姚彩青，鄂晶晶，王俊國(guó)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

人體腸道復(fù)雜的微生物環(huán)境對(duì)于維持機(jī)體健康具有重要作用，采用多組學(xué)技術(shù)研究人類腸道微生物區(qū)系以及微生物與宿主相互作用的機(jī)制已成為趨勢(shì)[1]。其中宏基因組學(xué)以通量高，方法成熟且能快速得到樣品微生物組成而被廣泛應(yīng)用。在基于宏基因組測(cè)序的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)接近80%的細(xì)菌是未被培養(yǎng)的，且此方法具有嚴(yán)格的檢測(cè)閾值，只能檢測(cè)到每克樣品中含量≥106的微生物，漏檢了臨床上一些重要的潛在致病菌[2-3]。例如：與胃腸疾病密切相關(guān)的產(chǎn)毒素大腸桿菌以及腹瀉病例中的彎曲桿菌和沙門氏菌，存在因含量低而檢測(cè)不到的問(wèn)題[4-5]。純培養(yǎng)方法作為最早應(yīng)用于微生物研究的手段，具有較低的檢測(cè)閾值，同時(shí)讓更多之前被認(rèn)為是不可培養(yǎng)的微生物得以培養(yǎng)，截至2018年，采用多種培養(yǎng)方法從人體分離得到的細(xì)菌已達(dá)2 776 種，其中很大一部分來(lái)自人體腸道[6]。純培養(yǎng)方法在解析腸道微生物區(qū)系方面帶來(lái)的巨大貢獻(xiàn)，使這一技術(shù)被重新應(yīng)用起來(lái)。

起初微生物學(xué)家依靠培養(yǎng)來(lái)研究定居在人體腸道內(nèi)的微生物，發(fā)現(xiàn)同一樣品顯微計(jì)數(shù)得到的微生物數(shù)量遠(yuǎn)高于平板上培養(yǎng)的數(shù)量，證明樣品中存在大量未培養(yǎng)的微生物[7]。宏基因組測(cè)序能夠快速了解人體腸道微生物組成以及微生物與不同生理狀態(tài)宿主的潛在聯(lián)系，然而，只有培養(yǎng)得到特定的細(xì)菌，才能明確細(xì)菌在維持宿主健康或者導(dǎo)致患病所發(fā)揮的作用。同時(shí)，經(jīng)培養(yǎng)得到的菌種可以確定作為活體對(duì)宿主產(chǎn)生影響，而分子手段不能區(qū)分菌種的死活，容易出現(xiàn)誤以為死菌起作用的假陽(yáng)性結(jié)果[3，8]。由多種培養(yǎng)條件與細(xì)菌的快速鑒定相結(jié)合的培養(yǎng)組學(xué)在全面描述人類腸道微生物區(qū)系中發(fā)揮了重要作用，在一定程度上填補(bǔ)了宏基因組測(cè)序技術(shù)的空白[9-10]。研究表明：非培養(yǎng)的宏基因組學(xué)與培養(yǎng)組學(xué)僅有15%檢測(cè)到的菌種是相同的，兩種技術(shù)在方法學(xué)上的差異為研究人員解析腸道微生態(tài)的可培養(yǎng)菌群與總體菌群多樣性之間的差異帶來(lái)挑戰(zhàn)。表1列出兩種方法的差別。本文結(jié)合最新研究成果，重點(diǎn)介紹培養(yǎng)組學(xué)及其在人體腸道微生物研究中的應(yīng)用，同時(shí)探索培養(yǎng)組學(xué)今后的研究重點(diǎn)。

表1 非培養(yǎng)宏基因組學(xué)與培養(yǎng)組學(xué)在解析人類腸道微生物區(qū)系的差異Table 1 Differences between culture-independent metagenomic methods and culture-based methods in the analysis of human intestinal microbiota

1 培養(yǎng)組學(xué)

1.1 培養(yǎng)組學(xué)概述

培養(yǎng)組學(xué)也被稱作高通量的細(xì)菌分離培養(yǎng)，是采用多種培養(yǎng)方式，同時(shí)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS） 和16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)分離鑒定細(xì)菌的方法，目的是盡可能多的從樣品中獲得不同微生物，尤其是一些難培養(yǎng)的細(xì)菌[16]。培養(yǎng)組學(xué)最先是由環(huán)境微生物學(xué)家和臨床微生物學(xué)家所提出并應(yīng)用，之后應(yīng)用到研究人體腸道微生物[17-18]。多種培養(yǎng)方法的使用使得在不到5年的時(shí)間里從腸道中分離出531種先前從未培養(yǎng)的微生物，其中包括數(shù)百種新細(xì)菌，總的菌種數(shù)量較之前翻了一倍[19]。法國(guó)Lagier教授團(tuán)隊(duì)在培養(yǎng)組學(xué)研究上取得了很大成就，2012年該團(tuán)隊(duì)采用212 種培養(yǎng)方法對(duì)兩名非洲人和一名肥胖歐洲人的糞便進(jìn)行培養(yǎng)，并結(jié)合質(zhì)譜和16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)對(duì)獲得的32 500 個(gè)單菌落進(jìn)行鑒定，獲得了174 種在人體腸道首次培養(yǎng)的細(xì)菌包括31 個(gè)潛在新種。研究中所使用的培養(yǎng)方法類型豐富，從212 種方法中確定出70 種有效方法，可以培養(yǎng)出全部的細(xì)菌，其中20 種可以培養(yǎng)到73%的細(xì)菌[3]。此研究不僅首次培養(yǎng)出許多腸道中難培養(yǎng)的細(xì)菌，同時(shí)對(duì)于培養(yǎng)方法的摸索為今后研究中減少方法的數(shù)量做出巨大貢獻(xiàn)。2014年該團(tuán)隊(duì)從20 個(gè)方法中選擇出18 個(gè)最佳方法，有效減少了培養(yǎng)工作量，并在2016年用于37 份糞便樣品的培養(yǎng)，其中63 種首次被培養(yǎng)細(xì)菌、58 種非腸道細(xì)菌、65 種非人類細(xì)菌和89 種未知細(xì)菌得以培養(yǎng)[16，19]。2016年加拿大Lau 等[1]采用33 種培養(yǎng)基分厭氧、非厭氧共66 種培養(yǎng)條件對(duì)5份新鮮糞便樣品進(jìn)行分離，同時(shí)采用分子技術(shù)對(duì)樣品16S rRNA 基因V3 區(qū)擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)合兩種方法共鑒定到糞便中含量大于0.1%的全部微生物的95%，且培養(yǎng)方式鑒定到大多數(shù)的細(xì)菌，總共分離到79 個(gè)菌種純培養(yǎng)物，包括12 個(gè)人類微生物組計(jì)劃（Human microbiome project’s，HMP）最想獲得的菌種。

