魏亞楠，彭慧，楊乾，鄭曉淵，唐中祺，朱艷，頡建明，畢陽(yáng),?

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，蘭州 730070

0 引言

【研究意義】愈傷是馬鈴薯塊莖的重要采后特性，通過(guò)在塊莖傷口處形成愈傷組織可有效抑制水分蒸騰，削弱病原物對(duì)塊莖的侵染能力[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬鈴薯塊莖的愈傷受溫度、濕度等環(huán)境因素的影響[2]。早期人們就觀察到，光照會(huì)抑制塊莖傷口處軟木脂的積累，對(duì)愈傷不利[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，UV-C照射可促進(jìn)馬鈴薯塊莖的愈傷，從而有效降低損傷塊莖的水分蒸騰[4]。由于苯丙烷代謝可為馬鈴薯愈傷提供所需的酚類物質(zhì)單體[5]，該代謝的諸多關(guān)鍵酶基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子MYB的調(diào)控，而光照是調(diào)控MYB的最重要環(huán)境因素[6]。由此表明，光照可通過(guò)調(diào)控苯丙烷代謝來(lái)影響馬鈴薯的塊莖愈傷。有研究表明，黑暗會(huì)提高鮮切芹菜中多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的活性，促進(jìn)貯藏期間可溶性醌的積累[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，黑暗會(huì)提高日本牽?；–DPK1的表達(dá)[8]，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生。此外，脂肪酸代謝可為馬鈴薯愈傷組織中聚脂軟木脂的形成提供所需的羥基脂肪酸單體[9]。光照會(huì)提高馬鈴薯塊莖的棕櫚酸和硬脂酸含量，降低亞麻酸和油酸含量[10]。由此表明，光照還可通過(guò)調(diào)控脂肪酸代謝來(lái)影響馬鈴薯的塊莖愈傷。【本研究切入點(diǎn)】盡管已有光照抑制馬鈴薯愈傷的早期現(xiàn)象觀察，但缺乏系統(tǒng)的生理生化和細(xì)胞學(xué)證據(jù)。至于黑暗是否影響馬鈴薯愈傷封閉層的形成尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以世界范圍內(nèi)廣泛栽培且愈傷能力較強(qiáng)的‘大西洋’馬鈴薯原原種為試材，塊莖切半后分別置于人工光照和黑暗條件下，通過(guò)測(cè)定愈傷期間損傷塊莖的失重率和損傷接種塊莖的病情指數(shù)，觀察傷口處組織表面的色度以及軟木脂和木質(zhì)素的積累，分析傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶和過(guò)氧化物酶活性以及H2O2含量，以比較黑暗和光照對(duì)馬鈴薯塊莖愈傷效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試‘大西洋’馬鈴薯原原種（SolanumtuberosumL.cv.Atlantic）于2018年7月購(gòu)自甘肅省定西市甘肅愛(ài)蘭馬鈴薯種業(yè)有限責(zé)任公司。挑選大小均一、無(wú)損傷、無(wú)蟲(chóng)害的塊莖裝入網(wǎng)眼袋中（25 kg/袋），當(dāng)天運(yùn)至甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院在 4℃冷庫(kù)中貯藏（（95±5）% RH）待用。

供試馬鈴薯干腐病病原菌硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureumSchltdl.）由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上保存待用。

1.1.2 試劑 肉桂酸-4-羥化酶和過(guò)氧化氫測(cè)試盒為蘇州科銘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；4-香豆酰輔酶A連接酶提取液為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2450，島津公司，日本），立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠，中國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（H-1850R，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司，中國(guó)），熒光顯微鏡（BX51，奧林巴斯有限公司，日本），酶標(biāo)儀（1510，賽默飛世爾儀器有限公司，美國(guó)），電熱恒溫水浴鍋（HH-2，江蘇省金壇市榮華儀器制造公司，中國(guó)）；超低溫冰箱（DW-HL218，美菱低溫科技有限公司，中國(guó)）；超凈工作臺(tái)（S.SWCJ-IFD，上海醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）；自動(dòng)全雪花制冰機(jī)（IMS-40，常熟市學(xué)科電器有限公司，中國(guó)）；旋渦混合器（XH-B，江蘇健康醫(yī)療用品有限公司，中國(guó)）；分光光度儀(Ci6x，日本愛(ài)色麗有限公司，日本)；研磨機(jī)（A 11 basic S025，IKA艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)）；照度計(jì)（TES-1334A，泰仕電子工業(yè)股份有限公司，中國(guó)）。

