，J37 與J1 間的差異均達到極顯著水平。從第一潮開始到第四潮，J37 和J1 都呈現(xiàn)下降趨勢，且下降幅度分別為28.57%和26.92%。

2.1.8 不同生長潮次J37 子實體的柄長度 由表1 可知，J1 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的平均柄長度分別比J37 提高30.24%、36.67%、21.26% 和34.57%，不同潮次中，J37 與J1 間的差異均達到極顯著水平。由此表明誘變新菌株J37，在柄長度方面短于原菌株J1。就柄長度變化而言，從第一潮開始，J37、J1 都呈現(xiàn)先高后低的趨勢，且柄長度則分別依次為第二潮、第三潮為較高值。

2.2 不同生長代數(shù)姬松茸新菌株J37 子實體產(chǎn)量變化

由表2 可知，姬松茸新菌株J37 從第一代至第六代子實體的產(chǎn)量分別比原菌株J1提高30.1%、29.7%、24.2%、27.5%、33.0%和29.3%，子實體產(chǎn)量平均提高28.9%；且不同生長代數(shù)中，J1 和J37 間的差異均達到極顯著水平。由此表明姬松茸新菌株J37 在產(chǎn)量方面優(yōu)于原菌株J1。新菌株J37 從第一代開始的子實體產(chǎn)量（2 342 g·m-2）就優(yōu)于原菌株J1（1 800 g·m-2），從第一代栽培到第六代，新菌株J37 則一直保持平穩(wěn)的不減的勢頭，其第六代產(chǎn)量達到2 280 g·m-2，而原菌株J1 則顯示先略有下降，隨后又恢復(fù)的趨勢，其第六代產(chǎn)量為1 763 g·m-2。結(jié)果表明，J37不僅高產(chǎn)而且穩(wěn)定產(chǎn)，也顯示J1 可能存在種性退化，需要進行更新?lián)Q代。

表2 不同生長代數(shù)對J37 子實體產(chǎn)量的影響Table 2 Fruiting body yield of J37 of different generations

2.3 不同潮次姬松茸新菌株 J31 子實體的必需氨基酸含量

由表3 可知，輻射誘變新菌株J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇 和第四潮菇子實體的必需氨基酸含量分別比原菌株J1提高11.54%、12.42%、14.66%和15.92%，且差異均達極顯著水平。由此表明誘變新菌株J37，在必需氨基酸總量方面優(yōu)于原菌株J1。從第一潮到第四潮，J37 和J1 子實體的必需氨基酸含量都呈現(xiàn)出先高后逐步下降的趨勢，但前后差異不顯著。

表3 不同生長潮次J37 子實體的必需氨基酸與重金屬含量Table 3 Essential amino acids and heavy metals in J37 harvested in tides

2.4 不同生長潮次姬松茸新菌株J37 子實體的重金屬含量

2.4.1 不同生長潮次J37 子實體的鎘含量 由表3 可知，輻射誘變新菌株J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇 和第四潮菇子實體的平均重金屬鎘含量分別比原菌株J1 降低37.91%、50.40%、51.26%和52.78%，且差異均達到極顯著水平，表明誘變新菌株J37，在降低重金屬鎘方面的性能優(yōu)于原菌株J1。在實驗室栽培條件之下，無論是新菌株J37，還是原菌株J1，其子實體鎘含量從第一潮到第四潮都呈現(xiàn)從高到低的變化趨勢；到了第四潮，子實體鎘含量分別到為3.30、7.10mg·kg-1；J37 四潮的子實體鎘平均含量比J1下降了48.09%。

2.4.2 不同生長潮次J37 子實體的鉛含量 由表3 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇 和第四潮菇子實體的平均重金屬鉛含量都相對較低，分別比J1 低62.03%、57.89%、55.30%和59.04%，不同潮次中，J1 和J37 間的差異均達到極顯著水平。從第一潮到第四潮，J37 子實體的平均重金屬鉛含量基本維持在0.383 mg·kg-1，且保持相對穩(wěn)定；J1 的子實體平均重金屬鉛含量雖也從第一潮次的1.08 mg·kg-1下降到第四潮次的0.83 mg·kg-1。J37 子實體的平均重金屬鉛含量比J1 下降了58.57%。

