張 芳，楊蓉佳，付朝霞

1 華池縣人民醫(yī)院，甘肅 華池745600；2 甘肅省人民醫(yī)院

從天然產(chǎn)物中篩選輻射增敏藥物成為癌癥放射治療研究的熱點(diǎn)［1］。近年來(lái)，一種源于苦木科植物鴉膽子種子的活性提取物——鴉膽子苦醇（brusatol，BRU）逐漸進(jìn)入了研究人員的視野，因?yàn)锽RU 能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear transcription 2，Nrf2）的表達(dá)，產(chǎn)生抗腫瘤和抗氧化應(yīng)激等作用［2］。腫瘤細(xì)胞通過(guò)Nrf2途徑產(chǎn)生輻射耐受性是目前癌癥放療的棘手問(wèn)題，而BRU 對(duì)Nrf2 具有抑制作用，無(wú)疑為癌癥的放療以及輻射聯(lián)合藥物治療研究提供了新契機(jī)，國(guó)內(nèi)學(xué)者首次證實(shí)BRU可通過(guò)抑制Nrf2 而增加腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性，是一種潛在天然增敏藥物［3］。然而BRU 聯(lián)合輻射通過(guò)何種途徑抑制Nrf2 表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡至今尚未闡明。本研究探討B(tài)RU抑制Nrf2以及增加非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞輻射敏感性的可能途徑，揭示BRU聯(lián)合輻射誘導(dǎo)H1299細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器二甲基亞砜（dimethyl

sulfoxide，DMSO，批號(hào)：08371）、BRU 和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號(hào)：C0065，美國(guó)Sigma 公司提供）；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8，批號(hào)：C0038）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-FITC/PI，批號(hào)：C1062S）和胞內(nèi)活性氧檢測(cè)試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，批號(hào)：S0033S，碧云天公司提供）；PI3K（Tyr458，批號(hào)：4292）、PI3K（Tyr458，批號(hào)：17366）、Akt（Ser473，批號(hào)：9272）、Akt（Ser473，批號(hào)：4060）、p70S6K（Thr389，批號(hào)：9202）、p70S6K（Thr389，批號(hào)：97596）由美國(guó)Cell signal 公司提供；其他抗體（美國(guó)Abcam 公司）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），其他試劑均由國(guó)內(nèi)公司提供。流式細(xì)胞儀（德國(guó)默克密理博公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein sample 公司）；酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；電泳儀、電泳槽（美國(guó)Biorad公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zessi公司）。

1.2 細(xì)胞人非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞在含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中，在37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 調(diào)整H1299 細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/孔，接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，加入經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的不同濃度BRU，繼續(xù)培養(yǎng)2、6、12、24、48 h，收樣。設(shè)定酶標(biāo)儀吸光值為450 nm，測(cè)定各孔吸光值（A），根據(jù)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)得出BRU的IC50，根據(jù)公式計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=［A450（陰性）-A450（給藥）］/［A450（陰性）-A450（空白）］×100%

1.3.2 BRU 抑制Nrf2 表達(dá)的最佳作用時(shí)間 用IC50的BRU 處理H1299 細(xì)胞2、4、6、12、24、48 h 后，收集細(xì)胞，提取全蛋白，定量、變性后用12% SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃過(guò)夜和二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，分析灰度值。

1.3.3 輻射增敏實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為對(duì)照組、BRU組（IC50）、X 射線組（2 Gy）和BRU 聯(lián)合X 射線組（BRU+2 Gy）。其中BRU組和BRU+2 Gy組用100 nmol/L（IC50）的BRU 預(yù)處理24 h。調(diào)整H1299 細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于6孔板，細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L的BRU 預(yù)處理24 h，采用醫(yī)用直線加速器提供的X 射線一次性照射細(xì)胞，劑量均為1 Gy/min，室溫條件下照射劑量為2 Gy，照射24 h后收細(xì)胞樣。

1.3.4 胞內(nèi)活性氧實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞重懸浮于含有10μmol/LDCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基中，37°C孵育20 min，再用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3 次，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，平均熒光強(qiáng)度值（mean fluorescence intensity，MFI）代表ROS含量。

1.3.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞重懸浮于預(yù)冷的結(jié)合緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 以每孔200 個(gè)細(xì)胞密度接種于6 孔板，同時(shí)設(shè)無(wú)藥對(duì)照組，每組3 個(gè)重復(fù)，在37°C、5%CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)14 天。經(jīng)洗滌、甲醇固定、吉姆薩（Giemsa）染色后，晾干、拍照，計(jì)算肉眼可見(jiàn)的集落數(shù)。