參照YIN等[11]的方法。塊莖用自來(lái)水清洗干凈后在1% NaClO消毒5 min，然后用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，晾干后用無(wú)菌不銹鋼刀沿中部將塊莖切成兩半。用無(wú)菌蒸餾水沖洗切面，然后用75%的乙醇擦拭消毒，并灼燒多余酒精。隨后，將塊莖放在無(wú)菌濾紙上并噴灑無(wú)菌水以保持水分，在人工光照氣候室（照明燈管為T(mén)5支架LED植物燈，長(zhǎng)60 cm，單層功率120 W）中常溫（（20±3）℃，（95±5）% RH）愈傷。光照處理的塊莖切面面向燈管，光照強(qiáng)度為11 000 lx；黑暗處理塊莖切面向上，架內(nèi)關(guān)閉光源，用遮光布進(jìn)行遮光。每處理用切半的塊莖200個(gè)，重復(fù)3次。

1.4 增減員申報(bào)。所謂增員，顧名思義就是指企業(yè)進(jìn)入新的職工。每當(dāng)單位進(jìn)入新的職工，單位相關(guān)人員就應(yīng)該對(duì)新員工的信息進(jìn)行登記。在這個(gè)過(guò)程中，我們應(yīng)該認(rèn)真看清保險(xiǎn)的類型，還應(yīng)該標(biāo)注清楚增加員工的原因以及日期。

1.2 方法

1.2.1 塊莖人工損傷及愈傷

周冬梅 女 1973年生，成都理工大學(xué)副教授,西南交通大學(xué)在讀博士，研究方向：微波技術(shù)、通信技術(shù)、交通安全工程.

1.2.2 愈傷效果的評(píng)價(jià)

民辦本科院校學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)的態(tài)度不是很積極，對(duì)于深?yuàn)W的數(shù)學(xué)推導(dǎo)往往有畏難情緒．?dāng)?shù)學(xué)建模課程中采取案例式教學(xué)方法，課堂上首先對(duì)一些生動(dòng)的實(shí)際問(wèn)題進(jìn)行分析，在分析的基礎(chǔ)上自然而然地建立數(shù)學(xué)模型，然后再使用數(shù)學(xué)方法分析求解．這種教學(xué)方法符合學(xué)生的認(rèn)知理論，學(xué)生很容易接受．如微分方程內(nèi)容的案例有出土文物年代的推斷，陳光標(biāo)代言天杞園減肥是真是假案例；從手機(jī)導(dǎo)航這一問(wèn)題來(lái)講解圖論中的最短路徑問(wèn)題，從灑水車灑水問(wèn)題來(lái)講解郵遞員路徑問(wèn)題；從大學(xué)生手上的零花錢(qián)如何分配最佳來(lái)講解運(yùn)籌學(xué)中的最優(yōu)化問(wèn)題等．

參照 YUAN等[20]的方法測(cè)定過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的活性。稱取3.0 g冷凍粉末，于5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5，含1 mmol·L-1PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）中冰浴研磨成漿，在4℃、12 000×g條件下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.03 mL粗酶液，3 mL 25 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚，0.2 mL 5 mmol·L-1H2O2。反應(yīng)15 s時(shí)于 470 nm處測(cè)定吸光值 2 min。酶活性用mmol·kg-1FW 表示。

(1)新中心節(jié)點(diǎn)表現(xiàn)明顯。解放碑、小三峽、神女峰、三峽大壩、白帝城5個(gè)節(jié)點(diǎn)組成了三峽旅游流動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的主體。這些景區(qū)作為主要旅游目的地，其依托的城市已成為三峽游的集散中心，此前學(xué)者認(rèn)為的集散中心，如萬(wàn)州、涪陵表現(xiàn)不明顯。

