汪雪雁，談 勇，張 芳，陳 豪，賀亞南，李行舟，趙寶全*

基因敲除斑馬魚(yú)的模型建立及其鋁暴露神經(jīng)毒性相關(guān)研究

汪雪雁1，談 勇1，張 芳1，陳 豪1，賀亞南1，李行舟2，趙寶全2*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，合肥 230036；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850)

利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚(yú)基因，研究基因在鋁致斑馬魚(yú)癡呆中的作用。針對(duì)斑馬魚(yú)基因設(shè)計(jì)并制備gRNA，通過(guò)顯微注射技術(shù)將gRNA與Cas9-mRNA混合注入斑馬魚(yú)單細(xì)胞胚胎中，利用酶切和基因測(cè)序篩選出發(fā)生突變的F0代斑馬魚(yú)，與野生型斑馬魚(yú)雜交得到F1代斑馬魚(yú)雜合子，分析其突變類(lèi)型，將突變類(lèi)型一致的斑馬魚(yú)雜合子雜交，獲得F2代。在酸性AlCl3中暴露F2代斑馬魚(yú)胚胎，暴露組的斑馬魚(yú)個(gè)體行為出現(xiàn)異常，移動(dòng)距離、移動(dòng)速度和移動(dòng)頻率皆顯著下降（< 0.01），體內(nèi)活性氧（ROS）水平顯著升高（< 0.01）；其中KO + AlCl3組導(dǎo)致的異常更為明顯，和mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)（< 0.01）。在鋁致斑馬魚(yú)癡呆中起到重要作用，可能是其關(guān)鍵的治療預(yù)防靶點(diǎn)。

CRISPR/Cas9；斑馬魚(yú)；基因；阿爾茨海默??；鋁

鋁是自然界含量豐富的金屬元素之一，一般認(rèn)為機(jī)體吸收少，且無(wú)生理功能，卻具有神經(jīng)毒性, 可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)體系從血液入腦，導(dǎo)致鋁在腦內(nèi)慢性蓄積，造成神經(jīng)毒性，其中，鋁所致的AD樣改變是研究最多的神經(jīng)疾病。阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以學(xué)習(xí)記憶障礙為特征的一種年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其病理特征為腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑（Senile plaques，SP）、神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFTs）和神經(jīng)元數(shù)量減少等[1]，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。解偶聯(lián)蛋白2（Uncoupling protein 2，ucp2）是1997年Fleury首次發(fā)現(xiàn)并克隆的又一個(gè)UCPs家族成員，與UCP1、UCP3同源性高度相似，只在線粒體亞細(xì)胞中表達(dá)，在人體骨骼肌、棕色脂肪組織、免疫系統(tǒng)和腦等組織部位分布[2]。在各種能量代謝、ROS生成、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起到重要作用，與局部腦缺血、非酒精性脂肪肝病、動(dòng)脈粥樣硬化癥、Ⅱ-型糖尿病以及神經(jīng)退行性疾病等都有著密切關(guān)系[3-6]。CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspersed short palindromic repeats）系統(tǒng)是一種細(xì)菌和古細(xì)菌用于對(duì)抗病毒和外源遺傳物質(zhì)的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，在設(shè)計(jì)、效率、成本等方面優(yōu)勢(shì)明顯[7]。本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除的斑馬魚(yú)模型，并利用該敲除模型初步研究在鋁長(zhǎng)期暴露所致AD中的作用，以期為阿爾茨海默病的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)于北京賽音圖科技有限公司；PCRMix購(gòu)于TaKaRa公司；Ⅰ和AⅠ核酸內(nèi)切酶均購(gòu)于NEB公司；MEGAscriptTMT7和mMESSAGE mMACHINETMSP6試劑盒均購(gòu)于Thermo Fisher公司；顯微注射儀和體式顯微鏡均購(gòu)自日本尼康；PN-30拉針儀購(gòu)于日本成茂；PCR儀購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD；pT7-gRNA質(zhì)粒、pCS2-ncas9n質(zhì)粒購(gòu)于Addgene公司；AB品系斑馬魚(yú)由北京大學(xué)生命科學(xué)院提供，利用本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行馴養(yǎng)繁殖。

