王 錦 陳晉瑩 陳 帥 李 理

(中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司 610091)

糧食是國(guó)家的戰(zhàn)略物資，是人民的生活必需品，是保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定和發(fā)展的基礎(chǔ)。我國(guó)不僅是世界糧食生產(chǎn)、消費(fèi)大國(guó)，也是糧食儲(chǔ)運(yùn)量最多的國(guó)家之一，糧食的安全生產(chǎn)和儲(chǔ)藏，關(guān)系國(guó)計(jì)民生，是糧食工作的重中之重。糧食因其含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪及無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，常成為微生物生長(zhǎng)的天然培養(yǎng)基。世界上各地所產(chǎn)的糧食、糧食加工產(chǎn)品以及飼料上都有大量的微生物存在，包括病毒、細(xì)菌、放線菌、真菌等[1]。在合適的溫度和濕度條件下，這些微生物的生命活動(dòng)將對(duì)儲(chǔ)藏糧食的品質(zhì)產(chǎn)生影響，出現(xiàn)變色、發(fā)霉、發(fā)熱等癥狀。特別是微生物中的霉菌，具有生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可直接或間接的利用糧食中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分泌產(chǎn)生多種生物酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，將糧食中的營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為自身生長(zhǎng)繁殖所需的小分子營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)行代謝活動(dòng)，使糧食品質(zhì)發(fā)生劣變，嚴(yán)重影響糧食的價(jià)值[2]。有些霉菌，如黃曲霉菌(Aspergillisflavus)、青霉菌(Penicillium)、鐮刀菌(Fusarium)等還能在糧食中產(chǎn)生多種真菌毒素。被真菌毒素污染的糧食及其制品通過食物鏈對(duì)人類和動(dòng)物的健康產(chǎn)生危害，給食品工業(yè)、飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的危害[3，4]。因此儲(chǔ)糧微生物的快速鑒定是進(jìn)行儲(chǔ)糧微生物綜合防治的前提和基礎(chǔ)。

微生物具有個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、用肉眼難以分辨的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的微生物分類和鑒定方法主要是以微生物的形態(tài)學(xué)和生理生化等特征為依據(jù)。雖然這類方法仍被廣泛使用，并能為儲(chǔ)糧的安全性提供一定的指示，但是其只適用于可以體外培養(yǎng)的生物體，且存在檢測(cè)操作技術(shù)專業(yè)性強(qiáng)，要求高，操作程序繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)精度低等問題，難以滿足對(duì)儲(chǔ)糧微生物快速、準(zhǔn)確鑒定的需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展，許多不依賴于活的培養(yǎng)物的現(xiàn)代方法逐漸被應(yīng)用到微生物的分析與鑒定中，滿足了不同儲(chǔ)糧微生物和檢測(cè)條件的需求[5]。本文中，主要針對(duì)儲(chǔ)糧微生物檢測(cè)和鑒定的現(xiàn)代分析技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述。

1 生化分析方法用于微生物鑒定

在微生物學(xué)中，傳統(tǒng)的生化鑒定方法主要依靠微生物培養(yǎng)過程中利用物質(zhì)的能力，代謝產(chǎn)物的特殊性，與溫度和氧氣的關(guān)系等特征進(jìn)行鑒定。這類方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力(培養(yǎng)基制備、稀釋、平板培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、分離和表征)，結(jié)果至少3 d后(霉菌7 d)才能觀察到，特別是在鑒定表型相似的微生物物種時(shí)，經(jīng)常會(huì)獲得假陽性結(jié)果[6，7]。同時(shí)，這類方法還無法識(shí)別不可培養(yǎng)的細(xì)胞。隨著生物化學(xué)知識(shí)的不斷發(fā)展以及功能強(qiáng)大的儀器出現(xiàn)，傳統(tǒng)生化方法的使用開始減少，并且開發(fā)出了更多的現(xiàn)代生物化學(xué)方法，與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法相比，具有許多優(yōu)勢(shì)，如分析時(shí)間縮短并能夠測(cè)定多種微生物，同時(shí)還能很好地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[7-9]。

1.1 基于質(zhì)譜的方法

質(zhì)譜法(Mass Spectrometry，MS)是通過分析電離分子質(zhì)荷比(m/z)，從而對(duì)樣品分子組成進(jìn)行定性定量分析的一種方法，實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)離子產(chǎn)生的質(zhì)量圖譜對(duì)樣品分子組成進(jìn)行確定。1975年，Anhalt等首次將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌鑒定領(lǐng)域[11]，1996年Claydon等成功鑒定了革蘭氏陰性菌和陽性菌[12]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，以及新的數(shù)據(jù)分析、處理和可視化工具的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用越來越廣泛[10，12-16]。

