劉國乾，龍航宇，朱健潤，李 淦，黃泳欣，黃建豪，陳益填,2，劉思伽*

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510640；2.廣東家禽科學(xué)研究所，廣東廣州 510430；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

中國養(yǎng)鴿業(yè)發(fā)展迅猛，據(jù)中國畜牧業(yè)協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2019 年存籠肉種鴿達(dá)4 500 萬對，年出籠乳鴿7.5 億只，但由于科研力量投入不足以及鴿子特有的生物學(xué)特性，肉鴿養(yǎng)殖技術(shù)落后于其他家禽，其中種鴿生產(chǎn)上的性別鑒別難題仍待解決。鴿性別難以辨別主要是由于鴿子是晚成鳥，出生雛不能像一般家禽（雞、鴨及鵝等）通過翻肛方式進(jìn)行性別鑒定，只能配對上籠時(shí)通過體型外貌及行為特征鑒別公母，但準(zhǔn)確率不高。鴿子是典型的“一夫一妻”制，出現(xiàn)非雌雄配時(shí)，彼此打架，影響鴿舍安寧、產(chǎn)蛋及受精。目前，國內(nèi)外學(xué)者在幼雛鴿性別鑒定方面的應(yīng)用研究不多，主要是通過外貌行為特征、腹腔鏡檢、糞便類固醇檢測及核型等方法進(jìn)行鴿性別鑒定[2]，但這些方法準(zhǔn)確率不高，鑒定過程繁瑣，難以在生產(chǎn)上大規(guī)模推廣。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，利用分子手段對幼雛鴿進(jìn)行性別鑒定，具有準(zhǔn)確性高、操作簡便、成本低、對動物傷害較小等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。已報(bào)道的鴿性別分子鑒定方法主要集中在性染色體特異性片段CHD1[3]與EE0.6[4]，準(zhǔn)確率能達(dá)100%，但已報(bào)道方法大多需繁瑣的鴿基因組抽提步驟，還需瓊脂糖凝膠電泳膠分析結(jié)果，很難在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。張莉等[5]對基因組抽提進(jìn)行改進(jìn)，采用羽毛和血液樣本，不提取雛鴿基因組DNA，直接利用引物擴(kuò)增CHD1基因的特異性片段，檢測成本和復(fù)雜性大幅度降低，試驗(yàn)準(zhǔn)確性也能達(dá)到100%，但仍需要核酸膠檢測結(jié)果，易產(chǎn)生樣品污染、假陽性及環(huán)境污染。

本研究在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上，通過探索的裂解液簡便獲取鴿羽髓基因組DNA，利用雙引物對同時(shí)擴(kuò)增鴿性染色體W 上2 個(gè)特異性序列[6]，通過PCR 產(chǎn)物顏色判斷公母，符合快速、準(zhǔn)確及經(jīng)濟(jì)的檢測要求，適合在規(guī)模化鴿生產(chǎn)及繁育上推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)樣品采自于廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院養(yǎng)鴿基地，其中已知性別配對成功的雌雄個(gè)體30 對，28 日齡雛鴿20 只，每羽拔取翅膀或尾部帶有毛囊的新生羽毛1～2 根，同時(shí)通過解剖觀察性腺確定性別；生產(chǎn)驗(yàn)證樣品采自于梅州市金綠鴿業(yè)有限公司，隨機(jī)選擇600 羽18～21 日齡雛鴿（性別未知的健康鴿），每羽拔取翅膀或尾部帶有毛囊的新生羽毛1～2 根，放入含有100 μL裂解液的離心管中，室溫保存，用于鑒別其性別。

1.2 幼雛鴿羽毛基因組DNA 獲取 使用I（堿裂解法）、II（蛋白酶裂解法）和III（基因組試劑盒）3 種方法裂解新生羽毛羽髓，獲得幼雛鴿基因組，I（堿裂解法）為取每羽鴿的1～2 根帶毛囊的新生羽毛，通過EP 管蓋擠出毛囊中羽髓；加入100 μL 裂解液A（組分為0.2 mol/L NaOH、0.5% Triton X-100、1% Tween-20 和0.15 mol/L NaCl），常溫隔夜放置或60℃烘箱30 min，加入400 μL 溶液B（組分為50 mmol/L Tris、0.1% Tween-20和0.05 mol/L HCl），吸取1～2 μL 加入到PCR 反應(yīng)液中，進(jìn)行后續(xù)PCR 擴(kuò)增；方法II（蛋白酶裂解法），是用蛋白酶K（RT403，天根生化科技（北京）有限公司）按說明書使用，37℃消化3 h，99℃加熱15 min 以消除蛋白酶活性，獲得鴿基因組DNA；方法III（基因組試劑盒）是用血液/ 細(xì)胞/ 組織基因組DNA 提取試劑盒（DP304，天根生化科技（北京）有限公司），按說明書步驟抽提基因組。