1.2 方法

1.2.1基因敲除靶點(diǎn)的設(shè)計(jì) 通過(guò)Esembl網(wǎng)站查詢(xún)斑馬魚(yú)的基因組DNA外顯子序列及其功能區(qū)。根據(jù)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的斑馬魚(yú)基因組突變靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，對(duì)基因進(jìn)行靶點(diǎn)設(shè)計(jì)。靶點(diǎn)要求：結(jié)構(gòu)須滿(mǎn)足5'-GG-N18-NGG-3'。其中5'端的GG是T7啟動(dòng)子的一部分，是為了增加轉(zhuǎn)錄效率，設(shè)計(jì)基因敲除靶點(diǎn)時(shí)可以不考慮該因素，但3'端須滿(mǎn)足PAM（即NGG）結(jié)構(gòu)，N為任意堿基。

1.2.2 gRNA和Cas9-mRNA的制備 根據(jù)設(shè)計(jì)靶點(diǎn)序列合成兩個(gè)oligo，上游：5'-TAGGGCCACGC AGTCTCTACAG-3'，下游：5'-AAACCTGTAGAG ACTGCGTGGC-3'。退火程序：95 ℃，5 min；以0.1 ℃·s-1的速度降到50 ℃；50 ℃，10 min；以1 ℃·s-1的速度冷卻至4 ℃，反應(yīng)結(jié)束后放置–20 ℃保存?zhèn)溆?。接著用B I核酸內(nèi)切酶對(duì)pT7-gRNA質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，反應(yīng)體系：1 μg的pT7-gRNA質(zhì)粒，1 μL的Buffer 3.1，1 μL的B I核酸內(nèi)切酶，加ddH2O 至50 μL。在55 ℃水浴鍋中溫育4 h，最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收。將退火合成的DNA片段與酶切回收的pT7-gRNA載體于4 ℃過(guò)夜連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆。分別用H I核酸內(nèi)切酶和I核酸內(nèi)切酶對(duì)pT7--gRNA質(zhì)粒和pCS2-ncas9n質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切體系：質(zhì)粒1 μg，核酸內(nèi)切酶1 μL，CutSmart Buffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL，37 ℃水浴4 h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收。利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)線性化的pT7--gRNA質(zhì)粒和pCS2-ncas9n質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并對(duì)轉(zhuǎn)錄后的RNA采用氯化鋰沉淀法進(jìn)行純化。最后進(jìn)行濃度檢測(cè)，分別稀釋至100和600 ng·μL-1，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 顯微注射 通過(guò)顯微注射將2 nL的Cas9- mRNA（50 ng·μL-1）和gRNA（300 ng·μL-1）混合液注射到斑馬魚(yú)受精卵單細(xì)胞中。迅速收集注射后的受精卵于E3培養(yǎng)液中，盡量除去破裂的胚胎和雜物，放置28 ℃生化培養(yǎng)箱中孵化。期間，可以通過(guò)體式顯微鏡觀察胚胎表型是否發(fā)生變化，并且篩選正常發(fā)育的斑馬魚(yú)胚胎來(lái)驗(yàn)證靶位點(diǎn)有效性。

1.2.4 體內(nèi)活性檢測(cè) 隨機(jī)挑選5個(gè)（受精后48 h）注射組和野生型斑馬魚(yú)胚胎于PCR離心管中，進(jìn)行基因組DNA的提取，具體步驟如下：將胚胎去膜后放入 PCR管中；加入50 μL的50 mmol·L-1NaOH溶液（每個(gè)胚胎10 μL）；95 ℃ 10 min，4 ℃保存；振蕩混勻后加入1/10體積1 mol·L-1Tris（pH 8.0）中和NaOH，充分振蕩混勻。PCR擴(kuò)增目的序列引物設(shè)計(jì)如下：上游：5'-CGGGATAACCTGAAG ATGCA-3'，下游：5'-GCTGACCTGAGCCTGAAA CC-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：2×PCRMix 25 μL，引物各取1.5 μL，基因組DNA 2 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并對(duì)其純化回收。利用A I核酸內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL，A I核酸內(nèi)切酶1 μL，CutSmart Buffer 5 μL，ddH2O 19 μL，55 ℃水浴4 h，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察是否出現(xiàn)多條帶，分析靶點(diǎn)的有效性。把剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.2.5 斑馬魚(yú)突變體的篩選 將注射后檢測(cè)有突變的斑馬魚(yú)養(yǎng)至2～3個(gè)月進(jìn)行F0代突變體篩選。具體流程為：剪取每條斑馬魚(yú)魚(yú)尾2～3 mm，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的序列，A I酶切快速篩選，將出現(xiàn)多條帶的F0代斑馬魚(yú)單獨(dú)培養(yǎng)。將A I酶切檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期條帶大小符合的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰圖進(jìn)一步驗(yàn)證斑馬魚(yú)是否發(fā)生突變，篩選出突變率高的F0代斑馬魚(yú)。接著將F0代斑馬魚(yú)突變體與野生斑馬魚(yú)交配篩選出F1斑馬魚(yú)雜合子，然后通過(guò)單克隆測(cè)序分析F0和F1代斑馬魚(yú)的突變類(lèi)型，將F1代敲除類(lèi)型一致的斑馬魚(yú)雌雄個(gè)體雜交獲得F2代純合子。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