病情指數(shù)的測(cè)定參照李雪等[13]方法并修改。先配制1×106個(gè)孢子/mL的F.sulphureum孢子懸浮液。在愈傷的第0、3、5、7和14天從人工氣候室中分別取出黑暗和光照處理的塊莖，在傷口表面均勻涂抹30 μL上述孢子懸浮液，待晾干后裝入打孔聚乙烯保鮮袋（40 mm×30 mm，厚度0.02 mm）中。黑暗下常溫培養(yǎng)7 d后按下式統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。每處理用切半塊莖8個(gè)，重復(fù)3次。

其中發(fā)病級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)：4級(jí)為傷口表面全部發(fā)病，3級(jí)為傷口表面3/4傷口發(fā)病；2級(jí)為傷口表面1/2發(fā)??；1級(jí)為傷口表面1/4發(fā)病；0級(jí)為傷口表面不發(fā)病。

1.2.2.2 觀察聚酚軟木脂、聚脂軟木脂和木質(zhì)素在傷口處的沉積 聚酚軟木脂（suberin poly phenolic，SPP）和聚脂軟木脂（suberin poly aliphatic，SPA）的沉積觀察參照 LULAI等[14]的方法并修改。用手術(shù)刀在垂直于塊莖傷口表面處切下0.1 mm的切片，放入盛有無(wú)菌蒸餾水的離心管中。SPP染色：使用0.1%的小檗堿對(duì)切片染色40 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3次，再分別用 75%的乙醇溶液和無(wú)菌水沖洗 3次，切片隨后用0.25%甲苯胺藍(lán)染液（由pH 4.4乙酸鈉緩沖液配制）染色1.5 min，再分別使用無(wú)菌蒸餾水、75%乙醇、無(wú)菌蒸餾水沖洗。SPA染色：步驟同SPP，染液分別為0.05%的甲苯胺藍(lán)和1%中性紅染液。切片經(jīng)染色后在熒光顯微鏡下（激發(fā)波長(zhǎng)470—495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510—550 nm）觀察拍照。

木質(zhì)素的沉積觀察參照ALBA等[15]的方法。將黑暗和光照處理下的塊莖用手術(shù)刀垂直于傷口表面切出0.2——0.3 mm厚的薄片，在蒸餾水中浸泡和沖洗 3次除去淀粉顆粒后，用1%間苯三酚-濃鹽酸溶液染色2 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 上述各項(xiàng)測(cè)定至少重復(fù) 3次。所有數(shù)據(jù)使用Excel 2016計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差（±SE），用 SPSS 19.0（SPSS Inc.，USA）進(jìn)行 Duncan’s差異顯著性（P＜0.05）分析，采用Excel 2017作圖。

中國(guó)水利：水利發(fā)展離不開(kāi)政策法規(guī)的支撐與保障。請(qǐng)問(wèn)2013年水利政策法規(guī)工作取得了哪些進(jìn)展，成效如何？

1.2.3 愈傷組織色度的測(cè)定 分別在損傷后的第0、3、5、7和14天將處理塊莖從人工光照氣候室中取出，將分光光度儀的目標(biāo)視窗垂直于傷口組織表面測(cè)定L*、a*和b*值。每個(gè)處理用切半塊莖8個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.4 生化測(cè)定取樣 參照J(rèn)IANG等[17]的方法。用手術(shù)刀在垂直于塊莖傷口表面取傷口表面及垂直下方2 mm處組織，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉，裝入離心管中置于-80℃的低溫冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.2.5 酶活性的測(cè)定 參照MARTINEZ-TELLEZ等[18]方法測(cè)定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活性。稱取3.0 g冷凍粉末，加入3 mL 0.1 N的硼酸緩沖液（pH 8.8，內(nèi)含 10% PVPP，1 mmol·L-1EDTA 和 50 mmol·L-1β-巰基乙醇），冰浴研磨后于 4℃、10 000×g離心25 min，取上清液用于酶活性測(cè)定。反應(yīng)體系：2 mL 7 mmol·L-1底物混合液（L-苯丙氨酸用硼酸緩沖液配置），200 μL粗酶液，30℃下反應(yīng)30 min，加入200 μL 6 mol·L-1HCl終止反應(yīng)，在290 nm處測(cè)定吸光度值。以每分鐘變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。酶活性用U·g-1FW表示，F(xiàn)W表示樣品鮮重。

采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）方法測(cè)定肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）的活性。稱取冷凍粉末0.2 g，加入2 mL提取液冰浴勻漿。按照說(shuō)明書(shū)操作，在340 nm處測(cè)吸光度值。酶活性用 nmol·min-1·g-1FW 表示。

