朱苗駿

摘 要 阿爾茨海默病是一種以進(jìn)行性認(rèn)知損害為特征的神經(jīng)退行性疾病，被認(rèn)為是最常見的癡呆病癥，其特征是b淀粉樣蛋白斑的積累和神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成，但目前還沒有可靠的生物標(biāo)志物或非侵入性技術(shù)可用于其早期檢測。近年來隨著生物標(biāo)志物和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，包括組織、血液和腦脊液在內(nèi)的microRNA的特異性表達(dá)與腦神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，預(yù)示著這些microRNA作為阿爾茨海默病診斷標(biāo)志物的巨大潛力。本文綜述了近年來microRNA和阿爾茨海默病的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 非編碼RNA 小RNA 阿爾茨海默病

中圖分類號：R749.16 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）13-0043-05

Research advances of Alzheimers disease and microRNA

ZHU Miaojun

（Shanghai Biovue Technology Co.， Ltd.， Shanghai 200063， China）

ABSTRACT Alzheimers disease is a neurodegenerative disease characterized by progressive cognitive impairment， the commonest cause of dementia. Two major physical hallmarks of the disease are the accumulation of beta amyloid plaques and the formation of neurofibrillary tangles. However， there are no reliable biomarkers or non-invasive techniques yet for its early detection. In recent years， with the development of molecular biology， more and more evidences have showed that the specific microRNAs expressed in tissue， blood and cerebrospinal fluid are related to neurodegenerative diseases. It is indicated that the great potential of these non-coding RNAs may be possibly used as diagnostic markers for Alzheimers disease. This article mainly reviews the research progress of microRNAs and Alzheimers disease in recent years.

KEy WORDS ncRNA； microRNA； Alzheimers disease

RNA不僅承擔(dān)遺傳信息中間載體的角色，而且更多地承擔(dān)了各種調(diào)控功能。在高等生物和人的基因組中非編碼區(qū)占到基因組序列的大部分，如人類基因組中編碼蛋白的序列只占有約3%～5%，其余約95%～97%為非編碼區(qū)[1]。這些長短不一、結(jié)構(gòu)各異的非編碼RNA（ncRNA）在生物體內(nèi)發(fā)揮著各種不同功能。隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展和非編碼RNA組學(xué)的不斷進(jìn)步，人們也逐漸認(rèn)識到這些基因在神經(jīng)退行性疾病中也發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。神經(jīng)退行性疾病包括有阿爾茨海默病（Alzheimers disease， AD）、亨廷頓?。℉untingtons disease， HD）、帕金森病（Parkinsons disease， PD）和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病。AD作為最常見的癡呆病癥（dementia disorder）被研究的最多[2]。本文著重探討微小RNAs（microRNA，miRNA或miR）與AD發(fā)病關(guān)系及在診療中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1 AD

AD也被稱為阿爾茨海默型老年性癡呆（dementia of Alzhermers disease），是慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病導(dǎo)致的癡呆，是癡呆最常見的病因和最常見的腦神經(jīng)退行性疾病，目前AD患者預(yù)計全球超過4 700萬[3]。臨床AD以漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變以及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀為特征，表現(xiàn)為緩慢的、漸進(jìn)性的、且不可逆的認(rèn)知和記憶功能喪失。由于神經(jīng)元和突觸的破壞，最終導(dǎo)致癡呆和死亡。AD的病因及發(fā)病機制迄今尚不明確，可能為多因素參與復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，包括遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫因素和環(huán)境因素等[4]。研究人員認(rèn)為主要有兩大學(xué)說：Aβ類淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein， Aβ）學(xué)說和Tau（tubulin associated unit，Tau）蛋白學(xué)說。Aβ的過量積累是由于AD病理導(dǎo)致其蛋白前體（amyloid precursor protein， APP）異常剪切成為對神經(jīng)元有毒性作用的不溶性Aβ42，這也是構(gòu)成老年斑的核心成分[5]。而Tau蛋白的過度磷酸化或乙?；赡苁茿D病理形成，使神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles， NFTs）而沉積于腦中導(dǎo)致神經(jīng)元變性[6]，此外還有其他假說，如膽堿能神經(jīng)元及突觸喪失、高膽固醇、2型糖尿病以及外傷造成的腦損傷等均造成罹患AD的可能性。甚至最新的大數(shù)據(jù)研究顯示，AD的形成可能與病毒感染有關(guān)[7]。其中大量的研究揭示年齡是AD的重要危害因素[8]，按年齡可分為早老性癡呆（小于65歲出現(xiàn)的AD，也被稱為early-onset AD）或家族性癡呆（familiar AD， FAD）和老年性癡呆（65歲之后出現(xiàn)的AD，也被稱為late-onset AD， LOAD）或者散發(fā)性癡呆（sporadic AD， SAD），隨著全球性的老齡化，預(yù)計至2050年，80歲以上老人將超過3.7億，按年齡增長AD患病風(fēng)險系數(shù)也增加來計算，至2050估計可能將有超過1.3億AD患者[9]。