克隆形成率（%）=（克隆集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

1.3.7 蛋白表達(dá)分析 細(xì)胞經(jīng)處理后用蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，用10%和12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗和二抗后，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶，最后用Protein sample 凝膠成像儀拍照并計(jì)算蛋白灰度值。

1.3.8 Nrf2 蛋白免疫熒光定位 將每組經(jīng)細(xì)胞爬片處理的蓋玻片用PBS 清洗3 次，用0.2%的Triton X-100 透化細(xì)胞10 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，用5%的BSA 封閉細(xì)胞30 min，經(jīng)一抗4℃過(guò)夜和熒光二抗孵育。用終濃度為0.5μg/mL 的DAPI染色10 min，PBS清洗3 次，將蓋玻片置于載玻片，用抗淬滅封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRU對(duì)H1299細(xì)胞和Nrf2表達(dá)的抑制作用從6 h開始細(xì)胞生長(zhǎng)呈時(shí)間和劑量依賴性被抑制，在12、24 和48 h 的IC50值 分 別 是350.2、102.4 和100.9 nmol/L，表明100 nmol/L左右的BRU可以顯著抑制H1299 細(xì)胞增殖，因此選用該濃度作為研究濃度。100 nmol/L的BRU作用H1299細(xì)胞6、12、24和48 h后，Nrf2表達(dá)不具有時(shí)間依賴性，BRU處理后24 h，Nrf2 的表達(dá)最低，因此，選取24 h 作為以下研究的時(shí)間點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 BRU對(duì)H1299細(xì)胞和Nrf2表達(dá)的抑制作用

2.2 各組H1299 細(xì)胞克隆存活能力與對(duì)照組相比，BRU 組（P＜0.05）、2 Gy 組（P＜0.01）和BRU+2 Gy組（P＜0.001）H1299細(xì)胞的克隆形成率降低；與2 Gy 組相比，BRU+2 Gy 組細(xì)胞形成率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組H1299細(xì)胞克隆存活能力

2.3 各組H1299 細(xì)胞凋亡情況與對(duì)照組相比，BRU 組（P＜0.01）、2 Gy 組（P＜0.001）和BRU+2 Gy組（P＜0.001）細(xì)胞凋亡率升高；2 Gy 與BRU+2 Gy組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖3。凋亡率（%）=（R4+R5）/R1×100%，R1=1000。

2.4 各組H1299細(xì)胞胞內(nèi)ROS情況與對(duì)照組相比，BRU 組（P＜0.05）、2 Gy 組（P＜0.05）和BRU+2 Gy 組（P＜0.01）MFI 升高；2 Gy 組與BRU+2 Gy 組MFI比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組H1299細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量及H1299細(xì)胞凋亡率

2.5 BRU 聯(lián)合X 射線抑制H1299 細(xì)胞PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號(hào)通路與對(duì)照組相比，BRU組（p-PI3K，P＜0.05；p-Akt，P＜0.01；p-p70S6K，P＜0.05）、2 Gy組（P＜0.01）和BRU+2 Gy 組（P＜0.001）的磷酸化PI3K、Akt 和p70S6K 水平降低（圖4B）；BRU 組Nrf2（P＜0.001）、HO-1（P＜0.001）和NQO-1 表達(dá)降低（圖4D）；BRU+2 Gy組Nrf2（P＜0.001）、HO-1（P＜0.01）和NQO-1（P＜0.01）表達(dá)降低（圖4D）；2 Gy組Nrf2、HO-1 和NQO-1 表達(dá)升高（圖4D），說(shuō)明2 Gy 劑量的X 射線照射會(huì)使H1299 細(xì)胞Nrf2 表達(dá)升高，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用；BRU 組和BRU+2 Gy 組細(xì)胞核中Nrf2 的核位移程度減弱（圖5），2 Gy 組細(xì)胞核中Nrf2的核位移程度增強(qiáng)（圖5）；2 Gy組與BRU+2 Gy組磷酸化PI3K（P＜0.05）和Akt（P＜0.05）水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B），Nrf2（P＜0.001）、Keap1（P＜0.05）、HO-1（P＜0.01）和NQO-1（P＜0.01）的表達(dá)降低。

圖4 各組H1299細(xì)胞PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖5 各組H1299細(xì)胞線粒體凋亡情況

