顧 磊，廖 維，周建萍

1 重慶市消防救援總隊(duì)醫(yī)院口腔科，重慶401122；2 陸軍醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院新橋醫(yī)院麻醉科；3 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科

急性牙周炎是以牙周支持組織炎癥為主的一種常見疾病，主要表現(xiàn)為患者牙組織周圍出現(xiàn)不同程度的疼痛及腫脹，臨床多采用中西醫(yī)結(jié)合的治療方法［1］。急性牙周炎屬中醫(yī)學(xué)“牙痛”范疇，多由熱盛所致而以清熱立法［2］，黃芩為最重要的清熱藥之一，是急性牙周炎臨床處方中的常用藥，如楊靖靖等［3］自擬三黃健齒湯，張文娟等［4］自擬牙周敗毒飲等均重用黃芩，并且取得了顯著療效，此外如黃連解毒湯、普濟(jì)消毒飲等治療急性牙周炎的常用古方也多用黃芩以清熱，黃芩苷既是黃芩的主要成分之一，也是使用黃芩的一些處方中發(fā)揮療效的主要活性物質(zhì)之一，如徐田等［5］認(rèn)為黃芩苷是黃連解毒湯中最重要的化合物成分。然而，中藥及其化合物具有多靶點(diǎn)、多通路藥效特點(diǎn)，現(xiàn)階段與黃芩苷效應(yīng)機(jī)制相關(guān)的動物研究、細(xì)胞研究等仍缺乏系統(tǒng)研究，導(dǎo)致與黃芩苷藥效多靶點(diǎn)作用機(jī)制的認(rèn)識存在一定的差距［6-9］，因此采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從整體、系統(tǒng)的角度闡述藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系［10-11］，直觀呈現(xiàn)藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)［12］，有助于理解藥物的多藥理學(xué)及其對生物網(wǎng)絡(luò)的影響，以提高臨床療效［13］。本研究利用藥物靶點(diǎn)預(yù)測、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、拓?fù)浜Y選等網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，揭示黃芩苷治療急性牙周炎的作用機(jī)制，明確其藥用價(jià)值，為黃芩苷治療急性牙周炎藥效機(jī)制的定位和產(chǎn)生協(xié)同作用的潛在蛋白靶點(diǎn)的確定提供研究方法。

1 材料與方法

1.1 黃芩苷化合物信息收集黃芩苷化合物信息來自NCBI pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ZINC數(shù)據(jù)庫（http：//zinc.docking.org/）［14-15］。黃芩苷吸收、分布、代謝和排泄（ADME）篩選標(biāo)準(zhǔn)包括生物利用度（ob）、藥物相似性（dl）、血腦屏障（bbb）等，數(shù)據(jù)來自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫［16］。

1.2 黃芩苷化合物靶點(diǎn)預(yù)測采用兩種方法預(yù)測黃芩苷的靶點(diǎn)信息。在NCBI 數(shù)據(jù)庫（PubMed Central，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）通過檢索“黃芩苷”文獻(xiàn)，獲得已知的黃芩苷靶點(diǎn)；在Pharmmapper數(shù)據(jù)庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）通過反向藥效團(tuán)映射方法識別小分子潛在靶點(diǎn)［17］。

1.3 急性牙周炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)收集及PPI 網(wǎng)絡(luò)建立通過DiseaseGene Network（http：//www.disgenet.org/）收集各種疾病的相關(guān)基因，在“DiseaseGene Network”設(shè)置窗口中將“Select Source”設(shè)置為“All”，將“Select Association Type”設(shè)置為“Any”，將“Select Disease Class”設(shè)置為“Acute periodontitis”，查詢急性牙周炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息［18］?；贒iseaseGene Network 數(shù)據(jù)庫查找急性牙周炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并在STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）建立PPI網(wǎng)絡(luò)［19］。

1.4 基因映射收集黃芩苷治療急性牙周炎的相關(guān)靶點(diǎn)應(yīng)用Cytoscape 軟件將黃芩苷的靶點(diǎn)映射在急性牙周炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 背景網(wǎng)絡(luò)上，提取黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.5 拓?fù)浞治鎏崛↑S芩苷治療急性牙周炎的核心靶點(diǎn)在Cytoscape 軟件對獲取的黃芩苷治療急性牙周炎的相關(guān)靶點(diǎn)計(jì)算3個(gè)拓?fù)湫再|(zhì)“Degree”“ClosenessCentrality”和“Betweenness Centrality，選取3 個(gè)指標(biāo)均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)［20］，篩選出具有拓?fù)渲匾缘摹癏ub”節(jié)點(diǎn)，定義為黃芩苷治療急性牙周炎的核心靶點(diǎn)。