1.1.1 液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS) 液相色譜(Liquid Chromatography，LC)與質(zhì)譜的結(jié)合，徹底改變了代謝物組的分析測(cè)定方法，從而實(shí)現(xiàn)了通過分析一些不揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的高分子化合物進(jìn)行微生物的鑒定[17，18]。LC-MS主要用于臨床應(yīng)用中的微生物鑒定[19]，它也可用于檢測(cè)飼料中枯草芽孢桿菌和大腸桿菌，并確定釀酒酵母的完整代謝物組覆蓋率[20]。在LC-MS中，使用進(jìn)樣器將樣品注入溶劑流，并在固定相化學(xué)鍵合的色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離，柱中的洗脫液穿過光譜儀中的流通池，以無損識(shí)別具有光譜結(jié)構(gòu)的化合物(發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán))。

隨著質(zhì)譜分析儀和電離技術(shù)在LC-MS技術(shù)方面取得了進(jìn)步，新的平臺(tái)也逐步發(fā)展起來，包括快速LC-MS、LC-MALDI-MS、LC-ESI-MS-MS、LC-NMR-MS、親水相互作用液相色譜(HILIC)-MS，反相LC-MS和離子遷移譜，變性高效液相色譜法(DHPLC)等[21-26]。其中DHPLC是一種新的有發(fā)展前途的方法，特別是在微生物鑒定和監(jiān)測(cè)方面[27，28]。

1.1.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS) 氣相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用已廣泛應(yīng)用于鑒定復(fù)雜的生物混合物[29-31]。GC系統(tǒng)包括一個(gè)氣源、一個(gè)進(jìn)樣器和一個(gè)位于柱箱內(nèi)的柱，具有良好的分離效率，可與質(zhì)譜儀相連。MS可以提供區(qū)分化學(xué)中不同代謝物的質(zhì)譜圖，兩者的聯(lián)合使用可以使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。此外，GC-MS還具有高靈敏性、易用性、低成本、豐富的線性范圍以及商業(yè)和公共數(shù)據(jù)庫的可訪問性[32-34]。該方法通常用于非極性分子分析(例如，脂質(zhì)成分)[35]，并通過評(píng)估其脂質(zhì)元素對(duì)微生物進(jìn)行分類。

GC-MS的主要缺點(diǎn)在于——該過程要求分析物為揮發(fā)性形式，由于某些代謝物是非揮發(fā)性的，因此需要耗時(shí)的衍生步驟[36-38]。為了優(yōu)化該技術(shù)的性能，可以將某些技術(shù)與GC-MS結(jié)合使用，例如GC-GC飛行時(shí)間(TOF)-MS[39，40]。在這種情況下，將兩個(gè)不同的GC柱結(jié)合在一起，從而增加了代謝物的檢測(cè)范圍，并提高了掃描速度(TOF-MS)的靈敏度，從而提高了檢測(cè)效率。然而，這種方法成本較高，因此尚未被常規(guī)使用?；鹧骐婋x檢測(cè)器(FID)-GC-FID的連接還可以用于常規(guī)樣品分析，該方法快速，非常靈敏，并且成本較低[41]。

1.1.3 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS是用于微生物快速鑒定和分類的最新一代工具。該方法的原理是基于短脈沖激光對(duì)微生物細(xì)胞的電離，然后利用電場(chǎng)在真空系統(tǒng)中加速顆粒[16，42]。電離后，獲得光譜圖形式的分子指紋，該指紋對(duì)于每種微生物都是特異的，將該頻譜與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，通過自動(dòng)化程序?qū)ζ溥M(jìn)行識(shí)別。MALDI-TOF的主要優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約時(shí)間，鑒定過程不再需要24 h～48 h，只需不到1 h即可完成。

MALDI-TOF MS是目前在儲(chǔ)糧和環(huán)境中致病微生物檢測(cè)和鑒定中最常用的技術(shù)之一[43，44]，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，可分為全細(xì)胞分析和細(xì)胞裂解物分析。在實(shí)際過程中，通過對(duì)糧食中微生物的特征性生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，將含有標(biāo)志物分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜圖，與基因組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，完成對(duì)儲(chǔ)糧微生物的快速鑒定，并進(jìn)行產(chǎn)毒機(jī)理的探究以指導(dǎo)糧食儲(chǔ)藏微生物防治工作的開展[45-48]。