傷口部位的SPP和SPA的積累速率和積累量反映了傷口周皮的形成程度。愈傷期間，黑暗和光照處理塊莖傷口處的SPP和SPA的積累量均逐漸增加，與光照相比，黑暗處理下SPP和SPA的積累量更高（圖2-A、B）。黑暗和光照處理SPP和SPA積累的顯著差異始于愈傷第5天，第14天時(shí)，黑暗處理SPP和SPA的細(xì)胞層厚度分別高于光照處理 38.22%和36.76%（圖2-D、E）。在愈傷期間，無(wú)論黑暗還是光照，塊莖傷口處木質(zhì)素的積累量均逐漸增加，但黑暗處理的積累量顯著高于光照處理（圖 2-C）。黑暗和光照處理木質(zhì)素積累的差異起始于愈傷第3天，愈傷第14天時(shí)，黑暗處理的木質(zhì)化細(xì)胞層厚度高于光照處理14.71%（圖2-F）。上述結(jié)果表明，黑暗促進(jìn)了軟木脂和木質(zhì)素在塊莖傷口處的積累，而光照則表現(xiàn)出一定程度的抑制。

根據(jù)可研推薦防治方案，治理工程主要有錨索格構(gòu)、主動(dòng)防護(hù)網(wǎng)、被動(dòng)防護(hù)網(wǎng)、隨機(jī)錨桿及排水渠等，工程區(qū)場(chǎng)地土標(biāo)準(zhǔn)凍結(jié)深度103 cm。

1.2.2.1 失重率和病情指數(shù)的測(cè)定 失重率的測(cè)定采用重量法[12]。在愈傷的第0、3、5、7和14天（‘大西洋’馬鈴薯在第14天時(shí)傷口表面的愈傷組織已經(jīng)完全形成），從人工氣候室中取出黑暗和光照處理的塊莖稱重，計(jì)算失重率（%）。每處理用切半塊莖8個(gè)，重復(fù)3次。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的測(cè)定參照YUAN等[20]的方法。取冷凍樣品3 g，于5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5，含1 mmol·L-1PEG、4%PVPP和1% Triton X-100）中冰浴研磨成漿，在4℃、12 000×g條件下離心30 min，收集上層酶液即為粗酶液。反應(yīng)體系：4 mL 50 mmol·L-1的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5），1 mL 50 mmol·L-1鄰苯二酚溶液，0.1 mL酶提取液。以蒸餾水為參比，在反應(yīng)進(jìn)行到15 s時(shí)測(cè)定混合液在420 nm波長(zhǎng)處的吸光值2 min。酶活性以 OD420·min-1·g-1表示。

失重率和病情指數(shù)是評(píng)價(jià)馬鈴薯塊莖愈傷效果的重要指標(biāo)。愈傷期間，黑暗和光照處理的塊莖失重率均逐漸升高，黑暗處理的失重率在第3—14天顯著低于光照處理，第 14天時(shí)，比光照處理低 56.37%（P＜0.05）（圖 1-A）。黑暗和光照處理塊莖的病情指數(shù)隨愈傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，黑暗處理塊莖的病情指數(shù)在第 3—14天顯著低于光照處理，第 7天和 14天時(shí)，分別低于光照處理58.96%和75.00%（P＜0.05）（圖 1-B）。失重率和病情指數(shù)的結(jié)果表明，黑暗促進(jìn)了馬鈴薯塊莖的愈傷，而光照則表現(xiàn)出一定程度的抑制。

傷口處 SPP、SPA和木質(zhì)化細(xì)胞層的厚度根據(jù)VAN OIRSCHOT等[16]的方法，通過(guò)IS Capture圖像軟件進(jìn)行測(cè)量計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 黑暗及光照對(duì)馬鈴薯塊莖愈傷期間失重率和病情指數(shù)的影響

1.2.6 H2O2含量的測(cè)定 采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）的方法測(cè)定。取冷凍粉末0.5 g，加入5 mL試劑1使其勻漿，按照說(shuō)明書(shū)操作，最后在415 nm處測(cè)定吸光值，用mmol·g-1FW表示H2O2含量。