1.6 黃芩苷治療急性牙周炎預(yù)測靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)建立及富集分析基于收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)，在STRING 數(shù)據(jù)建立PPI網(wǎng)絡(luò)［18］，選擇具有高置信度的PPI 進(jìn)行進(jìn)一步研究（low confidence：score＜0.4；medium：0.4-0.7；high：＞0.7）。

在DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）［21］數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular constituent，CC）、分子功能（molecular function，MF）及作用通路。選取P＜0.05的分析結(jié)果，定義為黃芩苷治療急性牙周炎的相關(guān)作用通路及BP、CC、MF；選取P＜0.01，F(xiàn)DR＜1 的分析結(jié)果，定義為黃芩苷治療急性牙周炎的核心作用通路及BP、CC、MF。

基于收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)，在KEGG 數(shù)據(jù)庫［22］搜索并建立核心通路的路線圖，標(biāo)注通路內(nèi)的預(yù)測作用靶點(diǎn)。

1.7 黃芩苷治療急性牙周炎“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)建立基于收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)及DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析的黃芩苷治療急性牙周炎的核心通路，在Cytoscape軟件建立黃芩苷治療急性牙周炎的“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷化合物信息及預(yù)測靶點(diǎn)在TCMSP中獲得了黃芩苷化合物信息（PubChem CID：64982），包括MW=446.39，OB（%）=40.12，DL=0.75，BBB=-1.74，黃芩苷2D結(jié)構(gòu)式，Canonical SMILES結(jié)構(gòu)式為C1=CC=C（C=C1）C2=CC（=O）C3=C（C（=C（C=C3O2）OC4C（C（C（C（O4）C（=O）O）O）O）O）O）O。研究采用兩種方法預(yù)測并獲得了黃芩苷332 個(gè)潛在人類蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)來自7302個(gè)藥效團(tuán)模型。見圖1。

圖1 黃芩苷化合物2D結(jié)構(gòu)

2.2 急性牙周炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)及PPI 網(wǎng)絡(luò)的建立在DiseaseGene Network 數(shù)據(jù)庫共收集獲得了急性牙周炎的44 個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)。在STRING 數(shù)據(jù)庫建立急性牙周炎的PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得了一個(gè)44 個(gè)節(jié)點(diǎn)、343條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 急性牙周炎44個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 基因映射結(jié)果與拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

2.3.1 基因映射 在Cytoscape 軟件中，將黃芩苷353 個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)映射在以急性牙周炎PPI 網(wǎng)絡(luò)為背景的網(wǎng)絡(luò)上，獲得了黃芩苷治療急性牙周炎的13個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 基因映射提取黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)

2.3.2 拓?fù)浞治?黃芩苷治療急性牙周炎的13個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)“Degree”中位數(shù)為10，“Closeness Centrality”中位數(shù)為0.85714286，“Betweenness Centrality”中位數(shù)為0.01515152，其中“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Centrality 均大于中位數(shù)的具有重要拓?fù)湟饬x的節(jié)點(diǎn)共6 個(gè)，即“Hub”節(jié)點(diǎn)，為黃芩苷治療急性牙周炎的核心靶點(diǎn)，見表1。

表1 黃芩苷治療急性牙周炎的“Hub”節(jié)點(diǎn)

2.4 黃芩苷治療急性牙周炎預(yù)測靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)建立、富集分析及“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)建立基于收集獲得的13 個(gè)黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得了一個(gè)13 個(gè)節(jié)點(diǎn)、58 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)，選擇高置信度PPI 獲得了一個(gè)13 個(gè)節(jié)點(diǎn)、38條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。

圖4 黃芩苷治療急性牙周炎的預(yù)測靶點(diǎn)高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)

對收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的13個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，P＜0.05 的富集分析結(jié)果包括34 個(gè)BP，4 個(gè)CC，5 個(gè)MF，5 個(gè)相關(guān)作用通路。其中P＜0.01，F(xiàn)DR＜1 的富集分析結(jié)果包括21 個(gè)BP，3個(gè)CC，2個(gè)MF及4個(gè)核心作用通路。見圖5。

