廖文龍，劉坤平，胡建平，甘 亞，林慶宇，段憶翔*

1. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106 2. 成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610106 3.四川大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院分析儀器研究中心，四川 成都 610064

引 言

水作為人類(lèi)健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的必要條件，不僅能維持動(dòng)植物生命活動(dòng)，同時(shí)也為許多微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供天然場(chǎng)所，因此水也成了眾多病原微生物的傳播媒介之一。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，水資源污染日益嚴(yán)重，飲用水污染已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)話題，由水源性病原菌引起的疾病已經(jīng)成為最常見(jiàn)的健康風(fēng)險(xiǎn)之一。除了飲用水，食品安全也是關(guān)乎人民健康與國(guó)計(jì)生民的重大課題，由于細(xì)菌廣泛存在于水、 空氣、 土壤等環(huán)境中，其隱蔽性使之容易成為食品加工、 流通、 及供應(yīng)等環(huán)節(jié)潛在的生物安全隱患，一旦食品發(fā)生病原菌污染則可能引發(fā)難以預(yù)判的公共衛(wèi)生事件。此外，隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，病原菌跨國(guó)傳播的風(fēng)險(xiǎn)也與日俱增。因此加強(qiáng)病原菌快速檢測(cè)，保障飲用水和食品安全，應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件，已成為各國(guó)政府及相關(guān)組織所面臨的迫切任務(wù)。

經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐和探索，我國(guó)已建立了病原菌檢測(cè)基本體系，現(xiàn)行病原菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)大多是基于形態(tài)、 生理、 生化水平的經(jīng)典方法，以及逐步成熟的分子生物學(xué)方法。其中，經(jīng)典方法雖具權(quán)威，但操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)(通常需要3～5 d)，面對(duì)高時(shí)效性和高精密度的市場(chǎng)需求鞭長(zhǎng)莫及。分子生物學(xué)方法將鑒定水平提升至核酸分子，雖具快速、 特異、 高靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但是檢測(cè)條件較為苛刻，需要消耗昂貴的生化試劑進(jìn)行DNA提取、 PCR擴(kuò)增等復(fù)雜前處理，同時(shí)容易因核酸污染和死菌造成假陽(yáng)性結(jié)果[1]。因此開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、 低成本的病原菌快檢技術(shù)對(duì)于保障飲用水和食品安全意義非凡。

激光光譜技術(shù)具有非接觸式測(cè)量、 高靈活性和高測(cè)量速度等優(yōu)點(diǎn)，在過(guò)去幾十年中得到了快速發(fā)展，誕生了包括激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)、 可調(diào)諧激光吸收光譜(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)、 激光拉曼光譜(laser Raman spectroscopy, LRS)、 激光誘導(dǎo)擊穿光譜(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)等多種光譜分析技術(shù)，并成功地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、 環(huán)境保護(hù)、 食品安全、 能源化工等領(lǐng)域[2-6]。近年來(lái)，隨著固體激光器、 電光探測(cè)器和信號(hào)處理等領(lǐng)域的不斷發(fā)展，能夠快速獲取目標(biāo)物分子和原子指紋信息的LRS和LIBS技術(shù)在病原菌快檢領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注，為了進(jìn)一步探索這些指紋光譜技術(shù)在病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用潛力，對(duì)LRS和LIBS在病原菌檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)和局限性進(jìn)行了綜述，并對(duì)其在病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 拉曼光譜