1.3 DNA 的濃度測定和質(zhì)量檢測 幼雛鴿基因組獲取后，使用NanoDrop One 微量核酸蛋白濃度測定儀測定其濃度，同時(shí)采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 選擇鴿W 染色體上特有的EE0.6與已報(bào)道未命名片段（命名為noval）2 個(gè)序列片段雙引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×mix 10 μL（諾唯贊），上、下游引物0.25 μL（雙引物中每條引物也是0.25 μL，引物濃度為20 μmol/L），模板1 μL，補(bǔ)水到20 μL。PCR 反應(yīng)程序：37℃，2 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃ 保存；直接加染料顯色或者取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 PCR 產(chǎn)物快速檢測方法 探索Goldview、綠如藍(lán)、EB 等核酸染料檢測DNA 的靈敏度，做法為鴿基因組DNA 2 倍的倍比稀釋3 份，稀釋到第6 管，每管10 μL，然后分別加入上述核酸染料。

驗(yàn)證獲取的基因組DNA 對顯色結(jié)果影響，做法為吸取2 μL 所制備的1 根副翼羽新生羽髓、2 根副翼羽新生羽髓、3 根副翼羽新生羽髓及1 根主翼羽新生羽髓基因組DNA，加入到18 μL 反應(yīng)液，而后加入2 μL 核酸染料EB（2000 稀釋）紫外顯色。

驗(yàn)證基因組模板對檢測結(jié)果影響，做法為分別以公母 鴿90、45、9、1.8、0.36、0.072、0.014 ng 基因組量為模板，20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，核酸擴(kuò)增結(jié)束后直接將2 μL 核酸染料EB（10 μg/mL）加入到PCR 產(chǎn)物中，然后在紫外下觀察結(jié)果。

1.7 解剖觀察性腺 未知性別的20 羽28 日齡幼鴿經(jīng)過上述PCR 鑒定后，安樂處死解剖，觀察其有無性腺睪丸確認(rèn)公母，然后將性腺睪丸觀察結(jié)果與PCR 性別鑒定結(jié)果作符合率比較，判定其準(zhǔn)確性。

1.8 鴿場幼雛鴿驗(yàn)證統(tǒng)計(jì) 在種鴿留種試驗(yàn)時(shí)，鴿場隨機(jī)選取600 羽準(zhǔn)備留作種用幼鴿羽毛毛囊，用建立的方法進(jìn)行雛鴿性別的快速鑒定，將雄鴿戴偶數(shù)腳環(huán)，雌鴿戴奇數(shù)腳環(huán)，配對生產(chǎn)后統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿性別鑒定引物特異性驗(yàn)證 選擇鴿W 染色體2 條特異性片段EE0.6 與片段noval，模板量約為50 ng，進(jìn)行常規(guī)PCR，瓊脂糖核酸凝膠結(jié)果（圖1）顯示，單引物noval 母鴿（NF 樣品）擴(kuò)增片段大小為450 bp 左右，公鴿（NM）無條帶；單引物EE0.6 母鴿（EF）大小約360 bp，同樣公鴿（EM）無條帶；混合雙引物noval與EE0.6 母鴿（NEF）有2 條大小與各自單引物大小一致的條帶，公鴿（NEM）無條帶。結(jié)果表明，無論是單引物還是混合引物都能特異性擴(kuò)增出母鴿2 條特異性片段，在實(shí)踐生產(chǎn)檢測中為了避免假陰性，本研究選擇混合雙引物進(jìn)行雛鴿性別鑒定。

圖1 鴿引物特異性PCR 結(jié)果

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 將抽提的公母鴿基因組DNA 倍比稀釋，進(jìn)行雙引物PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖2），20 μL 反應(yīng)體系中能夠檢測到0.36 ng 模板量，母鴿有條帶，公鴿無條帶，特異性好。

