王鑫晶，王建娜，薩仁高娃，成日青，布仁，李書迪，齊和日瑪

蒙藥點(diǎn)地梅HPLC指紋圖譜研究

王鑫晶1，王建娜1，薩仁高娃2，成日青1，布仁1，李書迪1，齊和日瑪1

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

建立蒙藥點(diǎn)地梅的HPLC指紋圖譜，為其質(zhì)量評價(jià)提供參考。采用高效液相色譜法，COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長360 nm。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對9批點(diǎn)地梅樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，通過液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行定性分析，并結(jié)合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析進(jìn)行整體質(zhì)量評價(jià)。建立了點(diǎn)地梅的指紋圖譜共有模式，9批樣品相似度較好；初步鑒定指認(rèn)了其中8個(gè)共有峰；化學(xué)模式識別可將9批樣品聚為3類。本研究建立的點(diǎn)地梅指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可為點(diǎn)地梅的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

點(diǎn)地梅；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度；化學(xué)模式識別

點(diǎn)地梅為報(bào)春花科點(diǎn)地梅屬北點(diǎn)地梅L.的干燥全草，是蒙醫(yī)常用藥，蒙藥名為“達(dá)蘭-套布其”，具有清熱、解毒、消腫、療傷、祛協(xié)日烏素、滋養(yǎng)強(qiáng)壯功效，主治創(chuàng)傷化膿疼痛、膿毒性關(guān)節(jié)炎、協(xié)日烏素癥、赫依協(xié)日烏素合并癥[1-2]。目前，點(diǎn)地梅質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的研究尚不完整，有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC測定點(diǎn)地梅主要成分槲皮素、山柰素的含量[3-4]，但不能很好地控制其質(zhì)量。本研究采用HPLC建立點(diǎn)地梅的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價(jià)，通過化學(xué)模式識別方法篩選點(diǎn)地梅的主要標(biāo)志性成分，為蒙藥點(diǎn)地梅的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

LC-2130 3D高效液相色譜系統(tǒng)（PDA檢測器，LabSolutions色譜工作站），日本島津公司；UltiMate 3000型快速超高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器、雙三元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器），美國Thermo Fisher公司；四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（包括ESI源、Thermo Xcalibur3.1.66.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），美國Thermo Fisher公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；BSA124S電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；JSP-100型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；ALH-6000-0艾科浦超純水機(jī)，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司。

點(diǎn)地梅樣品S1～S9分別采自內(nèi)蒙古烏蘭察布、蠻漢山-1、蠻漢山-2、蘇木山、呼倫貝爾、阿爾山、小井溝-1、小井溝-2、赤峰，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室渠弼副教授鑒定為報(bào)春花科點(diǎn)地梅屬植物北點(diǎn)地梅L.的干燥全草。蘆丁對照品（批號100080-200707，供含量測定用），中國食品藥品檢定研究院；槲皮素對照品（批號100081-200907，純度＞98.6%），北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；山柰素對照品（批號110861- 200606，供含量測定用），北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；紫云英苷對照品（批號160118，純度＞98%），北京中科儀友化工技術(shù)研究院；乙腈、甲醇（色譜純），F(xiàn)isher Scientific；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～40 min，14%A；40～60 min，14%～60%A），流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長360 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，負(fù)離子模式，離子源噴霧電壓3 500 V，離子源溫度400 ℃，鞘流氣流量45 L/h，輔助氣體為N2，輔助氣體流速2 L/h，輔助器溫度100 ℃，掃描范圍110～1 500 m/z。

2.3 混合對照品溶液制備

分別精密稱取蘆丁、紫云英苷、槲皮素、山柰素對照品適量，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇，搖勻，超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 供試品溶液制備