MALDI-TOF的替代方法是電噴霧電離(ESI)-MS，該方法可以分析液態(tài)樣品并在大氣壓下進(jìn)行的電離，而無需重復(fù)使用與MALDI-TOF-MS中相同的激光。因此，ESI-MS在微生物鑒定方面具有更廣泛的應(yīng)用范圍[21，49-51]。

1.2 光譜法

光譜法是一種強(qiáng)大的多元且可重現(xiàn)的方法，在現(xiàn)今的研究中顯示出巨大的潛力。光纖光譜學(xué)處理分子官能團(tuán)的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)，這是輻射與樣品相互作用時(shí)能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果，并引起電子激發(fā)、振動(dòng)變化和旋轉(zhuǎn)變化。光譜隨樣品分子組成的不同而變化，因此，它們與樣品的化學(xué)成分(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、膜、藥物、人體組織等)有關(guān)。從理論上講，任何樣品都可以通過光譜學(xué)進(jìn)行虛擬分析，并與分子生物學(xué)互補(bǔ)。因?yàn)樗鼈兺ǔ２恍枰茐奈⑸?，因此這些方法具有更高的使用價(jià)值。同時(shí)該方法也存在一些局限性，建議在使用每種方法前可以使用多種光譜分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行仔細(xì)的驗(yàn)證。

1.2.1 紅外光譜(FTIR) 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)具有通用性、快速性、非侵入性的特點(diǎn)，并且與其他方法相比[52-55]更易于執(zhí)行，在微生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域都有應(yīng)用。這種分析技術(shù)是一種無化學(xué)和無標(biāo)簽的方法，可以清晰地闡明整個(gè)樣品的化學(xué)成分和物理狀態(tài)，可以分析多種生物分子。僅使用極少量的樣品，就可以通過一次測(cè)量獲得有關(guān)主要生物分子(如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，碳水化合物和核酸)的詳細(xì)信息[56]。

使用這種技術(shù)評(píng)估微生物的整個(gè)生物系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致光譜非常復(fù)雜，出現(xiàn)主要化合物的吸收譜帶重疊的現(xiàn)象。因此，為了從光譜中只提取正在研究的生理過程的相關(guān)信息，適當(dāng)?shù)亩嘣y(tǒng)計(jì)分析至關(guān)重要[57]。

1.2.2 拉曼光譜-振動(dòng)光譜 另一種廣泛使用的光譜方法是拉曼光譜法，它可對(duì)微生物進(jìn)行非侵入性，快速表征和鑒定，因而得到了廣泛認(rèn)可。它以低成本、快速和多樣的報(bào)告結(jié)果(微生物中的化學(xué)組成，結(jié)構(gòu)以及生物分子的相互作用)與其他系統(tǒng)區(qū)分開[58，59]。與其他光譜表征一樣，當(dāng)光入射到物質(zhì)上時(shí)，拉曼光譜結(jié)果取決于其與原子和分子的相互作用。當(dāng)原子振動(dòng)時(shí)，它將改變具有非極性基團(tuán)(例如C-C和S-S強(qiáng)拉曼帶)的官能團(tuán)的極化率。近年來，拉曼光譜已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定[60-64]。

紅外光譜和拉曼光譜都是振動(dòng)光譜的形式，可以提供“整個(gè)生物指紋”，如Lu，X.等所述[63]，振動(dòng)光譜法是根據(jù)生化成分來區(qū)分微生物，因此對(duì)于區(qū)分同一物種之間的微小差異非常有用。此外，Lu等[65]還將拉曼光譜技術(shù)與微流體芯片結(jié)合對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進(jìn)行了快速鑒定。Zhang等[66]也利用便攜式拉曼光譜儀通過金納米顆粒與樣品混合對(duì)致病性腸菌進(jìn)行了快速鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明拉曼光譜技術(shù)可以在2 h內(nèi)不需要培養(yǎng)基的情況下對(duì)致病性微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，因此可在糧食收購環(huán)節(jié)及儲(chǔ)藏期內(nèi)對(duì)微生物污染情況進(jìn)行快速準(zhǔn)確的判定，并即時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少糧食損耗。