自1906年第1例AD患者被發(fā)現(xiàn)并定義以來，還沒有真正能在臨床癥狀出現(xiàn)之前及早診斷的AD或?qū)崟r監(jiān)測及預(yù)后AD的生物標(biāo)志物。目前，也還沒有能治療或預(yù)防進(jìn)展期AD的藥物，藥物只能緩解癥狀。因此，用于AD治療過程中評價被測藥物療效的生物標(biāo)志物也亟待開發(fā)。

2 AD標(biāo)志物

目前被用于認(rèn)知AD的標(biāo)志物主要就是Aβ蛋白、Tau蛋白和磷酸化的Tau蛋白（P-Tau），在腦脊髓液（cerebrospinal fluid，CSF）和循環(huán)血中檢測Aβ、Tau和P-Tau濃度的方法已有報道[10-11]。有數(shù)據(jù)表明CSF中Aβ42蛋白濃度的降低可能和AD患者腦中Aβ42沉積有關(guān)聯(lián)，且發(fā)現(xiàn)利用CSF中Aβ42/Aβ40濃度比來判斷AD患者腦中Aβ蛋白的沉積情況[12-13]。而CSF中Tau蛋白和P-Tau蛋白的增加反應(yīng)了神經(jīng)元的退化，但研究發(fā)現(xiàn)僅從CSF中P-Tau蛋白的濃度并不能特異性地診斷出AD[14]。臨床也有利用正電子發(fā)射斷層顯像技術(shù)（positron emission tomography， PET）、核磁共振成像技術(shù)（magnetic resonance imaging， MRI）和生化分析等方法對Aβ蛋白和Tau蛋白進(jìn)行顯像。至目前為止，還沒有用于臨床AD診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3 AD發(fā)病機制和miRNA

隨著人類基因組（ENCODE Project）計劃的完成及表觀遺傳學(xué)的快速發(fā)展，非編碼RNA是當(dāng)今發(fā)展最為迅速的生命科學(xué)領(lǐng)域之一。其中，miRNAs作為研究最多的非編碼RNA成員，自1993年第一個miRNA（Lin-4）被發(fā)現(xiàn)十多年來[15]，人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2 800多個成熟miRNAs（http：//www.mirbase.org）。miRNA是一類長度約為19～24個核苷酸的內(nèi)源性、保守的單鏈非編碼RNA分子，它通過mRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因。90%的miRNAs和Ago2蛋白結(jié)合以游離態(tài)形式存在，也可以被細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles）例如囊泡小體（exosome）運輸，而這些miRNA均可通過miRNA芯片、深度測序和實時定量PCR的方法測定。

研究表明，在已發(fā)現(xiàn)的miRNAs中，腦中表達(dá)的miRNAs種類約有70%[16]。近年來，由于miRNA的作用機制比較清晰，在AD組織、細(xì)胞系和小鼠模型中越來越多與AD發(fā)病機制有關(guān)的miRNAs被闡明（如BDNF、Tau蛋白、BACE1和APP蛋白等）；也越來越多地發(fā)現(xiàn)與其他與腦功能機制相關(guān)的miRNA（如Aβ蛋白運輸子ABCA1、脂類運輸相關(guān)的ApoE、突觸功能異常等）。筆者總結(jié)了與AD發(fā)病機制相關(guān)的miRNAs，詳見圖1。