圖5 黃芩苷治療急性牙周炎“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

基于富集分析結(jié)果，建立了黃芩苷治療急性牙周炎的“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖?；贙EGG 建立的4個(gè)核心作用通路的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖建立黃芩苷治療急性牙周炎的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。

圖6 黃芩苷治療急性牙周炎的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

急性牙周炎是一種破壞性的牙周炎性疾病，其炎癥反應(yīng)包括水腫形成、白細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)釋放，發(fā)病機(jī)制網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，但以炎癥反應(yīng)為核心，炎癥可從牙齦組織延伸到鄰近的骨和牙周膜，造成牙周組織不可逆性破壞［23-24］，臨床研究認(rèn)為COX-2 抑制劑、非甾體抗炎藥等具有較好的臨床療效［24］，但是存在副作用大的缺陷［25］。傳統(tǒng)中草藥在急性牙周炎治療中具有療效優(yōu)勢，且副作用低，然而天然中草藥物多靶點(diǎn)、多途徑的藥效、方效特點(diǎn)阻礙了對其作用機(jī)制的深入研究，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供了一種在系統(tǒng)水平方面闡釋黃芩苷生物學(xué)機(jī)制的研究方法。

首先根據(jù)Lipinski 規(guī)則［26］和ADME 參數(shù)［27-28］驗(yàn)證黃芩苷良好的成藥性。在NCBI、TCMSP、Pharmmapper、DiseaseGene Network 數(shù)據(jù)庫分別獲得了黃芩苷的332 個(gè)靶點(diǎn)及急性牙周炎的44 個(gè)靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過建立PPI 網(wǎng)絡(luò)及基因映射、拓?fù)浞治?，獲得了黃芩苷治療急性牙周炎的13 個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)及6 個(gè)具有拓?fù)渲匾缘陌悬c(diǎn)。富集分析結(jié)果表明黃芩苷治療急性牙周炎主要圍繞4 條核心作用通路，涉及21個(gè)BP，3個(gè)CC，2個(gè)MF。

已有研究表明，黃芩苷具有抗凋亡［29］、抗氧化［30］和抗炎作用［31］，黃芩苷治療急性牙周炎的效應(yīng)機(jī)制主要以炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激為主?！癏ub”節(jié)點(diǎn)IL-6、IL-1β、TNF、TLR4［32-34］作為4 條核心通路TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway的上游啟動靶點(diǎn)，介導(dǎo)與MAPK signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、JAK-STST signaling pathway 等多條通路間的復(fù)雜交互作用，如LIN等［35］研究表明NOD-like receptor signaling pathway 與MAPK signaling pathway 的交互作用在PKC 的激活［36］、誘導(dǎo)型一氧化氮合成［37］、炎癥升高［38］中均具有重要作用。而“Hub”節(jié)點(diǎn)IL-6、IL-1β、TNF、Ptgs2、Mmp9 又構(gòu)成了這些信號通路復(fù)雜交互作用形成的下游組分，其中IL-6、IL-1β、TNF是調(diào)控介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的炎癥因子釋放的重要靶點(diǎn)［39］，如ZHENG等［40］認(rèn)為下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF 的表達(dá)可抑制牙周炎；Ptgs2 在炎性介質(zhì)形成過程中具有重要啟動作用［41］，如ZHANG 等［42］研究發(fā)現(xiàn)Ptgs2 啟動子內(nèi)DNA 甲基化水平與COX-2 的表達(dá)相關(guān)性在牙周炎疾病啟動、介導(dǎo)中具有重要作用；Mmp9 則 具 有 重 塑 細(xì) 胞 外 基 質(zhì) 的 作 用［43-44］，如BARREIROS 等［45］認(rèn)為Mmp2 和Mmp9 可通過TLR2 和MyD88 參與牙周炎疾病進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，黃芩苷主要靶向作用于多條炎癥、凋亡等相關(guān)的信號通路上游啟動信號IL-6、IL-1β、TNF、TLR4，及下游功能信號IL-6、IL-1β、TNF、Ptgs2、Mmp9，通過4條核心通路TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway及MAPK signaling pathway 等多條相關(guān)通路間的復(fù)雜交互作用，實(shí)現(xiàn)治療急性牙周炎的抗炎、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激等作用。