2.2 黑暗及光照對(duì)愈傷期間塊莖傷口處軟木脂和木質(zhì)素積累的影響

參照SCHOCH等[19]方法測(cè)定4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活性。稱取3.0 g冷凍粉末，加入3 mL上海源葉生物科技有限公司的提取液，然后于4℃，15 000×g條件下離心20 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.45 mL 15 μmol·L-1Mg2+（硫酸鎂或氯化鎂），0.15 mL 5 μmol·mL-1p-香豆酸，0.15 mL 50 μmol·mL-1ATP，0.15 mL 1 μmol·mL-1CoA 以及 0.5 mL 酶液。40℃下反應(yīng)10 min，立即在333 nm處測(cè)定吸光度值。以每分鐘內(nèi)變化0.01為1個(gè)活性單位（U），酶活性用U·g-1FW表示。

2.3 黑暗及光照對(duì)愈傷期間塊莖傷口表面色度的影響

傷口表面的色度一定程度上反映了酚類物質(zhì)的氧化程度。愈傷期間，黑暗和光照處理塊莖傷口表面的L*值和 b*值均先下降后上升，黑暗處理塊莖的 L*值在整個(gè)愈傷期間均低于光照處理，第5天時(shí)低于光照處理13.51%（P＜0.05）（圖3-A）。黑暗處理塊莖傷口表面的 a*值在愈傷早期迅速上升，中后期趨于平穩(wěn)；光照處理的a*值在愈傷期間持續(xù)上升。黑暗處理塊莖的 a*顯著偏低，愈傷第 5天時(shí)，低于光照處理32.74%（P＜0.05）（圖3-B）。黑暗處理下塊莖傷口表面的b*值在第5天和第7天時(shí)顯著高于光照處理，其中第5天時(shí)高于光照處理42.11%（P＜0.05）（圖3-C）。色度測(cè)定結(jié)果表明，黑暗促進(jìn)了馬鈴薯塊莖傷口表面的褐變，而光照則表現(xiàn)出一定程度的抑制。

因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵體系中存在固相、氣相、液相三種界面，物料處于固-氣、固-液、氣-液界面中。根據(jù)界面效應(yīng)原理，同一種微生物生長(zhǎng)在均一相內(nèi)與生長(zhǎng)于二相中，其生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物會(huì)存在差異，固、液、氣三相同時(shí)存在為多種微生物提供了適宜的繁殖條件，有利于其繁殖和不同代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此造就了固態(tài)發(fā)酵釀造的食醋，具有獨(dú)特的風(fēng)味。

2.4 黑暗及光照對(duì)愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性的影響

苯丙烷代謝關(guān)鍵酶在塊莖愈傷中具有重要作用，不僅催化形成SPP和木質(zhì)素所需的酚單體，還可合成具有抗菌活性的類黃酮。愈傷期間，黑暗處理塊莖傷口處的PAL活性迅速上升，而光照處理的上升緩慢，黑暗處理的PAL活性始終高于光照，在愈傷第7天時(shí)比光照處理高79.56%（P＜0.05）（圖4-A）。兩種處理塊莖傷口處的C4H活性先上升后趨于平穩(wěn)，黑暗處理塊莖的活性增加時(shí)間更為提前。除第5天時(shí)光照處理高于黑暗處理外，其他時(shí)間點(diǎn)黑暗處理塊莖傷口處的C4H活性均顯著高于光照處理（圖4-B），愈傷第7天時(shí)，比光照處理高10.71%。兩種處理塊莖傷口處的4CL活性先迅速上升后持續(xù)下降，黑暗處理塊莖的4CL活性始終高于光照，第 7天時(shí)，高于光照處理72.48%（P＜0.05）（圖4-C）。上述結(jié)果表明，黑暗激活了馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝關(guān)鍵酶，其中對(duì)PAL的作用最為明顯。

2.5 黑暗及光照對(duì)愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處 H2O2含量和POD活性的影響