拉曼光譜是基于入射光子與目標(biāo)分子間發(fā)生非彈性碰撞后，光子得到或失去部分能量而散射出不同波長(zhǎng)的光，通過(guò)光譜儀記錄不同波長(zhǎng)的散射光，再與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或數(shù)據(jù)庫(kù)的光譜信息進(jìn)行對(duì)比，可以得到分子化學(xué)鍵指紋信息(如圖1所示)。通過(guò)構(gòu)建目標(biāo)分子的指紋圖庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)物質(zhì)的快速識(shí)別與定性檢測(cè)。盡管早在1928年印度物理學(xué)家Raman就已經(jīng)確認(rèn)了拉曼散射過(guò)程的現(xiàn)象和原理[7]，但由于拉曼散射效應(yīng)太弱(散射光強(qiáng)度約為入射光強(qiáng)的10-8)，早期以汞燈為光源的拉曼光譜采集往往需要長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)十小時(shí)的積分時(shí)間，因此在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)拉曼光譜并沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。直到1960年紅寶石激光器出現(xiàn)后，使用激光作為光源的LRS才使拉曼光譜進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)期，由于激光的單色性好，方向性強(qiáng)，功率密度高，用它作為激發(fā)光源大大提高了激發(fā)效率，從而成為拉曼光譜的理想光源。隨著探測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)和對(duì)被測(cè)樣品要求的降低，目前LRS在物理、 化學(xué)、 生物、 醫(yī)藥、 環(huán)境、 材料工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，越來(lái)越受研究者的重視。

圖1 拉曼光譜獲取目標(biāo)物分子指紋光譜信息Fig.1 Fingerprint spectral information of target molecularobtained by Raman spectroscopy

由于LRS可以提供豐富的指紋光譜，具有非侵入式、 無(wú)損分析、 制樣簡(jiǎn)單、 樣品消耗少、 重現(xiàn)性高以及水相容性等優(yōu)點(diǎn)，而成為病原菌檢測(cè)的潛在工具[8]。然而光譜信號(hào)弱靈敏度低的固有缺陷使得常規(guī)拉曼在生物檢測(cè)中的應(yīng)用困難重重，同時(shí)拉曼光譜對(duì)生物體中復(fù)雜的生物分子沒(méi)有選擇性，往往產(chǎn)生大量重疊光譜信號(hào)導(dǎo)致不同細(xì)菌細(xì)胞中特殊成分的光譜信號(hào)并不突出，此外LRS往往伴隨高強(qiáng)度的熒光背景[9]，因此對(duì)于細(xì)菌檢測(cè)來(lái)說(shuō)并不是一種靈敏的檢測(cè)技術(shù)。為了降低生物體熒光背景提高拉曼信號(hào)的信噪比，20世紀(jì)七八十年代研究人員嘗試采用紫外共振拉曼光譜(ultraviolet resonance Raman spectroscopy, UVRRS)進(jìn)行生物分析[10-11]，即利用波長(zhǎng)接近或等于生物體待測(cè)分子中電子的吸收波長(zhǎng)的激光作為激發(fā)源，比如利用波長(zhǎng)在218～242 nm處的激發(fā)光與核酸堿基發(fā)生共振，波長(zhǎng)在244～257 nm處的激光與含苯環(huán)的氨基酸發(fā)生共振[12]，增加待測(cè)物電子躍遷幾率的同時(shí)增加待測(cè)分子的散射截面，從而達(dá)到降低熒光背景增強(qiáng)待測(cè)物拉曼信號(hào)的目的。然而大多數(shù)細(xì)菌都含有相同的核酸堿基以及含苯環(huán)的氨基酸，因此共振Raman光譜具有較高相似性。盡管Nelson等[13]的研究表明由于不同種類(lèi)的細(xì)菌細(xì)胞中生物分子的豐度存在差異，可以通過(guò)UVRSR的絕對(duì)強(qiáng)度和峰值強(qiáng)度比值的差異進(jìn)行鑒別，但由于UVRRS對(duì)細(xì)菌其余化學(xué)物質(zhì)的響應(yīng)微弱導(dǎo)致選擇性不高，同時(shí)UVRRS使用的紫外波段激光對(duì)細(xì)菌細(xì)胞和生物分子具有嚴(yán)重的光化學(xué)損傷作用，因此其實(shí)用性大打折扣。