2.4.3 不同生長潮次J37 子實體的汞含量 由表3 可知，J37 的第一潮菇子實體的重金屬汞平均含量（0.33 mg·kg-1）低于J1（0.38 mg·kg-1），不同潮次中，J1 和J37 間的差異均達到極顯著水平。輻射誘變新菌株J37 的第二潮菇和第三潮菇子實體的平均重金屬汞含量分別比原菌株J1 的子實體平均重金屬汞含量降低38.46%和30.91%，差異達到顯著水平。輻射誘變新菌株J37 的第四潮菇子實體的平均金屬汞含量比原菌株J1 的子實體平均重金屬汞含量低26.03%，差異達顯著水平。

2.4.4 不同生長潮次J37 子實體的砷含量 GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中規(guī)定，食用菌及其制品中砷的含量應(yīng)維持在0.5 mg·kg-1以下。由表3 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子實體的重金屬砷平均含量比原J1分別低89.13%、76.55%、69.09%和66.25%，不同潮次中，J1 和J37 間的差異均達到極顯著水平；J37 重金屬砷含量比J1 平均降低了75.26%，且低于國家規(guī)定的食用菌中砷的含量。

3 討論與結(jié)論

本研究采用60Co 輻射誘變技術(shù)，成功得到誘變姬松茸高產(chǎn)低重金屬的姬松茸新菌株J37，與原菌株J1 相比，新菌株J37 不僅主要農(nóng)藝性狀較為優(yōu)異、產(chǎn)量相對穩(wěn)定，平均高于對照品種J1 28%以上，而且子實體中鎘、鉛、汞、砷等重金屬含量顯著降低；經(jīng)過在福建省多個市區(qū)試點推廣J37 新菌株，其豐產(chǎn)性與優(yōu)質(zhì)性都相對穩(wěn)定，深受菇農(nóng)群眾喜愛。本研究結(jié)果可為今后姬松茸誘變育種提供有益的參考與借鑒，也為菇農(nóng)生產(chǎn)提供更多的優(yōu)良品種選擇。

誘變育種是利用某些理化因子誘導(dǎo)菌種的遺傳因子產(chǎn)生變化，通過篩選突變體產(chǎn)生新的菌株，其是一種比較有效的育種方法[10]。近年來，食用菌誘變育種發(fā)展迅速，已被成功應(yīng)用于多種食用菌新品種的選育，比如香菇[11]、金針菇[12]、平菇[13]、靈芝[14]、杏鮑菇[15]、真姬菇[16]等。常用的理化誘變因子有：紫外線、60Co、激光、離子束、X 射線、硫酸二乙酯等[17-18]。人工誘變育種雖然操作簡單，周期短，也可以應(yīng)用于人工創(chuàng)造優(yōu)良性狀，如今已經(jīng)成為食用菌新品種選育重要的技術(shù)方法，但后代篩選與鑒定的工作量比較大。本項目組以姬松茸菌株J1的擔(dān)孢子為試驗材料曾經(jīng)獲得2 個低鎘新菌株[19-20]，用60Co 進行輻射，力求進一步篩選低重金屬含量的姬松茸品種，近期項目組獲得新菌株J37，該菌株子實體中重金屬鎘、鉛、汞、砷的含量比原菌株J1 分別低48.09%、58.57%、26.03%、75.26%，可望作為低重金屬姬松茸新品種在生產(chǎn)實踐中推廣應(yīng)用。張卉等[21]以姬松茸菌絲原生質(zhì)體為材料，用紫外線誘變獲得產(chǎn)量顯著提高的誘變菌株。顏春君等[22]利用60Co-γ 射線輻射尖端菌絲，獲得1 株姬松茸優(yōu)良菌株JB6，該菌株在菌絲生長速度、產(chǎn)量等方面都優(yōu)于對照菌株。但由于誘變育種具有方向不可控性，且誘變育種工作量大，故今后應(yīng)加強誘變育種機理及優(yōu)良菌種篩選標準等方面的深入探索，力求為今后利用基因工程手段定向選育奠定基礎(chǔ)。

生產(chǎn)實踐表明，姬松茸生產(chǎn)栽培過程比較容易產(chǎn)生鎘超標現(xiàn)象，這是由于姬松茸品種內(nèi)在特性所決定的[3,23-24]，項目組采用60Co 輻射誘變而成功選育的新菌株J37，不僅子實體鎘含量明顯降低，而且子實體中汞、砷、鉛重金屬含量也顯著降低，但其降低的原因或者機制還需要深入探討，以求闡明內(nèi)在控制因子與相應(yīng)的規(guī)律，為姬松茸產(chǎn)業(yè)化綠色生產(chǎn)積累經(jīng)驗并提供生產(chǎn)標準。