H2O2和POD是參與木質(zhì)素和軟木脂單體聚合的重要因素。黑暗和光照處理塊莖傷口處的H2O2含量在愈傷第一周均迅速上升，之后趨于平穩(wěn)。黑暗處理塊莖的H2O2含量在愈傷第3、5和7天顯著高于光照，分別比光照處理高1.3倍、49.85%和13.72%（P＜0.05）（圖5-A）。黑暗和光照處理塊莖傷口處的POD活性在愈傷期間均顯著上升，黑暗處理的POD活性明顯高于光照，第7天時(shí)比光照處理高73.46%（P＜0.05）（圖 5-B）。上述結(jié)果表明，黑暗促進(jìn)了愈傷早期和中期塊莖傷口處H2O2的積累，提高了中期和后期傷口處的POD活性。

2.6 黑暗及光照對(duì)愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處 PPO活性的影響

PPO是參與酚類物質(zhì)氧化褐變的重要酶。愈傷期間，黑暗處理塊莖傷口處的PPO活性在第3和14天顯著高于光照處理，分別比光照處理高12.93%和5.4%（P＜0.05）（圖6）。上述結(jié)果表明，黑暗提高了愈傷早期和后期傷口處的PPO活性，促進(jìn)了塊莖傷口處酚類物質(zhì)的氧化褐變。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，黑暗抑制了愈傷期間馬鈴薯塊莖的失重率，而光照則表現(xiàn)出一定程度的促進(jìn)。這主要是由于大量水分會(huì)通過(guò)傷口表面和表皮皮孔流失，少部分失重則緣于呼吸底物的消耗。光照下，馬鈴薯塊莖傷口處形成的軟木脂連續(xù)性不好，會(huì)導(dǎo)致更多的水分蒸發(fā)[3]。本研究還觀察到黑暗降低了接種塊莖的病情指數(shù)，這可能是由于黑暗條件下更多的軟木脂和木質(zhì)素積累量所致。軟木脂和木質(zhì)素會(huì)在傷口形成物理屏障，可有效阻止病原物在傷口處的擴(kuò)散，提高塊莖對(duì)病原物侵染的抵抗能力，同時(shí)也加強(qiáng)了細(xì)胞保護(hù)，防止了水分蒸發(fā)[21]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將所收集的數(shù)據(jù)由雙人錄入EpiData 3.1軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過(guò)SPSS 22.0軟件完成。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

The authors declare no competing financial interests.

苯丙烷代謝在馬鈴薯愈傷中具有至關(guān)重要的作用，可為軟木脂和木質(zhì)素的聚合提供酚類單體[22]。作為關(guān)鍵酶和限速酶，PAL參與苯丙烷代謝的第一步反應(yīng)[13]，催化苯丙氨酸去氨基轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，之后在C4H的作用下轉(zhuǎn)化為香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等酚酸，產(chǎn)生的酚酸通過(guò)4CL催化生成香豆酸-CoA、阿魏酸-CoA和咖啡酸-CoA[23]。另外，生成的羥基肉桂酸及其衍生物阿魏酸等可作為SPP的合成單體[24]。肉桂酰輔酶A還原酶和肉桂醇脫氫酶催化酚酸-CoA形成松柏醇、芥子醇和對(duì)香豆醇，可作為木質(zhì)素的合成單體[5]。有報(bào)道表明，光照作為重要的環(huán)境因子可調(diào)控苯丙烷代謝[23]。PARVEZ等[25]發(fā)現(xiàn)，光照會(huì)提高玉米胚芽鞘細(xì)胞壁中的 PAL活性。KUBASEK等[26]也發(fā)現(xiàn)，光照會(huì)增強(qiáng)擬南芥發(fā)芽幼苗中C4H和4CL的表達(dá)。本研究觀察到光照對(duì)馬鈴薯塊莖愈傷期間的PAL、C4H、4CL活性表現(xiàn)出一定程度的抑制，該結(jié)果與前人觀察到的結(jié)果相反，可能與馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝關(guān)鍵酶基因家族不同成員對(duì)光的敏感性存在差異有關(guān)。但具體光照或黑暗如何調(diào)控相關(guān)基因家族成員表達(dá)仍有待揭示。