盡管UVRRS在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用未能得到較明顯的發(fā)展，但幸運(yùn)的是1974年Fleischmann等發(fā)現(xiàn)粗糙電極能使吡啶拉曼信號(hào)增強(qiáng)的現(xiàn)象[14]，揭開(kāi)了表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)研究的序幕。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是在常規(guī)Raman光譜中引入貴金屬(如Au，Ag，Cu 等)納米粒子作為活性基底，利用其局域表面等離激元共振(LSPR)效應(yīng)，將入射光場(chǎng)能量局域到納米粒子表面，增強(qiáng)周?chē)植侩妶?chǎng)形成“熱點(diǎn)”，當(dāng)待測(cè)物靠近“熱點(diǎn)”后通過(guò)電磁和化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制實(shí)現(xiàn)Raman信號(hào)大幅提升，從而能夠快速獲取目標(biāo)物的指紋光譜信息[15]。SERS除具有常規(guī)Raman光譜的特點(diǎn)外，還表現(xiàn)出熒光淬滅的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)勢(shì)使得SERS在生命分析、 環(huán)境檢測(cè)、 食品安全等眾多領(lǐng)域廣受關(guān)注。

2004年Jarvis等將SERS技術(shù)用于細(xì)菌鑒別[16]，與普通Raman光譜實(shí)驗(yàn)相比，SERS提供的高靈敏度可以使采集時(shí)間從幾分鐘縮短至幾秒鐘，因此成為細(xì)菌檢測(cè)的理想方法。由于SERS信號(hào)受“熱點(diǎn)”效應(yīng)影響顯著，通常只有當(dāng)貴金屬納米粒子間隙小于10 nm 時(shí)才會(huì)產(chǎn)生顯著的“熱點(diǎn)”[17]，因此在采用SERS進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，貴金屬納米粒子(通常為銀納米粒子(AgNPs)或金納米粒子(AuNPs))與細(xì)菌細(xì)胞間的靠近程度十分關(guān)鍵。為了使納米粒子與細(xì)菌細(xì)胞緊密接觸，研究者通常將細(xì)菌與銀或金溶膠混合后再通過(guò)無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)聚集使納米粒子與細(xì)菌細(xì)胞緊密結(jié)合[18]，然而這種方法無(wú)法保證納米粒子在細(xì)菌細(xì)胞上均勻分布，因此SERS光譜的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差。研究顯示在細(xì)菌細(xì)胞原位合成Ag NPs，能夠在一定程度上確保納米粒子與細(xì)菌細(xì)胞接觸更加均勻與緊密，從而提高Raman光譜的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性[19]，然而原位合成需要將細(xì)菌浸入高濃度的硝酸銀或還原劑溶液中，容易造成細(xì)菌細(xì)胞破損而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[20]。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員通過(guò)制備有序納米陣列，或是具有特征拉曼信號(hào)的SERS 標(biāo)簽，開(kāi)發(fā)了一系列基于標(biāo)記和無(wú)標(biāo)記SERS方法進(jìn)行病原菌檢測(cè)[21-23]，然而這些陣列基底或SERS標(biāo)簽制備過(guò)程太過(guò)復(fù)雜，成本較高且難以大規(guī)模制備。因此到目前為止，受金屬納米粒子的材質(zhì)、 形貌、 大小等自身屬性，以及與待測(cè)物距離等多種因素的影響，重現(xiàn)性仍然是SERS 實(shí)際應(yīng)用的一大瓶頸[24]。