圖2 檢測靈敏度結(jié)果

2.3 幼雛鴿羽髓基因組快速獲取 使用I、II 和III 3種方法直接裂解鴿新生羽毛羽髓，獲得幼雛鴿基因組DNA，取5 μL 上樣跑瓊脂糖核酸電泳膠（圖3-A），同時(shí)加1 μL 作為模板，20 μL 體系PCR 擴(kuò)增（圖3-B），結(jié)果顯示I、II 和III 3 種方法均能直接獲得幼雛鴿基因組，其中方法I 為堿裂解法，常溫隔夜或者60℃烘箱放置30 min，獲取的基因組DNA 在核酸膠最上方，基本沒有斷裂，基因組較完整；方法II 為蛋白酶裂解法，需加熱水浴且耗時(shí)長，后期需要高溫失活蛋白酶；方法III 為試劑盒抽提，價(jià)格較貴且耗時(shí)耗力。從簡便、價(jià)格、穩(wěn)定及生產(chǎn)實(shí)際情況等因素考慮，本研究選擇I 方法獲取幼雛鴿基因組DNA。

圖3 幼雛鴿羽髓基因組快速獲取

隨后，檢測I 方法裂解不同羽髓獲得的基因組DNA 量，結(jié)果顯示（表2），羽毛羽髓數(shù)量增加和羽髓大小決定獲得的基因組DNA 量，羽髓數(shù)量越多、羽髓越大，獲取基因組DNA 量越多，結(jié)合本研究PCR 靈敏度及后續(xù)結(jié)果染色，選擇采集1～2 根副翼羽新生羽髓獲取鴿基因組DNA。

表2 不同羽髓數(shù)裂解羽髓量（n=4） ng/μL

2.4 PCR 產(chǎn)物快速檢測 先探索Goldview、綠如藍(lán)、EB 等核酸染料檢測DNA 的靈敏度，結(jié)果顯示（圖4），3 種核酸染料檢測靈敏度Goldview 為68 ng/μL，綠如藍(lán)為68 ng/μL，EB 為34 ng/μL，核酸染料EB 靈敏度高于其他2 個(gè)，從靈敏度、價(jià)格及配套儀器等綜合因素考慮，本研究選擇核酸染料EB 顯色PCR 產(chǎn)物。

圖4 不同核酸染料靈敏度檢測結(jié)果

再驗(yàn)證獲取的基因組DNA 對顯色結(jié)果影響，結(jié)果表明（圖5），1～2 根羽髓獲得的基因組不影響顯色結(jié)果，高于2 根或者使用大的主翼羽或者尾羽對顯示可能有干擾。

圖5 羽髓基因組DNA 對顯色影響

然后直接檢測PCR 產(chǎn)物，驗(yàn)證基因組模板對檢測結(jié)果影響，在紫外下觀察結(jié)果（圖6），公母鴿直接熒光顯色結(jié)果與核酸電泳結(jié)果一致，表明核酸染料EB 能夠直接用于PCR 產(chǎn)物快速檢測。

圖6 PCR 產(chǎn)物快速檢測結(jié)果

2.5 性別未知的乳鴿PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析 使用混合雙引物，對編號為1～18 的18 只未知公母的28 日齡幼鴿進(jìn)行性別鑒定，顯示母鴿 12 只，公鴿6 只（圖7、8），然后分別進(jìn)行解剖，通過觀察性腺加以確認(rèn)，以雄性個(gè)體的性腺1 對白色睪丸（圖9）為判定標(biāo)準(zhǔn)，與核酸染料顯色結(jié)果一致（圖9），與核酸電泳膠鑒定結(jié)果一致（表3），顯示此PCR 方法準(zhǔn)確率100%，同時(shí)簡潔、高效。

圖7 未知公母的28 日齡乳鴿性別鑒定核酸電泳膠結(jié)果

圖8 未知公母的28 日齡乳鴿性別鑒定染色紫外照射結(jié)果

圖9 28 日齡乳鴿解剖睪丸圖示

表3 鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.6 早期性別鑒定方法生產(chǎn)上經(jīng)濟(jì)快速準(zhǔn)確 在金綠鴿業(yè)生產(chǎn)場，利用本試驗(yàn)建立的快速性別鑒定法鑒定了600 羽，母鴿有292 羽，公鴿有308 羽，配對生產(chǎn)后證明其準(zhǔn)確率為99.7% 。

