陳 旋，張 航，2，吳 丹，2，楊 延，2

（1.滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000；2.云南省紅茶工程技術(shù)研究中心，云南 臨滄 677000）

在咖啡初加工過程中會產(chǎn)生大量的果皮廢棄物，將咖啡果皮用于生產(chǎn)乙醇，既避免了資源的浪費(fèi)，又提高了咖啡的附加值。目前，有關(guān)咖啡果皮發(fā)酵制乙醇的工藝研究報(bào)道較少，且乙醇產(chǎn)出率很低。1989年，利美蓮等將濕法加工后的咖啡果肉分別用高壓滅菌、藥物滅菌、蒸煮3種方式進(jìn)行處理后，再用酵母菌混合菌種進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵，釀造咖啡果酒和咖啡白蘭地酒，其中咖啡果皮的出酒率為37.6%。2014年，SHamadi等利用酵母菌對咖啡渣進(jìn)行發(fā)酵制備乙醇，發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇含量為4.7%。文章以臨滄咖啡果皮為原料制備乙醇，并對其工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 咖啡果皮

取自云南省臨滄市云縣幸福鎮(zhèn)咖啡廠咖啡豆?jié)穹庸たХ葟U棄物，去除果皮中的咖啡豆，密封于溫度為4℃的冰箱貯藏。其中粗蛋白（7.31±0.05）%，粗脂肪（2.67±0.04）%，灰分（8.15±0.01）%，水分（61.69±0.07）%，粗纖維（20.44±0.06）%，總糖（18.4±0.05）%。

1.1.2 菌種

白酒曲（安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試劑

1.2.1 無水乙醇

優(yōu)級純（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2 重鉻酸鉀

分析純（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備有LDZF 50KB-LLL型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、754紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、TDL-4型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）、HHS型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)）、ZHWY-211D型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)）、PHS-3C型pH計(jì)（上海精科有限公司生產(chǎn)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 稀酸預(yù)處理

稱取10 g咖啡果皮，按液固比4∶1加入2.50%硫酸，130℃，水解處理60 min，獲得咖啡果皮稀酸預(yù)處理水解液。

1.4.2 咖啡果皮發(fā)酵培養(yǎng)基

將預(yù)處理后的水解液進(jìn)行過濾，收集濾液30 mL置于發(fā)酵瓶中，調(diào)節(jié)pH值為5，在115℃的條件下，滅菌30 min。

1.4.3 咖啡果皮發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定

采用重鉻酸鉀氧化分光度法測定咖啡果皮發(fā)酵液中乙醇的含量。取2 mL發(fā)酵液于離心管中，3 000 r/min離心2 min，取上清液1 mL于25 mL試管中，加5%K2Cr2O7溶液2 mL，沸水浴10 min顯色，迅速冷卻至室溫，加無菌水定容至10 mL，混合均勻，在590 nm處測定吸光值。以無水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出測定樣品中乙醇含量。試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.5652x+0.0231（R2=0.9993）。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

在無菌操作臺內(nèi)，咖啡果皮發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10%白酒曲攪拌均勻，35℃、80 r/min下培養(yǎng)發(fā)酵，分別考察發(fā)酵時間為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時，對咖啡果皮發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響；接種量為5%、8%、10%、12%、15%時，對咖啡果皮發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響；氮源為硫酸銨、磷酸二氫銨、酵母浸粉、蛋白胨、尿素時，對咖啡果皮發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響。

1.4.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵時間、尿素3個因素，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對咖啡果皮發(fā)酵乙醇的工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素及水平編碼，見表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素級水平編碼Tab.1 The factor level coding of orthogonal test

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的影響

當(dāng)發(fā)酵時間為24 h時，乙醇體積分?jǐn)?shù)最大，為2.78%，故咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇最佳時間為24 h。

2.1.2 接種量對咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的影響

接種量是發(fā)酵的基礎(chǔ)，影響發(fā)酵效率和發(fā)酵效果。在發(fā)酵過程中，接種量的大小會影響酵母的生長，進(jìn)而影響酒精發(fā)酵。圖1表明，15%的接種量條件下，乙醇的體積分?jǐn)?shù)最大，故最佳接種量為15%。

圖1 接種量對乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 The effect of inoculation amount on ethanol volume fraction

2.1.3 不同氮源對咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的影響

見圖2所示，尿素的乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著高于其他氮源，故最佳氮源為尿素。

圖2 不同氮源對乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 The effect of different nitrogen sourceson ethanol volume fraction

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量（A）、發(fā)酵時間（B）和尿素（C）3個因素，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，采用L9（3）4正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2，各因素對乙醇體積分?jǐn)?shù)影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C。通過直接分析法，咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)工藝條件為A3B2C1；通過方差分析法，咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)工藝條件為A3B1C2，即接種量為25%、發(fā)酵時間為12 h、尿素為0.2%。

由于尿素對咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的影響最小，以尿素為誤差所在列考慮接種量、發(fā)酵時間的顯著性，可以看出接種量對咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的影響顯著，方差分析，見表2所示。

表2 正交試驗(yàn)方差分析Tab.2 The variance of orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別對直接分析法和方差分析法所得優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，方差分析法工藝條件（A3B1C2）下，乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.42%；直接分析法（A3B2C1）工藝條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.21%，故咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的最佳方案為A3B1C2。即接種量為25%、發(fā)酵時間為12 h、尿素為0.2%。

3 結(jié)語

文章以咖啡果皮為原料，通過對影響咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇的3個因素（接種量、發(fā)酵時間、氮源）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定咖啡果皮發(fā)酵制備乙醇最優(yōu)工藝條件為接種量為25%、發(fā)酵時間為12 h、尿素為0.2%，實(shí)際測定乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.42%。文章實(shí)驗(yàn)結(jié)果為生物質(zhì)能源乙醇的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供相應(yīng)的工藝參數(shù)和理論依據(jù)，同時也為咖啡加工后廢棄物的綜合利用和深入研究奠定了基礎(chǔ)，避免了資源浪費(fèi)。