近年來(lái)，研究人員不斷探索創(chuàng)新共克難關(guān)，多種改進(jìn)型SERS 技術(shù)為解決重現(xiàn)性問(wèn)題帶來(lái)了新的曙光，如殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜(shell-isolated-nanoparticle enhanced Raman spectroscopy, SHINERS)[25-26]，動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜(dynamic-SERS, D-SERS)[27-28]，以及液相界面拉曼分析技術(shù)等[29-30]，進(jìn)一步推動(dòng)了SERS在食品安全、 環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。其中，D-SERS在樣品從濕態(tài)到干態(tài)的轉(zhuǎn)變過(guò)程中進(jìn)行光譜采集[31]，利用濕態(tài)樣品液體揮發(fā)時(shí)的毛細(xì)力、 靜電力或化學(xué)螯合作用等，驅(qū)動(dòng)納米結(jié)構(gòu)相互靠近并聚集，使樣品經(jīng)歷一個(gè)“無(wú)熱點(diǎn)—最佳熱點(diǎn)—熱點(diǎn)消失”的動(dòng)態(tài)過(guò)程(如圖2所示)。相對(duì)于干態(tài)或濕態(tài)SERS而言，D-SERS由于能夠形成高效均勻的“熱點(diǎn)”，因此具有更高的靈敏度和重現(xiàn)性。在細(xì)菌SERS檢測(cè)中，濕態(tài)樣品雖然可以在一定程度保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受激光損傷，但是卻難以保證細(xì)菌與納米結(jié)構(gòu)有效接觸，因此已報(bào)道的細(xì)菌SERS檢測(cè)以干態(tài)居多，而干態(tài)下細(xì)菌受納米結(jié)構(gòu)與激光雙重作用，難以避免光熱降解等損傷，同時(shí)干態(tài)SERS“熱點(diǎn)”難以控制，因此干態(tài)SERS檢測(cè)可靠性無(wú)法保證。D-SERS對(duì)于細(xì)菌檢測(cè)來(lái)說(shuō)正好結(jié)合了濕態(tài)和干態(tài)SERS的優(yōu)點(diǎn)，在樣品干濕轉(zhuǎn)換過(guò)程中完成檢測(cè)，既可以避免細(xì)菌受到激光損傷，又能夠保證納米粒子與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合緊密形成高效“熱點(diǎn)”，為提供可靠的SERS分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖2 D-SERS熱點(diǎn)形成過(guò)程示意圖Fig.2 A schematic diagram of D-SERShot-spot formation process

目前，D-SERS在細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域的研究報(bào)道尚處于初始探索階段，檢測(cè)對(duì)象主要集中在基質(zhì)較為簡(jiǎn)單的水樣或?qū)嶒?yàn)室模擬樣品。例如Zhou等[32]針對(duì)飲用水中病原菌的快速檢測(cè)，在含細(xì)菌的水中原位合成Ag NPs，利用D-SERS結(jié)合層次聚類(lèi)分析鑒別了飲用水中大腸桿菌和表皮葡萄球菌； 第二軍醫(yī)大學(xué)李皓博士[33]針對(duì)臨床真菌感染的診斷治療難題，利用D-SERS對(duì)耐藥白色念珠菌進(jìn)行了快速診斷和藥物篩選研究。這些研究進(jìn)一步證明D-SERS相對(duì)傳統(tǒng)SERS具有更高靈敏度和重現(xiàn)性。但是在面臨實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)還需考慮諸多因素，實(shí)際樣品基質(zhì)成分比較復(fù)雜，而且細(xì)菌種類(lèi)多濃度低，因此利用D-SERS進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行高效分離富集，以降低基質(zhì)和共存菌干擾，同時(shí)D-SERS是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，如何保持細(xì)菌在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中的穩(wěn)定性也是關(guān)鍵，由此可見(jiàn)開(kāi)發(fā)基于D-SERS的病原菌快速檢測(cè)新方法還需進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究。