1.2.6敲除對(duì)鋁致斑馬魚(yú)AD的影響 （1）斑馬魚(yú)幼魚(yú)AlCl3暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組，正常對(duì)照組是將野生斑馬魚(yú)幼魚(yú)于E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，氯化鋁暴露組（AlCl3）是將野生斑馬魚(yú)幼魚(yú)于AlCl3溶液中培養(yǎng)，敲除組（KO）是F2代斑馬魚(yú)胚胎于E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，KO+AlCl3是F2代斑馬魚(yú)胚胎于AlCl3溶液中培養(yǎng)。AlCl3的濃度為150 μg·L-1，pH 5.8[8]，斑馬魚(yú)挑選為受精后3日齡且表型正常的胚胎，于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿分別放入50枚和相應(yīng)溶液10 mL，置于生化恒溫培養(yǎng)箱（28 ℃）中培養(yǎng)96 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（2）斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為測(cè)定。AlCl3暴露后，每組隨機(jī)選取8條斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于96 孔板（斑馬魚(yú)行為學(xué)檢驗(yàn)專(zhuān)用平板）中，每孔1條。將96孔板放入Noldus視頻采集系統(tǒng)觀測(cè)平臺(tái)上，采用EthoVision XT10.0 軟件追蹤采集3 min內(nèi)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的自發(fā)運(yùn)動(dòng)路線圖，并計(jì)算各組斑馬魚(yú)的移動(dòng)距離、移動(dòng)速度和移動(dòng)頻率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（3）斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)ROS的檢測(cè)[9]。每組取10條幼魚(yú)放入1.5 mL離心管中，用預(yù)冷的PBS（pH值7.4）洗滌2次，然后在預(yù)冷的緩沖液（0.32 mmol·L-1蔗糖，20 mmol·L-1HEPES，1 mmol·L-1MgCl2和0.5 mmol·L-1PMSF，pH值為7.4）中研磨均勻。12 000 r·min-1，4 ℃離心20 min，把上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中待用。然后，分別取20 μL的上清液于96孔板中，室溫放置5 min，接著每孔加入100 μL PBS（pH 7.4）和8.3 μL DCFH-DA原液（DMSO溶解，10 mg·mL-1），37 ℃溫育30 min。最后，用多功能酶標(biāo)儀（激發(fā)光485 nm，發(fā)射光530 nm）測(cè)定ROS濃度，單位為DCF·mg-1(protein）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（4）RT-qPCR檢測(cè)。每組各取20條斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄，具體步驟同上。RT-qPCR反應(yīng)體系：SYBR PremixTM，10 μL；上下游引物各0.6 μL；cDNA，2 μL；ddH2O，6.8 μL。反應(yīng)條件95 ℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s。反應(yīng)結(jié)束后，同樣利用LightCycler? 96自帶的軟件進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以`x±s表示。主要利用GraphPad軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平為0.05，< 0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cas9-mRNA與gRNA的獲得

成功獲得Cas9-mRNA和gRNA，大小約2 000和100 bp（圖1），純化后保存。條帶大小與預(yù)期完全符合。

M: DNA Marker; 1 and 2: Cas9-mRNA; 3: gRNA。

Figure 1 The electrophoretogram of Cas9-mRNA and gRNA

2.2 斑馬魚(yú)ucp2基因敲除后代突變體篩選與鑒定

如圖2所示，1—8號(hào)斑馬魚(yú)目的片段A I酶切后在500、300和200 bp左右出現(xiàn)了3條帶，表明了這些斑馬魚(yú)發(fā)生基因突變，為所需突變體；而9號(hào)斑馬魚(yú)只在300和200 bp左右出現(xiàn)條帶，說(shuō)明它能被A I酶完全酶切，沒(méi)有發(fā)生突變，舍去不用。如圖3所示，F(xiàn)1代斑馬魚(yú)具有多種突變類(lèi)型，出現(xiàn)缺失2、3和12個(gè)堿基以及插入3個(gè)堿基等情況，隨著F1代與野生型AB魚(yú)不斷雜交至突變類(lèi)型穩(wěn)定，我們篩選到穩(wěn)定缺失1及2個(gè)堿基的突變類(lèi)型，并將缺失類(lèi)型一致的F1代斑馬魚(yú)分別進(jìn)行自交，得到缺失1個(gè)及2個(gè)的F2代突變體，具體見(jiàn)圖4。選擇缺失1 bp的F2代斑馬魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，缺失1 bp的F2代純合斑馬魚(yú)測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖5。