1.2.3 核磁共振波譜學(xué)(NMR) NMR光譜學(xué)是一種用于鑒定微生物的替代性有效技術(shù)。向原子核施加強(qiáng)磁場(chǎng)和射頻脈沖，磁場(chǎng)會(huì)引起核自旋，吸收射頻能量(從低能到高能自旋態(tài))，并檢測(cè)到輻射的發(fā)射[67]。與其他方法相比，NMR可以以無創(chuàng)的方式進(jìn)行。此外，它的靈敏度降低，檢測(cè)限較低(1 μM～5 μM，并且需要相對(duì)較大的樣品量約500 μL)，盡管這些問題因它是一種定量方法而得到平衡[68]。

1.3 電動(dòng)分離方法

電動(dòng)學(xué)一詞在科學(xué)上是指帶電粒子通過基質(zhì)時(shí)的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。這種方法利用微生物組成的差異來獲得不同的遷移模式，這樣，在不重復(fù)樣品標(biāo)記的情況下，就可以分離得到不同的微生物。

毛細(xì)管電泳(CE)-MS由Joseph Loo于1989年開發(fā)并首次發(fā)表。它結(jié)合了電泳分離過程和質(zhì)譜檢測(cè)[69]。與GC和LC方法相比，它具有更好的分離效率，樣品用量更少，速度更快，試劑成本更低以及單次運(yùn)行即可分離得到陽離子、陰離子和不帶電荷分子的可能性。CE由于使用樣品體積小導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度不足，尤其是當(dāng)與MS連接時(shí)，可訪問的商業(yè)庫數(shù)量有限，并且保留時(shí)間的再現(xiàn)性降低。Armstrong等[70]將CE與毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)結(jié)合使用，可以分離和識(shí)別具有各種尺寸和形狀的7種微生物。這項(xiàng)研究的獨(dú)特之處在于，它證明了可以通過利用通常局限于大分子的技術(shù)來有效分離完整的生物細(xì)胞。目前另一種可能的方法是將CE與熒光相結(jié)合，用于觀察分離過程，并通過這種方法從細(xì)胞聚集和聚焦效應(yīng)方面監(jiān)測(cè)操作條件和微生物動(dòng)力學(xué)[71-73]。

電場(chǎng)流分級(jí)分離(EIFFF)是另一種利用微生物在電場(chǎng)中遷移能力的分離技術(shù)。2000年證實(shí)了其可用于微生物鑒定[74]。它基于在不同電場(chǎng)的影響下，由于各組組件的不同層(分級(jí))而導(dǎo)致的通道中樣本組件的分離。EIFFF裝置利用通道的兩個(gè)主壁在電極之間產(chǎn)生電勢(shì)差，從而導(dǎo)致電荷之間的分離[75]。

1.4 微流控芯片技術(shù)

微流控技術(shù)是一門以微機(jī)械加工、生物技術(shù)和微納米化學(xué)分析等為基礎(chǔ)發(fā)展起來的交叉學(xué)科。自上世紀(jì)90年代初期由Andreas等人提出并實(shí)現(xiàn)以來，微流體研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了迅速發(fā)展[76]。近年來，關(guān)于微流體芯片在微生物檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道有很多[77-80]。

微流控芯片技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用具有很多優(yōu)勢(shì)，如樣本消耗少、檢測(cè)通量高、靈敏度高且可以進(jìn)行在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在食品安全控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)和臨床診斷中具有巨大的適用性。目前利用微流體芯片進(jìn)行微生物檢測(cè)和鑒定的方法主要集中在將該技術(shù)與一些分析用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行組合，無需標(biāo)記程序。主要是與PCR技術(shù)[81，82]、質(zhì)譜技術(shù)[81，83，84]、光譜法[85]和電化學(xué)[86，87]等技術(shù)的組合使用。

2 分子生物學(xué)技術(shù)用于微生物鑒定

分子生物學(xué)時(shí)代的到來為各種臨床和研究目的細(xì)菌檢測(cè)、鑒定、表征和分型帶來了快速、準(zhǔn)確的工具和技術(shù)[88]?；蛐头椒ㄒ涯荑b定以前未知的種類繁多的分類群，鑒定無法培養(yǎng)的細(xì)菌，并促進(jìn)了對(duì)各種細(xì)菌群落的宏基因組學(xué)研究[89]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)菌鑒定的分子方法也從基于DNA擴(kuò)增的方法(PCR、實(shí)時(shí)PCR、PARD-PCR)到基于限制性片段分析，靶向基因和全基因組測(cè)序以及質(zhì)譜的更復(fù)雜的方法。