生產(chǎn)上，將性別鑒定方法進(jìn)一步簡化，將100 μL 裂解液A 加入到1.5 mL EP 管，采集1～2 根乳鴿新生羽髓放入管中，室溫放置過夜，然后加入中和液B，吸取1～2 μL加入到PCR 反應(yīng)液，PCR 擴(kuò)增后直接加入2 μL 核酸染料EB 紫外顯色，分辨公母，步驟流程如下（圖10）。

圖10 性別檢測步驟

檢測成本約0.8 元一個(gè)樣品，其中基因組DNA 裂解液約0.02 元，PCR 反應(yīng)液及引物約0.6 元，其他試劑耗材約0.18 元，與已有檢測方法相比[8-9]，成本大大降低。

3 討 論

3.1 幼雛鴿羽髓基因組DNA 獲取 呂夕超等[7]提取鴿基因組DNA，通過PCR 擴(kuò)增鴿CHD1基因的特異性序列，能夠100%準(zhǔn)確鑒定信鴿性別。孫嘉等[8]使用傳統(tǒng)方法提取雞血液、羽毛等基因組DNA，也可準(zhǔn)確快速鑒定雞和雞胚的性別；其他研究者[9-12]使用基因組抽提方法獲取DNA 模板，也能準(zhǔn)確鑒定鳥類性別，但這些研究采用基因組抽提獲得DNA 模板，工作繁瑣且成本高，使其很難在生產(chǎn)上推廣。本研究采用裂解液A 常溫裂解幼雛鴿毛囊，然后加入中和液B，直接吸取1 μL進(jìn)行PCR，常溫裂解保存效果好，利于鴿場采樣到實(shí)驗(yàn)室運(yùn)輸，簡潔快速經(jīng)濟(jì)。

3.2 假陽性假陰性防止 通過鳥類性染色體ZW 上特異性基因片段差異鑒定鳥類性別，準(zhǔn)確高效，已有研究常采用CHD1基因[3,13]與EE0.6 特異性片段[14]鑒定鳥類性別。Hu 等[15]證明采用CHD1基因，跨過其內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，雌性可以擴(kuò)增出2 條帶，雄性只能擴(kuò)增出1 條帶，可以準(zhǔn)確鑒定非平胸鳥類的性別；孫洪霞等[16]證明采用EE0.6 與CHD1 片段特異性引物能夠?qū)κ澾M(jìn)行性別鑒定；孫志明等[4]證明采用CHD1 和EE0.6 特異性引物可準(zhǔn)確對白枕鶴、丹頂鶴進(jìn)行性別鑒定。上述方法均采用常規(guī)PCR 擴(kuò)增，且為單基因單引物PCR 擴(kuò)增，理論上準(zhǔn)確率100%，但會出現(xiàn)假陰性以及氣溶膠污染[17]。本研究采用雙基因混合引物擴(kuò)增，雌鴿2 條帶，雄鴿無條帶，可以降低假陰性，且采用UDG/dUTP 防污染體系，能夠防止氣溶膠等污染，避免假陽性。

3.3 準(zhǔn)確性及結(jié)果顯色 本研究方法在實(shí)驗(yàn)室多次驗(yàn)證準(zhǔn)確性均為100%，而在生產(chǎn)群上檢測600 只乳鴿，準(zhǔn)確性為99.7%，分析原因可能是加樣錯加漏加等導(dǎo)致。常規(guī)PCR 擴(kuò)增結(jié)果，目前是通過瓊脂糖核酸電泳膠法分析，還沒有指示劑直接顯色PCR 結(jié)果的報(bào)道。本研究應(yīng)用常用的雙鏈DNA 染色劑EB 顯色常規(guī)PCR 產(chǎn)物，結(jié)果表明采用本研究探索的鴿基因組DNA 獲取方法，EB 染料能夠應(yīng)用于常規(guī)PCR 產(chǎn)物檢測，解決了常規(guī)PCR 結(jié)果快速簡便讀取難題。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種快速、經(jīng)濟(jì)的鑒定幼雛鴿性別的分子方法，在幼雛鴿基因組DNA 獲取、假陽性假陰性控制及結(jié)果分析等方面具有創(chuàng)新性。所建立的鑒定雛鴿雌雄方法，快速、準(zhǔn)確、簡便，大大縮短了鑒別時(shí)間，降低了鑒定成本，不僅為養(yǎng)鴿場提供科學(xué)的性別鑒定方法，也為基因快速經(jīng)濟(jì)檢測提供一種新途徑。