M: DNA Marker; 1—9: F1 generation zebrafish; C: Wild type zebrafish。

Figure 2 The results of F1generation zebrafish digested byA I

2.3 基因敲除斑馬魚(yú)幼魚(yú)及鋁暴露幼魚(yú)的行為學(xué)評(píng)價(jià)

觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡圖，可知正常斑馬魚(yú)幼魚(yú)的游動(dòng)規(guī)律是沿著四周壁慢慢活動(dòng)，偶爾從中間穿過(guò)，活動(dòng)距離較長(zhǎng)；敲除組（KO）和AlCl3暴露組的斑馬魚(yú)游動(dòng)沒(méi)有規(guī)律，只是在中心位置來(lái)回游動(dòng)，活動(dòng)距離與正常斑馬魚(yú)幼魚(yú)相比明顯縮短；KO+AlCl3組斑馬魚(yú)游動(dòng)更加緩慢，只在某一區(qū)域活動(dòng)，沒(méi)有探索意向（圖6A，=10，排除個(gè)體差異）。與正常組相比，其他組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)的移動(dòng)距離、移動(dòng)速度和頻率皆出現(xiàn)明顯下降（< 0.01）。與KO+AlCl3組相比，敲除組和AlCl3暴露組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)移動(dòng)距離和移動(dòng)速度則出現(xiàn)明顯的增加（< 0.05），但頻率沒(méi)有明顯的變化（圖6B、C和D）。結(jié)果表明基因在鋁致AD中起到了重要作用，的敲除加重鋁致AD的行為異常。

注：下劃線標(biāo)記表示ucp2基因靶點(diǎn)序列，虛線表示缺失位置，對(duì)于每條突變序列后面的標(biāo)記表達(dá)意思為：“-”表示堿基缺失，“+”表示堿基插入，中括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)則是突變單克隆的數(shù)量，WT表示野生斑馬魚(yú)。

Figure 3 The genetic maps of mutated F1generation zebrafish

圖4 穩(wěn)定遺傳的F1代突變斑馬魚(yú)測(cè)序結(jié)果

Figure 4 The sequencing results of stability mutated F1generation zebrafish

圖5 F2代突變斑馬魚(yú)序列測(cè)序結(jié)果

Figure 5 The sequencing result of F2generation zebrafish

A. 斑馬魚(yú)游動(dòng)的軌跡圖；B. 斑馬魚(yú)移動(dòng)距離分析結(jié)果；C. 斑馬魚(yú)移動(dòng)速度分析結(jié)果；D. 斑馬魚(yú)頻率分析結(jié)果。**P < 0.01，與空白對(duì)照組相比；# P < 0.05，## P < 0.01，與KO+AlCl3組相比（n = 24）。

Figure 6 The locomotor activity of gene knockout zebrafish larvae and the exposed to AlCl3

2.4 ucp2敲除促進(jìn)斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS的生成

活性氧簇（ROS）是需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的，濃度過(guò)高會(huì)造成細(xì)胞的凋亡甚至壞死。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，敲除組、AlCl3暴露組和KO+AlCl3組的斑馬魚(yú)的ROS水平顯著增加（< 0.01）；與KO+AlCl3組的斑馬魚(yú)相比，AlCl3暴露組和敲除組的ROS明顯下降（< 0.05）（圖7）。表明敲除會(huì)增加斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，聯(lián)合鋁暴露則會(huì)導(dǎo)致更多ROS的生成。

** P < 0.01，與空白對(duì)照組相比；#P < 0.05，與KO+AlCl3組相比（n =10）。

Figure 7 The ROS level in zebrafish larvae

*P < 0.05，**P < 0.01，與空白對(duì)照組相比（n = 20）。

Figure 8 The expressions of genes related to nerves inknockout zebrafish exposed to AlCl3by RT-qPCR assay

2.5 ucp2敲除聯(lián)合鋁暴露增加神經(jīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)

與空白對(duì)照組相比，未暴露AlCl3的敲除組的各基因表達(dá)變化不明顯。AlCl3暴露組中，斑馬魚(yú)的和mRNA轉(zhuǎn)錄水平皆出現(xiàn)上調(diào)，其中的基因表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。而KO+AlCl3組中，和mRNA 轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)極顯著上調(diào)（< 0.01），和mRNA 轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯上調(diào)（< 0.05）（圖8）。表明敲除聯(lián)合鋁暴露可以增加和的基因表達(dá)。