2.1 16S rRNA測(cè)序

從相對(duì)較低的起始材料中快速擴(kuò)增核酸靶標(biāo)，使PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為可用于檢測(cè)細(xì)菌靶標(biāo)的最靈敏技術(shù)之一。16S rRNA基因?qū)γ糠N細(xì)菌都具有高度特異性，因此成為微生物鑒定的理想靶標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)方法包括對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后測(cè)序并與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以進(jìn)行鑒定。但在兩個(gè)緊密相關(guān)的物種中16S rRNA基因相同的情況下，其他保守基因，如rpoB，tuf，gyrA，gyrB和熱激蛋白常被用作靶標(biāo)基因[90-92]?；赑CR的方法不僅比傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法快，而且有助于鑒定在實(shí)驗(yàn)室條件下難以生長(zhǎng)的細(xì)菌。目前，基于PCR的鑒定方法已成功并廣泛用于微生物檢測(cè)和鑒定[93-95]。

2.2 熒光定量PCR

與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR又稱實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time-PCR)具有許多優(yōu)勢(shì)，如更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，以及能夠通過熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)監(jiān)控DNA擴(kuò)增的能力，從而無需進(jìn)行任何PCR后檢測(cè)。RT-PCR也可以是定量的或半定量的，使用Cq值(熒光強(qiáng)度超過可檢測(cè)水平的循環(huán)數(shù))來定量DNA的數(shù)量。與常規(guī)PCR一樣，RT-PCR在實(shí)驗(yàn)室研究以及臨床中也有廣泛的應(yīng)用。它也適用于多種樣本，如從牛奶中原本無法培養(yǎng)的細(xì)菌的鑒定[96]到土壤生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌的鑒定[97]。使用針對(duì)16S rRNA基因保守區(qū)域的通用引物，已開發(fā)出一種可檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、克雷伯氏肺炎菌和綠膿桿菌的測(cè)定方法[98]。

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD-PCR)

與以前描述的基于PCR的方法不同，多態(tài)性DNA(RAPD)-PCR的隨機(jī)擴(kuò)增采用短引物(8至12個(gè)核苷酸)，其任意序列與模板細(xì)菌DNA非特異性結(jié)合。這導(dǎo)致模板DNA隨機(jī)重復(fù)區(qū)域的擴(kuò)增，從而為細(xì)菌鑒定提供了獨(dú)特的方法[99]。RAPD-PCR反應(yīng)可以從分離的DNA或粗細(xì)菌裂解液開始，然后在存在RAPD引物(或一組引物)和低水平的鎂離子(以增強(qiáng)非特異性退火)的條件下進(jìn)行擴(kuò)增[100]。然后將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以產(chǎn)生獨(dú)特的RAPD指紋。由于RAPD-PCR的引物通常是隨機(jī)結(jié)合模板的DNA片段，因此不需要提前知道目標(biāo)基因組的序列。這意味著它可以用于識(shí)別和分類各種細(xì)菌種類，這些細(xì)菌種類尚未被識(shí)別，或者無法提前獲得序列數(shù)據(jù)。此外，它可以直接從整個(gè)細(xì)菌中進(jìn)行，而無需分離DNA，并且可以應(yīng)用于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的鑒定[100]。

2.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)是一種使用獨(dú)特指紋來鑒定細(xì)菌菌株的方法，該指紋依賴于同源DNA序列中變異的存在(多態(tài)性)。這種基于PCR的方法使用了限制性內(nèi)切酶，該酶可以識(shí)別擴(kuò)增的DNA(PCR產(chǎn)物)并將其切割成不同長(zhǎng)度的DNA片段。如在RAPD中一樣，這些不同的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，從而為每個(gè)細(xì)菌菌株生成獨(dú)特的條帶模式。如果兩個(gè)菌株緊密相關(guān)，則它們的帶狀譜將相同或非常相似。另一方面，條帶模式的差異表明細(xì)菌菌株的多樣性。這項(xiàng)技術(shù)在調(diào)查傳染病暴發(fā)的分子流行病學(xué)方面具有高度相關(guān)性，在此過程中，確定多個(gè)病例或患者是否屬于同一暴發(fā)，追蹤暴發(fā)源并確定單個(gè)或多個(gè)細(xì)菌菌株非常重要[101]。