2 激光誘導(dǎo)擊穿光譜

1963年Ramsden等直接采用激光器為激發(fā)源進(jìn)行原子光譜分析[34-35]，標(biāo)志著激光誘導(dǎo)擊穿光譜(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)技術(shù)的正式誕生。LIBS技術(shù)是利用脈沖激光聚焦后作用在待測(cè)樣品表面，通過(guò)熱效應(yīng)激發(fā)微量待測(cè)物產(chǎn)生等離子體，最后利用光譜儀對(duì)等離子體的發(fā)射譜線進(jìn)行收集，再與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)中元素的特征譜線進(jìn)行對(duì)比分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物元素檢測(cè)的一種原子發(fā)射光譜技術(shù)(如圖3所示)。隨著近十多年高分辨寬光譜范圍的中階梯光柵光譜儀，高靈敏電荷耦合器件(CCD和ICCD)的快速發(fā)展，以及輕型、 廉價(jià)、 高功率激光器的出現(xiàn)，LIBS技術(shù)成為分析化學(xué)領(lǐng)域一顆冉冉升起的明星[36]。由于LIBS采用脈沖激光作用激發(fā)源，通過(guò)合理的光路設(shè)計(jì)或者使用光纖可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離聚焦，因此LIBS具有遠(yuǎn)程和非接觸檢測(cè)的能力，從而在生化危險(xiǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域受到了眾多研究者的關(guān)注[37-41]。總所周知，激光誘導(dǎo)產(chǎn)生的等離子體特征強(qiáng)烈依賴于激光參數(shù)，如脈沖寬度，脈沖能量，脈沖重復(fù)頻率，激光輻照度等，其中脈沖寬度和脈沖能量是等離子體形成的主要影響因素，根據(jù)LIBS裝置所用的激光脈沖寬度，可將LIBS分為納秒LIBS(nanosecond-LIBS，ns-LIBS)、 皮秒LIBS(picosecond-LIBS, ps-LIBS)和飛秒LIBS(femtosecond-LIBS，fs-LIBS)，其中ns-LIBS和fs-LIBS在細(xì)菌檢測(cè)中的研究報(bào)道相對(duì)較多。

圖3 LIBS裝置示意圖Fig.3 Schematic diagram of LIBS set-up

自2001年“911”恐怖襲擊事件以及緊接著的“炭疽郵件事件”發(fā)生后，世界各國(guó)都開(kāi)始投入巨大物力財(cái)力研究生化危險(xiǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)裝備以應(yīng)對(duì)隨時(shí)可能發(fā)生的生化恐怖襲擊，LIBS技術(shù)由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為生化危險(xiǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域潛在工具[42-43]。納秒激光器具有技術(shù)成熟、 性能穩(wěn)定、 操作簡(jiǎn)單、 使用成本低等優(yōu)勢(shì)，國(guó)外研究人員率先開(kāi)始基于納秒激光器的ns-LIBS技術(shù)在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用探索。2003年Morel等[44]將六種細(xì)菌樣品和兩種花粉樣品干燥后壓片，通過(guò)ns-LIBS獲取了高信噪比的光譜信號(hào)，然后根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞的礦物元素(如鈣、 鎂、 鉀、 鈉、 等)和有機(jī)元素(碳、 氫、 氧、 氮、 磷等)的發(fā)射光譜提出以累計(jì)強(qiáng)度比作為依據(jù)，通過(guò)時(shí)間分辨ns-LIBS進(jìn)行生物危險(xiǎn)品的鑒別。同年，Samuels等[45]利用ns-LIBS檢測(cè)了細(xì)菌孢子、 霉菌、 花粉和蛋白質(zhì)，他們采用孔徑為0.45 μm的銀膜過(guò)濾器對(duì)所有生物樣品進(jìn)行沉積后采集了LIBS光譜，通過(guò)主成分分析法對(duì)單個(gè)激光脈沖的LIBS光譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些光譜數(shù)據(jù)包含足夠的信息來(lái)區(qū)分不同的生物材料。2004年Kim等采用ns-LIBS檢測(cè)了五種非致病微生物，光譜信號(hào)清楚地識(shí)別出了細(xì)菌細(xì)胞中的主要無(wú)機(jī)成分(包括鈣、 鎂、 鉀、 鈉、 鐵、 磷)，最后通過(guò)兩條鈣譜線強(qiáng)度比和兩條磷譜線強(qiáng)度比建立細(xì)菌的指紋光譜完成鑒別[46]。這些早期研究結(jié)果表明，根據(jù)ns-LIBS獲取細(xì)菌細(xì)胞無(wú)機(jī)元素或金屬元素構(gòu)建獨(dú)特的元素指紋光譜庫(kù)識(shí)別細(xì)菌確實(shí)是可行的。