精密稱取約0.5 g點(diǎn)地梅粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，搖勻，密塞稱重，于恒溫水浴鍋80 ℃回流提取1 h，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取點(diǎn)地梅樣品（S1），按“2.4”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測指紋圖譜，以9號色譜峰為參照，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD分別為1.04%～2.18%和0.30%～2.31%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取點(diǎn)地梅樣品（S1），按“2.4”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，檢測指紋圖譜，以9號色譜峰為參照，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.04%～2.25%和0.14%～3.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取點(diǎn)地梅樣品（S1），按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，檢測指紋圖譜，以9號色譜峰為參照，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.01%～0.34%和0.95%～2.77%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜建立及相似度評價(jià)

分別取9批點(diǎn)地梅樣品（S1～S9），按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。將9批點(diǎn)地梅樣品圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版），進(jìn)行數(shù)據(jù)多點(diǎn)校正及全峰匹配，建立9批樣品的疊加HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜，共確定21個(gè)共有峰，見圖1、圖2。計(jì)算9批樣品指紋圖譜相似度，結(jié)果見表1。9批點(diǎn)地梅樣品指紋圖譜相似度良好。

2.7 指紋圖譜共有峰指認(rèn)

吸取點(diǎn)地梅供試品溶液，注入LC-MS儀，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，對比總離子流圖各色譜峰的保留時(shí)間，結(jié)合各色譜峰的一級、二級質(zhì)譜信息及紫外光譜信息，確定主要色譜峰結(jié)構(gòu)，初步指認(rèn)出不同批次點(diǎn)地梅指紋圖譜中8個(gè)共有峰，分別為山柰酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O鼠李糖苷（5號峰）、槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷（9號峰）、蘆?。?3號峰）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（16號峰）、紫云英苷（18號峰）、異槲皮苷（19號峰）、槲皮素（20號峰）、山柰素（21號峰），并用其中4種成分的對照品進(jìn)行確證，見圖3、表2。

圖1 9批點(diǎn)地梅樣品HPLC疊加圖譜

圖2 點(diǎn)地梅對照指紋圖譜

表1 9批點(diǎn)地梅樣品指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果（r）

批號S1S2S3S4S5S6S7S8S9 S11.000 S20.9391.000 S30.9210.9911.000 S40.9470.7970.7561.000 S50.8990.9910.9960.7241.000 S60.9670.9910.9730.8620.9681.000 S70.8830.9740.9940.6930.9920.9461.000 S80.9350.9850.9830.8000.9790.9810.9721.000 S90.9620.9940.9890.8360.9820.9940.9700.9861.000 對照0.9760.9900.9810.8650.9720.9960.9570.9840.998

注：13.蘆丁；18.紫云英苷；20.槲皮素；21.山柰素

表2 點(diǎn)地梅指紋圖譜部分共有峰質(zhì)譜數(shù)據(jù)

峰號tR/min分子式準(zhǔn)分子離 子[M-H]-二級主要碎片離子誤差 （×10-6）推測成分文獻(xiàn) 5 8.61C39H50O23885.174 38575.814 76，473.160 00，327.110 00，284.200 00， 255.051 70-5.395山柰酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O鼠李糖苷[5] 915.59C33H40O20755.206 97609.145 81，591.135 74，489.104 46，343.048 46， 325.034 33，300.028 26，271.024 60，255.030 535.363槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷[5] 1329.66C27H30O16609.148 32343.046 88，301.035 31，255.031 565.432蘆丁*[5] 1647.29C28H32O16623.164 55315.051 36，300.027 98，271.024 446.241異鼠李素-3-O-蕓香糖苷[5] 1848.71C21H20O11447.094 45227.034 62，284.033 295.060紫云英苷*[6] 1951.84C21H20O12463.090 12301.030 61，152.070 89-6.169異槲皮苷[7] 2054.28C15H10O7301.036 07178.998 03，151.002 915.949槲皮素*[6] 2157.65C16H12O6299.141 91182.987 66，112.986 593.668山柰素*[8]