Millan等[17]在2017年就病理生理學(xué)角度整合了非編碼RNA和AD發(fā)病機制的綜述。Swarbrick等[18]在2019年綜述了miRNA在AD的組織和血液以及腦脊液中的研究狀況。Slota等[19]則從神經(jīng)炎癥方面總結(jié)了相關(guān)聯(lián)miRNAs。Moradifard等[20]整理文獻(xiàn)并統(tǒng)計分析了179個差異表達(dá)的miRNAs和1 404個不同表達(dá)的基因，指出miR-30a-5p和miR-335是與AD關(guān)系最密切的miRNAs。Nagaraj等[21]則在最新的文獻(xiàn)分析中指出在AD組織和正常組織中有136個不同的miRNAs差異表達(dá)，其中有36個不同的miRNAs被兩組以上獨立研究團(tuán)隊所報道，miR-125b被研究的最多（共6次）；在AD腦脊液中則有166個差異表達(dá)的miRNAs，而在比較了腦組織、血液和腦脊液miRNA后，只有3個miRNA（miR-125b、miR-146a和miR-135a）被證明具有表達(dá)一致性。

4 臨床AD診斷和miRNA生物標(biāo)志物

miRNA的變化已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用于疾病的診斷，也包括神經(jīng)退行性疾病。迄今為止的大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅在組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，而且在外周循環(huán)血及其他體液（如眼淚、支氣管灌洗液、尿液、胸水，腹水和腦脊液等）中也可以穩(wěn)定存在，并被嘗試作為特異性的標(biāo)志物用于包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的診斷與分類。

4.1 AD和腦脊液miRNAs

自2008年起由Cogswell等[22]發(fā)表第一篇CSF中miRNA作為AD的診斷標(biāo)志物的報道以來，已有10年的發(fā)展歷史。由于血腦屏障（blood brain barrier， BBB）的存在使得CSF中的miRNAs更能體現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）中miRNAs的特異性，而且有研究已證明CSF miRNAs的表達(dá)變化相對血液miRNAs能更穩(wěn)定且客觀地反映AD患者的狀態(tài)[23]。Cogswell等[22]的研究通過實時定量PCR探針法檢測超過了200個在CSF中不同表達(dá)的miRNAs，并比較不同期AD患者和健康對照組中發(fā)現(xiàn)了60個差異表達(dá)的miRNAs。隨后，一些相關(guān)的文獻(xiàn)報道指出CSF中miRNAs作為診斷標(biāo)志物的

巨大潛力[24-25]。Dangla-Valls等[26]首次發(fā)現(xiàn)并利用雙盲實驗佐證了AD患者在CSF中高表達(dá)的miR-222和miR-125b。而McKeever等[27]則在CSF囊泡小體中發(fā)現(xiàn)miR-16-5p可能與AD的早期發(fā)病有關(guān)聯(lián)。雖然這些工作非常振奮人心，但這些研究樣本的數(shù)量太少，且還沒有區(qū)分AD與其他神經(jīng)退行性疾病的CSF miRNAs的相關(guān)報道。由于CSF與腦直接關(guān)聯(lián)，能客觀地反映神經(jīng)系統(tǒng)的生化信號變化，因此，CSF中miRNAs的相關(guān)研究是非常有意義的，但CSF需要穿刺獲得，具有一定的侵入性，并會造成患者的不適感，故不適合做實時檢測。