3 討論

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建基因敲出的斑馬魚(yú)模型，并利用該模型初步研究在鋁致斑馬魚(yú)癡呆中的作用。首先通過(guò)相關(guān)網(wǎng)站設(shè)計(jì)一個(gè)合理的敲除靶點(diǎn)，確保能夠影響其基因功能。然后，構(gòu)建pT-ucp2-gRNA質(zhì)粒以獲得特異性gRNA，將特異性gRNA和Cas9-mRNA混合液顯微注射至斑馬魚(yú)單細(xì)胞的受精卵中，體內(nèi)活性檢測(cè)驗(yàn)證了所設(shè)靶點(diǎn)的有效性。并且利用A I酶切驗(yàn)證、測(cè)序分析以及TA克隆成功篩選出缺失一個(gè)堿基的F2代純合突變體，造成移碼突變，影響基因功能的表達(dá)。此外，本研究還利用酸性氯化鋁對(duì)敲除的F2代斑馬魚(yú)進(jìn)行暴露處理，發(fā)現(xiàn)敲除組和AlCl3暴露組的斑馬魚(yú)皆出現(xiàn)行為異常，行為學(xué)顯示該組斑馬魚(yú)只在某一區(qū)域活動(dòng)，沒(méi)有探索意向，多次重復(fù)結(jié)果一致，生化水平檢測(cè)顯示體內(nèi)ROS水平明顯增加，KO+AlCl3組表現(xiàn)更為嚴(yán)重，表明敲除聯(lián)合鋁暴露會(huì)增加體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，加快認(rèn)知功能的衰退。已有文獻(xiàn)報(bào)道敲除往往會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，干擾神經(jīng)細(xì)胞的增殖，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)元損傷[10]。同時(shí)的大量表達(dá)可以降低線粒體膜電位以及抑制ROS生成，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，推測(cè)可能是治療衰老相關(guān)疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[11]。另外，敲除會(huì)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體ROS的產(chǎn)生，從而激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致產(chǎn)生，抑制神經(jīng)再生，加重星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]?？梢酝ㄟ^(guò)抑制ROS的生成來(lái)保護(hù)Aβ暴露處理的原代神經(jīng)元[13]。而RT-qPCR結(jié)果也顯示的敲除會(huì)導(dǎo)致和基因表達(dá)顯著上調(diào)。其中和的基因表達(dá)增加，往往會(huì)促進(jìn)Aβ的形成，進(jìn)而導(dǎo)致AD的發(fā)生[14]；和是炎癥細(xì)胞因子，它們表達(dá)上調(diào)會(huì)加快神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，引起神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[15]。可能是治療預(yù)防阿爾茨海默病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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Effects of knockout ofgene on zebrafish dementia model induced by aluminum

WANG Xueyan1, TAN Yong1, ZHANG Fang1, CHEN Hao1, HE Yanan1, LI Xingzhou2, ZHAO Baoquan2

(1. School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. China Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850)

In order to explore the role ofgene in aluminum-induced zebrafish dementia, we establishedgene knockout zebrafish model on wild type zebrafish using CRISPR/cas9 system. We selected the-targeting region by bioinformatics analysis, constructed and transcribed gRNA plasmid, and con-injected mixed gRNA and Cas9 mRNA into single-cell stage fertilized embryo. We screened out the mutant F0generation zebrafish by enzyme digestion and Sanger sequencing, chose mutant successfully F0outcrossed with the wild-type zebrafish to get the F1generation zebrafish, and used the same methods to get F2generation zebrafish. The larvae of F2zebrafish were exposed in acidic AlCl3. Compared with the control group, the individual behavior of the zebrafish exposed to AlCl3were abnormal, the distance, speed and frequency of swim for zebrafish significantly decreased (< 0.01), while the ROS level was significantly increased (< 0.01), and the mRNA transcription levels of,,andwere up-regulated significantly (< 0.01). In conclusion, we successfully establishedgene knockout zebrafish model, which could speed up the process of AD (Alzheimer’s disease).

CRISPR/Cas9; zebrafish;; Alzheimer’s disease; aluminum

S917

A

1672-352X (2021)03-0397-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.018

2021-7-7 11:44:13

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1649.036.html

2020-07-08

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2018ZX09J18102-001-003）資助。

汪雪雁，副教授。E-mail：wxy700303@ahau.edu.cn

趙寶全，副研究員。E-mail：baoquanzhao@126.com