注：*經(jīng)對照品確證

2.8 化學(xué)模式識別分析

2.8.1 聚類分析

將9批點(diǎn)地梅樣品指紋圖譜21個(gè)共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間連接法，以歐式距離平方作為測量度，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。9批點(diǎn)地梅樣品可分為3類：第1類為S1～S3、S5～S7、S9，第2類為S4，第3類為S8。聚為一類的樣品之間有較好的相似性，與相似度評價(jià)結(jié)果較為一致。

圖4 9批點(diǎn)地梅樣品聚類分析樹狀圖

2.8.2 主成分分析

采用SPSS19.0軟件，以21個(gè)共有峰的相對峰面積為變量，對9批點(diǎn)地梅樣品進(jìn)行主成分分析（PCA）。選取特征值＞1的前5個(gè)成分為主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.610%（見表3），表明這5個(gè)主成分可代表樣品的大部分信息。第1主成分中4、5、12、14號峰有較高的載荷值，第2主成分中3、9號峰有較高的載荷值，第3主成分中11、17號峰有較高的載荷值，第4主成分中10、16、17、18、21號峰有較高的載荷值，第5主成分中6、16號峰有較高的載荷值，表明多個(gè)化學(xué)成分協(xié)同影響點(diǎn)地梅的整體質(zhì)量（見表4）。

2.8.3 正交偏最小二乘-判別分析

將9批點(diǎn)地梅樣品共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，進(jìn)行正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），得分圖見圖5。9批樣品可聚類為3類，與聚類分析和PCA結(jié)果一致。提取OPLS-DA模型中21個(gè)變量的變量重要性投影（VIP）值并從大到小排序，結(jié)果見圖6。以VIP＞1作為引起點(diǎn)地梅批次間差異的主要標(biāo)志性成分，色譜峰（VIP值）分別為20號峰（1.239 6）、9號峰（1.231 4）、3號峰（1.171 2）、11號峰（1.133 3）、13號峰（1.108 4）、21號峰（1.103 3）、19號峰（1.082 3）、14號峰（1.037 3）、5號峰（1.019 5）、12號峰（1.019 4）、4號峰（1.019 1）、17號峰（1.014 5）、8號峰（1.007 2），對其聚類有顯著影響。

表3 點(diǎn)地梅樣品指紋圖譜主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率

主成分特征值方差貢獻(xiàn)率/%累計(jì)方差貢獻(xiàn)率/% 19.97747.50947.509 26.21629.60177.110 31.824 8.68485.794 41.327 6.31792.111 51.155 5.49997.610

表4 點(diǎn)地梅樣品指紋圖譜色譜峰主成分因子載荷矩陣

峰號主成分1主成分2主成分3主成分4主成分5 10.082-0.0110.1240.178-0.360 20.091-0.0290.1530.116-0.179 30.0210.1420.1830.017-0.138 40.097-0.029-0.069-0.0700.069 50.096-0.0340.006-0.0740.083 60.0780.040-0.038-0.2780.350 70.093-0.0160.053-0.2010.054 80.084-0.0650.144-0.008-0.123 90.0340.1460.078-0.084-0.034 100.0300.063-0.4300.2300.112 110.0220.1380.2390.0490.138 120.097-0.026-0.013-0.0150.114 130.0400.127-0.188-0.065-0.247 140.095-0.0460.041-0.0460.016 150.0720.059-0.279-0.104-0.198 160.068-0.0150.0510.2080.574 17-0.0080.1250.2300.3320.091 180.0620.043-0.1620.504-0.025 190.071-0.0990.0230.161-0.161 200.014-0.1520.0330.033-0.103 21-0.054-0.118-0.0060.2560.111

圖5 9批點(diǎn)地梅樣品OPLS-DA得分圖

圖6 9批點(diǎn)地梅樣品OPLS-DA差異標(biāo)志物VIP圖（）

3 討論

本試驗(yàn)制備供試品溶液時(shí)，比較了水、50%甲醇、70%甲醇及甲醇的提取效果，結(jié)果70%甲醇提取的色譜峰數(shù)目多、響應(yīng)值大；比較超聲和回流2種提取方式，結(jié)果回流提取效率較高；比較加熱回流時(shí)間對提取率的影響，結(jié)果加熱回流1 h以上提取率無明顯差異。故選擇70%甲醇回流提取1 h制備供試品溶液。