2.6 各組H1299 細(xì)胞線粒體凋亡情況與對(duì)照組相比，BRU組（P＜0.05）、2 Gy組（P＜0.05）和BRU+2 Gy 組Apaf-1（BRU 組P＜0.01；2 Gy 組P＜0.01；BRU+2 Gy組P＜0.001）、bax/bcl-2（BRU組P＜0.01；2 Gy組P＜0.01；BRU+2 Gy組P＜0.01）、cytochrome C（BRU 組P＜0.05；2 Gy 組P＜0.01；BRU+2 Gy 組P＜0.001）和cleaved-caspase 3的表達(dá)升高（BRU組P＜0.05；2 Gy組P＜0.05；BRU+2 Gy組P＜0.001）（圖6B）；2 Gy 組與BRU+2 Gy 組Apaf-1（P＜0.05）、bax/bcl-2（P＜0.05）和cleaved-caspase 3（P＜0.001）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6。

圖6 各組線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)情況

3 討論

從中醫(yī)藥提取的天然產(chǎn)物在抑制腫瘤方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此，從天然產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制入手，探討天然產(chǎn)物聯(lián)合放療對(duì)腫瘤組織的作用方式和途徑，對(duì)促進(jìn)中醫(yī)藥發(fā)展具有重要意義［4］。有研究［5］表明，BRU能夠通過(guò)抑制Nrf2表達(dá)有效抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是具開發(fā)價(jià)值的天然抗腫瘤藥物之一。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，輻射可以抑制PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ROS 含量升高，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這對(duì)理清BRU通過(guò)抑制Nrf2增加腫瘤細(xì)胞輻射敏感性研究提供了思路。本研究以p53 缺失具有輻射耐受性的人非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞為研究對(duì)象，從PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路出發(fā)探討B(tài)RU的輻射增敏作用，揭示其內(nèi)在分子機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，BRU 對(duì)H1299 細(xì)胞生長(zhǎng)和Nrf2 蛋白表達(dá)具有抑制作用。BRU 對(duì)H1299 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，經(jīng)IC50處理的H1299 細(xì)胞，Nrf2 表達(dá)呈時(shí)間依賴性。表明BRU可通過(guò)抑制Nrf2表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖，y該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7-8］。BRU 或X 射線都能抑制H1299 細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告一致［3］。而BRU聯(lián)合X射線能夠更好抑制H1299細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，提示BRU 可增強(qiáng)H1299 細(xì)胞輻射敏感性，進(jìn)而提高放療療效。

Nrf2 是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在控制氧化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞蛋白酶以及維持線粒體功能具有重要作用［9］。正常狀況下，只有小部分Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，大部分Nrf2 與Keap1 結(jié)合形成復(fù)合物，便于被泛素蛋白酶體降解［10-11］。Nrf2被認(rèn)為是重要的細(xì)胞保護(hù)因子之一，腫瘤細(xì)胞Nrf2 的異常激活，與癌癥的藥物治療和輻射耐受性有關(guān)，目前研究人員還未就Nrf2 的調(diào)控機(jī)制達(dá)成一致［12］。有研究［13］發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞重要的存活通路，該通路的激活能夠增加腫瘤細(xì)胞蛋白合成，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過(guò)程，PI3K/Akt 信號(hào)通路已被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、惡化等過(guò)程相關(guān)。相關(guān)研究［14］證實(shí)Nrf2是Akt的靶蛋白之一，Akt 或其上游PI3K 被抑制均可抑制Nrf2 活性，這為揭示BRU 輻射增敏作用的內(nèi)在分子機(jī)制提供了契機(jī)。

本研究結(jié)果表明，BRU 能抑制PI3K 和Akt 磷酸化水平，降低Nrf2 及其下游蛋白表達(dá)，在2 Gy組和BRU+2 Gy 組都能觀察到相似結(jié)果，表明BRU可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制Nrf2活性，增加H1299 細(xì)胞的輻射敏感性。Nrf2 表達(dá)降低使H1299細(xì)胞抗氧化能力減弱，一方面使ROS含量升高，誘發(fā)DNA 損傷應(yīng)答，激活ROS 下游凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］，本研究中BRU 組、BRU+2 Gy組和BRU+2 Gy 組高ROS 含量和細(xì)胞凋亡率能夠證明這一過(guò)程；另一方面，Nrf2 活表達(dá)降低能夠減少其靶蛋白Bcl-2表達(dá)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比例失衡，激活A(yù)paf-1，釋放細(xì)胞色素c，活化Caspase-3，激活線粒體凋亡通路［16］，導(dǎo)致H1299 細(xì)胞凋亡，本研究中線粒體凋亡途徑的Western blotting 結(jié)果能夠證明這一過(guò)程。

綜上所述，BRU 通過(guò)抑制PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路增強(qiáng)H1299細(xì)胞的輻射敏感性，該結(jié)果為BRU的輻射增敏作用機(jī)制研究提供了依據(jù)。