飛秒激光器由于脈寬極短，小于物質(zhì)的熱耦合時(shí)間(皮秒)，因此與物質(zhì)作用時(shí)主要產(chǎn)生多光子電離而非熱分解，同時(shí)極短的脈沖寬度不會(huì)進(jìn)一步加熱等離子體，從而避免等離子體溫度過(guò)高而帶來(lái)的嚴(yán)重連續(xù)輻射背景，因此相對(duì)ns-LIBS而言，fs-LIBS具有更高的信噪比和信背比[47]。此外，fs-LIBS由于激光誘導(dǎo)的等離子體的溫度較低，幾乎可以忽略其對(duì)環(huán)境空氣中氮氧的激發(fā)，而ns-LIBS由于脈沖寬度較大，通常會(huì)持續(xù)加熱誘導(dǎo)產(chǎn)生等離子得到高溫等離子體，高溫等離子體進(jìn)一步激發(fā)剝蝕點(diǎn)附近的空氣而發(fā)射強(qiáng)烈的氮和氧原子光譜，從而干擾有機(jī)或生物材料氮氧元素的發(fā)射譜線[48-49]。因此，采用fs-LIBS檢測(cè)細(xì)菌時(shí)不僅可以得到無(wú)機(jī)元素的光譜信息，還可以有效地獲得CN和C2等重組雙原子分子的光譜信號(hào)，從而獲得更全面的元素信息[50]。Baudelet等[50]采用fs-LIBS分析了五種不同細(xì)菌，得到六種微量礦物元素Na，Mg，P，K，Ca和Fe發(fā)射譜線，這些發(fā)射譜線的強(qiáng)度與其在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的濃度正相關(guān)，因此作者直接根據(jù)這些元素的光譜強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)了五種細(xì)菌的區(qū)分。

早期探索性研究表明ns-LIBS和fs-LIBS均可有效獲取細(xì)菌元素指紋信息，直接通過(guò)化學(xué)譜線強(qiáng)度信息或者結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌分類(lèi)，然而開(kāi)發(fā)基于LIBS的病原菌快檢技術(shù)仍面臨諸多問(wèn)題。首先，由于細(xì)菌的特殊性(體積小、 質(zhì)量小)，利用LIBS采集光譜信號(hào)時(shí)，脈沖激光會(huì)不可避免地?zé)g細(xì)菌負(fù)載基底，當(dāng)基底含有與細(xì)菌相同的元素時(shí)則會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果[51]。雖然通過(guò)培養(yǎng)大量細(xì)菌，凍干壓片后進(jìn)行LIBS測(cè)定可以避免基底信號(hào)的干擾，但是培養(yǎng)并凍干大量致病菌不僅耗時(shí)而且存在一定安全隱患。固體培養(yǎng)基也常作為細(xì)菌負(fù)載基底用于LIBS檢測(cè)[52-53]，然而培養(yǎng)基往往含有大量與細(xì)菌相同的元素，且不同廠家生產(chǎn)的培養(yǎng)基在化學(xué)成分上也存在差異，因此使用培養(yǎng)基作為細(xì)菌負(fù)載基底進(jìn)行LIBS分析反而降低了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。其次，采用LIBS進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)需要采集大量數(shù)據(jù)獲得具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分類(lèi)結(jié)果，同時(shí)要求待測(cè)細(xì)菌濃度較高，而實(shí)際檢測(cè)中細(xì)菌濃度通常較低難以滿足該技術(shù)的測(cè)試要求。