當(dāng)塊莖受到傷害脅迫時(shí)，傷口處會(huì)發(fā)生氧爆[27]。導(dǎo)致氧爆的活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要由和H2O2組成，主要來(lái)源于NADPH氧化酶（NOX）[28]。當(dāng)塊莖受到損傷后，傷口處細(xì)胞胞質(zhì)外的Ca2+內(nèi)流，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，鈣依賴蛋白激酶（CDPK）感知并結(jié)合 Ca2+后活化，其進(jìn)一步通過(guò)磷酸化激活 NOX[2]，NOX將一個(gè)電子從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）中轉(zhuǎn)移到O2中從而產(chǎn)生，但由于存活壽命較短，很快會(huì)被超氧化物歧化酶歧化成壽命較長(zhǎng)的H2O2[29]。此外，多胺氧化酶和細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶也會(huì)生成少量的 H2O2用于塊莖的愈傷[30]。通常，塊莖機(jī)械損傷后會(huì)發(fā)生兩次氧爆，第一次產(chǎn)生于塊莖損傷后的早期，少量的ROS可作為第二信使激活糖代謝、脂肪酸代謝、莽草酸途徑、苯丙烷代謝等，以提供愈傷所需的底物；第二次產(chǎn)生于塊莖損傷后的中后期，大量的ROS參與了軟木脂的聚合及栓化過(guò)程[31]。有研究表明，日本牽?；ǖ母?、下胚軸和子葉PnCDPK1的 mRNA在黑暗條件下的表達(dá)高于光照，表明黑暗可促進(jìn)ROS的生成[8]。POD可在H2O2存在的情況下促進(jìn)SPP和木質(zhì)素單體的氧化交聯(lián)[24]。研究表明，黑暗顯著提高鮮切芹菜POD的活性[7]，這與本試驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致。SPP主要由大量的酚類單體通過(guò)酯鍵和醚鍵連接形成[32]，積累在細(xì)胞壁中。隨后，脂肪酸單體通過(guò)酯鍵相連構(gòu)成SPA[33]。之后，在甘油的作用下SPP和SPA通過(guò)POD氧化交聯(lián)，再嵌入可溶性蠟質(zhì)，形成木栓質(zhì)層積在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)[34]。松柏醇、芥子醇和香豆醇會(huì)在POD和H2O2的作用下聚合形成木質(zhì)素，作為苯丙烷代謝的終產(chǎn)物。木質(zhì)素是細(xì)胞壁次生壁的組成物質(zhì)，也是傷口周皮的主要成分，可使細(xì)胞壁更加堅(jiān)固，有效維持細(xì)胞內(nèi)的水分[35]。SPA底物主要來(lái)源于脂肪酸代謝[5]，這些脂肪酸單體主要包括一系列ω-羥基脂肪酸（16%—21%，主要為18:1）、飽和脂肪酸（12%—20%，16:0—28:0）、α、ω-二元酸（50%—55%，主要為18:1）和阿魏酸等[28]。本研究觀察到黑暗條件下，馬鈴薯塊莖傷口處木質(zhì)素和軟木脂的積累更快，積累量更多。原因可能是黑暗促進(jìn)了木質(zhì)素和軟木脂的積累，但黑暗調(diào)控馬鈴薯塊莖愈傷期間軟木脂和木質(zhì)素單體合成以及聚合的機(jī)制仍有待進(jìn)一步揭示。

愈傷期間本試驗(yàn)觀察到塊莖傷口表面褐變逐漸加深，這類褐變主要緣于酶促褐變[36]，由PPO氧化酚類物質(zhì)生成醌類物質(zhì)，最終形成類黑素沉積在傷口表面[27]。有報(bào)道稱，光照能顯著抑制鮮切芹菜的PPO活性，降低醌的積累和褐變指數(shù)[7]。另有研究觀察到，黑暗會(huì)促進(jìn)鮮切萵苣的組織褐變[37]。這些結(jié)果與本試驗(yàn)觀察到的結(jié)果類似。酚類物質(zhì)的氧化不僅導(dǎo)致褐變，而且形成的醌類物質(zhì)還具有抑菌作用，可以抑制接種病原菌在塊莖體內(nèi)的擴(kuò)展。

4 結(jié)論

黑暗激活了馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝關(guān)鍵酶，提高了POD和PPO活性以及H2O2含量，加快了軟木脂和木質(zhì)素在傷口部位的積累，加速了傷口表面的褐變，有效降低了塊莖愈傷期間的失重率和病情指數(shù)，促進(jìn)了馬鈴薯塊莖的采后愈傷。而光照則在一定程度上抑制了馬鈴薯塊莖的愈傷。