4.2 AD和血miRNAs

眾所周知，血液樣品容易獲得，且適宜實時監(jiān)測，作為液體活檢的標(biāo)志性樣本，預(yù)示著循環(huán)血中miRNAs可能成為AD診療的重要生物標(biāo)志物[28]。早在2013年，Leidinger等[29]是第一個利用循環(huán)血中miRNA生物標(biāo)志物來預(yù)測AD，他們測定了215例病人和正常外周血樣本的miRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了140個差異表達(dá)的miRNAs，并找到由12個miRNA組成的指紋圖譜可以準(zhǔn)確（準(zhǔn)確度74%～78%）地從正常人或其他神經(jīng)退行性疾病中區(qū)分AD患者。Tan等[30]則在血清中首先通過高通量測序比較了AD患者和對照組中的miRNA表達(dá)情況，再利用實時定量PCR的方法在158例AD患者和155例對照中驗證了這些miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-342-3p的靈敏度（81.5%）和特異性（70.1%）是最好的。Li等[31]詳述了囊泡小體miRNAs和神經(jīng)退行性疾病的相互關(guān)系，Lugli等[32]則通過illumina高通量測序檢測了血漿exosome miRNAs，發(fā)現(xiàn)了在AD患者中差異表達(dá)的20個miRNAs，并通過生物信息統(tǒng)計分析得到由7個miRNAs組成的指紋圖譜可高準(zhǔn)確度（83%～89%）地判斷出AD，而且有意義的是，該團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)miR-342-3p在60%的AD患者中高表達(dá)，其可負(fù)調(diào)控錨蛋白（AnKG蛋白，一種與神經(jīng)軸突有關(guān)聯(lián)的蛋白），而且與該蛋白和miRNA有關(guān)的另一miR-32b則在AD患者中低表達(dá)。另一篇文獻(xiàn)則報道了血清exosome miRNAs：miR-135a、miR-193b和miR-384可以區(qū)分AD、PD和血管性癡呆（vascular dementia）[33]。Takousis等[34]統(tǒng)計了500多篇文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)70篇相關(guān)研究和1 000多個不同的miRNAs及miR-342-3p是在血液中表達(dá)差異最大的miRNA，而在CSF中則是miR-127-3p表達(dá)差異最顯著。Fransquet等[35]統(tǒng)計了基于血液miRNAs檢測AD的文獻(xiàn)，包括36篇相關(guān)文獻(xiàn)和395個miRNAs，統(tǒng)計還發(fā)現(xiàn)了6個差異性表達(dá)的miRNAs均在AD患者血液中低表達(dá)，交叉比對這些研究后發(fā)現(xiàn)只有13篇報道進(jìn)行了受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析，其中僅有3篇文獻(xiàn)構(gòu)建了支持向量機（support vector machine，SVM）模型進(jìn)行預(yù)測計算。關(guān)于AD和miRNA的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但由于AD發(fā)病機制和miRNA功能的復(fù)雜性，想要利用循環(huán)miRNA作為AD臨床診療的標(biāo)志物仍是路漫漫其修遠(yuǎn)兮。

5 展望

雖然科學(xué)家們指出miRNAs作為治療藥物的巨大潛力，特別是在神經(jīng)細(xì)胞丟失之前的臨床前階段進(jìn)行干預(yù)，但目前miRNAs的遞送方法（如脂質(zhì)或病毒載體）仍缺乏足夠的特異性、可靠性和穩(wěn)健性。雖然生物信息統(tǒng)計方法的快速發(fā)展，也為我們發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病相關(guān)重要基因、miRNA功能以及miRNA-mRNA等分子機制提供了新的思路，但如何系統(tǒng)地利用這些技術(shù)及設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)化，高效地利用生物信息方法進(jìn)行大數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，發(fā)現(xiàn)可靠且經(jīng)過大樣本量驗證的miRNAs生物標(biāo)志物用于AD的診療，特別是如何開創(chuàng)深化外周血miRNA作為AD生物標(biāo)志物的熱點領(lǐng)域，將會是我們未來面臨的巨大挑戰(zhàn)。 miRNA將為未來神經(jīng)退行性疾病中關(guān)鍵發(fā)病機制研究以及精確診斷提供新思路，并為探尋精準(zhǔn)治療及預(yù)后方面提供新途徑。

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