鑒于此，Rehse課題組設(shè)計(jì)了一種離心過(guò)濾器[54-55]，通過(guò)離心可以對(duì)低濃度細(xì)菌進(jìn)行高效濃縮，使LIBS分析檢測(cè)限(LOD)接近103CFU。當(dāng)前LIBS在細(xì)菌快速檢測(cè)方面主要用于細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定，在細(xì)菌定量分析研究方面缺乏足夠投入和關(guān)注。最近，我們課題組利用元素標(biāo)記LIBS(elemental-tags LIBS，ETLIBS)開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌的定量檢測(cè)方法，通過(guò)制備適配體修飾的銅納米粒子作為元素標(biāo)簽，結(jié)合LIBS快速掃描檢測(cè)限可低至61 CFU·mL-1[56]，為L(zhǎng)IBS快速高靈敏定量檢測(cè)細(xì)菌提供新策略。為了將LIBS技術(shù)轉(zhuǎn)化為一種實(shí)用、 可部署的檢測(cè)或診斷工具，在過(guò)去十多年里研究人員進(jìn)行了大量的研究，探索了LIBS硬件設(shè)備、 細(xì)菌培養(yǎng)條件、 以及數(shù)據(jù)處理方法等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[50, 57-59]，不斷發(fā)掘LIBS在病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用潛力，并逐步實(shí)現(xiàn)了從細(xì)菌元素指紋光譜的獲取到死菌與活菌的區(qū)分，從純菌株鑒別到有干擾物共存條件下的準(zhǔn)確鑒別，從細(xì)菌的分類(lèi)到定量檢測(cè)等突破[41]。

3 總結(jié)與展望

激光器的誕生為光譜分析領(lǐng)域帶來(lái)革命性變化，一方面高亮度的激光輻射提高了檢測(cè)靈敏度使痕量測(cè)定成為可能，另一方面激光波長(zhǎng)的可調(diào)諧性對(duì)原子或分子躍遷具有更高的選擇性，只要選擇適宜的波段范圍和方法，就能夠獲得很高的靈敏度和選擇性。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)展，相信小型化、 集成化以及低能耗的LIBS和Raman光譜分析設(shè)備，將在病原菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)以及原位在線檢測(cè)領(lǐng)域扮演重要角色。與此同時(shí)，多種檢測(cè)技術(shù)相互結(jié)合取長(zhǎng)補(bǔ)短，有望進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，如Prochazka等[60]利用LIBS和Raman光譜分別獲取細(xì)菌的分子和元素指紋光譜，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行融合后利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果表明數(shù)據(jù)融合后分類(lèi)準(zhǔn)確率由融合前的45%～50%提高到100%?；贚IBS和Raman光譜在儀器結(jié)構(gòu)和光路設(shè)計(jì)方面的相似性，我們課題組利用波長(zhǎng)為1 064 nm的脈沖激光器和波長(zhǎng)為532 nm的連續(xù)激光器，搭建了一套可以檢測(cè)樣品同一位點(diǎn)元素和分子光譜信息的LIBS-Raman聯(lián)用裝置，并以單晶硅片和銀包金納米粒子(Au@Ag NPs)修飾的硅納米線陣列作為細(xì)菌樣品負(fù)載基底，利用該裝置開(kāi)發(fā)了基于LIBS和SERS相結(jié)合的細(xì)菌快速定量和定性分析新策略[61-62]。Dong課題組[63]將LIBS與膠體金免疫層析技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)目標(biāo)菌在免疫金試紙條檢測(cè)線(T線)上富集顯色進(jìn)行定性分析，然后通過(guò)LIBS獲取T線上富集的金屬納米粒子的發(fā)射光譜信號(hào)，間接實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的定量檢測(cè)。這些聯(lián)用技術(shù)或方法展現(xiàn)了LIBS和Raman光譜在病原菌檢測(cè)領(lǐng)域的靈活性和多樣性，進(jìn)一步拓展了基于激光指紋光譜技術(shù)的應(yīng)用前景，可以預(yù)見(jiàn)隨著分析儀器的快速發(fā)展，能夠提供待測(cè)樣品多維互補(bǔ)信息的聯(lián)用技術(shù)或裝備將成為我們快速探索物質(zhì)本質(zhì)的重要工具和手段。