在色譜條件選擇上，本試驗(yàn)比較了乙腈-水、甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)對色譜峰的影響，結(jié)果用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫時(shí)色譜圖分離效果較好，峰數(shù)目較多；比較乙腈與不同濃度磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)對色譜峰的影響，結(jié)果乙腈-0.5%磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)效果最佳。在檢測波長的選擇上，本試驗(yàn)利用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行分析，觀察全譜的分離與吸收情況，結(jié)果波長為360 nm時(shí)出峰數(shù)量多，基線較平穩(wěn)，信號響應(yīng)值大，故選擇360 nm作為檢測波長。

本試驗(yàn)建立了蒙藥點(diǎn)地梅的指紋圖譜，確定了21個(gè)共有峰，并對9批樣品指紋圖譜的相似度進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示與對照指紋圖譜有良好的相似性。根據(jù)色譜峰的分離情況，9號峰槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷分離度較好，峰面積相對較大，位置居中，故選擇該峰為參照峰。同時(shí)，采用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對點(diǎn)地梅指紋圖譜中主要色譜峰進(jìn)行定性分析，通過質(zhì)譜庫及文獻(xiàn)檢索，初步指認(rèn)了8個(gè)特征峰，并采用對照品隨行對照確證了其中4個(gè)化學(xué)成分。

聚類分析、PCA和OPLS-DA結(jié)合HPLC指紋圖譜能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地、批次中藥進(jìn)行聚類鑒別和成分判別分析。本研究通過化學(xué)模式識別分析，建立了點(diǎn)地梅聚類分析、PCA和OPLS-DA分類模型，3種方法分析結(jié)果基本一致，均將9批樣品歸為3類；PCA以載荷值結(jié)果篩選得到15個(gè)差異性成分，OPLS-DA以共有峰VIP＞1篩選得到13個(gè)主要差異性物質(zhì)，點(diǎn)地梅樣品間的差異性主要體現(xiàn)在3、4、5、9、11、12、14、17、21號峰，其中，5號峰為山柰酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O鼠李糖苷、9號峰為槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷、21號峰為山柰素。本研究建立的HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識別分析結(jié)果可為點(diǎn)地梅的質(zhì)量控制和評價(jià)提供一定參考。

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Study on HPLC Fingerprints of Mongolian Medicine Androsacis Herba

WANG Xinjing1, WANG Jianna1, Sarengaowa2, CHENG Riqing1, Buren1, LI Shudi1, Qiherima1

To establish the HPLC fingerprints of Mongolian medicine Androsacis Herba; To provide references for its quality control.The HPLC analysis was carried on a COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm); the mobile phase was acetonitrile (A)-0.5% phosphoric acid aqueous solution (B) with gradient elution at the flow rate of 0.8 mL/min; the temperature was 35 ℃; the detection wavelength was 360 nm. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (2012 edition) was used to evaluate the fingerprints similarity of 9 batches of samples. Qualitative analysis was carried out by LC-MS technology. The overall quality evaluation of Androsacis Herba was carried out by combining cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least square discrimination.The common mode of HPLC fingerprints of Androsacis Herba was established, and the similarity of 9 samples was good; 8 compound peaks were determined preliminary; 9 batches of samples were aggregated into 3 categories by chemical pattern recognition.The fingerprints of Mongolian medicine Androsacis Herba established in this study combines chemical pattern recognition method, which has high sensitivity and strong specificity, and can provide a basis for the quality evaluation of Mongolian medicine Androsacis Herba.

Androsacis Herba; HPLC; fingerprints; similarity; chemical pattern recognition

R284.1

A

1005-5304(2021)08-0098-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202011428

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金（2020MS08129）

齊和日瑪，E-mail：qiherima@126.com

（收稿日期：2020-11-23）

（修回日期：2020-12-21；編輯：陳靜）