2.5 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)與RFLP相似，因?yàn)樗褂孟拗菩詢?nèi)切酶(通常是一對(duì))來將基因組DNA切割成線型的，然后使用連接的銜接子來擴(kuò)增限制片段的子集。通過使用與銜接子序列互補(bǔ)但也具有某些獨(dú)特核苷酸的引物實(shí)現(xiàn)該擴(kuò)增。因此，僅少量的限制性片段被選擇性地?cái)U(kuò)增。然后使用凝膠電泳分析AFLP指紋，從單個(gè)細(xì)菌基因組DNA產(chǎn)生一組不同的DNA片段。顯然，在沒有任何現(xiàn)有的基因組序列知識(shí)的情況下，AFLP具有很高的特異性和辨別性[102]。

2.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是一種分離DNA大片段的方法，對(duì)流行病學(xué)研究中細(xì)菌的鑒定和分型特別有用，是目前在核酸和分子水平上鑒定細(xì)菌的主要手段。在PFGE中，用釋放染色體DNA的酶和去污劑(蛋白酶和SDS)處理瓊脂糖塞中的純細(xì)菌菌株。然后將瓊脂糖塞子與限制性內(nèi)切酶一起孵育，該酶在特定位點(diǎn)切割以產(chǎn)生有限數(shù)量的DNA片段，使塞子在磁場(chǎng)中經(jīng)電流作用，交替旋轉(zhuǎn)(這會(huì)增強(qiáng)大的DNA片段的運(yùn)動(dòng))，導(dǎo)致DNA片段的大小分離并出現(xiàn)模式條帶[103]，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的鑒定。

2.7 核糖體分型

核糖體分型是一種用于細(xì)菌鑒定和表征的方法，與其它分子分型方法不同，它采用基于rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析。鑒于rRNA基因(如16S rRNA)在細(xì)菌物種內(nèi)高度保守，因此識(shí)別16S rRNA基因多態(tài)性反映了細(xì)菌物種的進(jìn)化譜系，可以闡明細(xì)菌的分類以及毒理學(xué)、分類學(xué)、流行病學(xué)研究[104]。核糖體分型通常涉及一個(gè)多步驟過程，該過程以靶向目標(biāo)基因組序列的限制性內(nèi)切酶為起點(diǎn)，然后進(jìn)行Southern印跡轉(zhuǎn)移和與探針的雜交，并分析核糖型RFLP帶。隨著分子工具的進(jìn)步和對(duì)基因組序列的了解，已對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了多種修改[104]。需要注意的是，出于引物和探針設(shè)計(jì)的目的，核糖體分型分析需要對(duì)所研究的基因組序列有一定了解[105，106]。

2.8 全基因組測(cè)序(WGS)

全基因組測(cè)序技術(shù)(WGS)最近已成為國(guó)際上食源性致病菌鑒定，分型和溯源的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。微生物全基因組測(cè)序涉及對(duì)細(xì)菌、病毒或其他微生物的整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，并將序列與已知參考序列進(jìn)行比較。對(duì)于檢測(cè)低頻突變、發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵缺失與插入以及發(fā)現(xiàn)微生物菌株之間的其他基因變化來說，快速準(zhǔn)確地生成微生物基因組序列信息十分重要。整個(gè)細(xì)菌基因組的分析不僅為細(xì)菌的類型和進(jìn)化譜系提供了前所未有的見解，而且還徹底改變了我們了解抗菌素耐藥性和爆發(fā)調(diào)查的方法。WGS技術(shù)和分析管道的進(jìn)步迅速提高了輸出和分析速度，同時(shí)也降低了總成本[107]。

3 總結(jié)

在過去的幾十年中，出現(xiàn)了很多用于確定糧食微生物樣品身份的工具。盡管有局限性，但培養(yǎng)和顯微鏡檢查方法仍然是最常用的兩種技術(shù)，快速，低成本，靈敏和可重現(xiàn)性的進(jìn)行微生物篩選的方法的發(fā)展仍是現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展中的重要問題。隨著分子生物學(xué)以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，用現(xiàn)代方法(MALDI-TOF MS或電遷移技術(shù)等)替代費(fèi)時(shí)費(fèi)力的表型方法，是食品安全領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)診斷行業(yè)所面臨的現(xiàn)有挑戰(zhàn)的解決方案。此外，我們一方面仍需不斷地研究和開發(fā)新的有效的儲(chǔ)糧微生物檢測(cè)技術(shù)，另一方面也要綜合利用現(xiàn)有的檢測(cè)方法，以形成多技術(shù)方法融合的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，為有害微生物的綜合防治提供可靠的、科學(xué)的決策依據(jù)，將儲(chǔ)糧損失降到最低。