非培養(yǎng)的宏基因組測(cè)序方法在研究腸道微生物區(qū)系的貢獻(xiàn)不可忽視，近些年培養(yǎng)組學(xué)的優(yōu)勢(shì)也十分突出，結(jié)合兩種方法深入研究人體腸道菌群多樣性將是未來(lái)的研究趨勢(shì)。分子測(cè)序結(jié)果可指導(dǎo)用于恢復(fù)難培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)，同時(shí)通過(guò)分析健康與疾病宿主微生物的差異可以明確哪些菌株值得培養(yǎng)[20]。而經(jīng)培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)物更利于單菌株特殊基因功能的發(fā)掘，同時(shí)補(bǔ)充了基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，為通過(guò)宏基因組測(cè)序鑒定微生物提供方便。丹麥Rettedal 等[21]以培養(yǎng)腸道低豐度細(xì)菌為出發(fā)點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入不同類型抗生素用于選擇培養(yǎng)一些難培養(yǎng)的微生物，進(jìn)而對(duì)獲得的單菌株進(jìn)行耐藥表型分析，成功確定了人類腸道微生物區(qū)系中16 種抗生素耐藥表型的分類。微生物表型研究不僅包括菌株耐藥性，還包括對(duì)膽鹽，高或低pH 值等的耐受性，這些表型指標(biāo)在獲得菌株純培養(yǎng)物后很容易測(cè)得，且表型數(shù)據(jù)是細(xì)菌能否作為益生菌所必須篩查的。培養(yǎng)組學(xué)的應(yīng)用加快了具有潛在健康益處的新菌種的獲得，在一定程度上促進(jìn)了新型益生菌補(bǔ)充劑的開發(fā)利用。

1.2 不同策略用于難培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)

由多種培養(yǎng)方法與細(xì)菌的快速鑒定相結(jié)合的培養(yǎng)組學(xué)最重要的就是培養(yǎng)方法的設(shè)計(jì)，合適的培養(yǎng)策略決定獲得難培養(yǎng)微生物的數(shù)量。起初腸道中未被培養(yǎng)出來(lái)的這些微生物被稱作不可培養(yǎng)微生物，直到純培養(yǎng)技術(shù)被重新啟用才逐漸將其稱作難培養(yǎng)。所有難培養(yǎng)的微生物只要得到適合自身的培養(yǎng)方法都可以被培養(yǎng)[2]。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、環(huán)境、溫度和培養(yǎng)時(shí)間的選擇是培養(yǎng)條件中最基礎(chǔ)的點(diǎn)，此外培養(yǎng)策略的確定一方面基于基因組學(xué)分析的結(jié)果，依據(jù)對(duì)菌株代謝特性的預(yù)測(cè)，找到抑制或者適合菌株生長(zhǎng)的添加物。另一方面，保證收集到的樣品能快速被培養(yǎng)，人體腸道中厭氧菌豐富，一些嚴(yán)格厭氧菌暴露在空氣中太久就會(huì)因接觸氧氣而失活，不利于后續(xù)的分離培養(yǎng)[22]。

傳統(tǒng)商業(yè)化的非選擇性培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，往往將樣品中生存能力強(qiáng)且含量較高的菌群培養(yǎng)出來(lái)，而研究目的是培養(yǎng)腸道中含量低于106未被宏基因組學(xué)檢測(cè)到的“暗物質(zhì)”，故需要通過(guò)不同培養(yǎng)方式或在培養(yǎng)基中添加特定成分確保達(dá)到選擇性培養(yǎng)的目的，也被稱為 “殺死贏家策略”[9]。Rettedal 等[21]在加入環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑和紅霉素等不同抗生素組合的平板上分離到了HMP 最想獲得的12 種微生物，并結(jié)合表型數(shù)據(jù)，進(jìn)一步明確哪種抗生素組合對(duì)應(yīng)分離得到哪種類型的微生物，此研究不僅為低豐度物種的培養(yǎng)提供了借鑒思路，同時(shí)明確了不同抗生素用于腸道細(xì)菌培養(yǎng)可獲得的具體菌種。臨床微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)膽汁提取物、伊紅、亞甲基藍(lán)、檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉等物質(zhì)同抗生素一樣也有助于較低豐度腸道細(xì)菌的分離[23]。Lagier 團(tuán)隊(duì)采用直徑為0.2～5 μm 不等的無(wú)菌濾膜過(guò)濾樣品中的主要菌群，通過(guò)在培養(yǎng)基加入大腸桿菌的特異性噬菌體T1 和T4 降低糞便中易培養(yǎng)的大腸桿菌含量，這兩種方法的使用極大的提高了低豐度細(xì)菌的首次培養(yǎng)[16]。另一些技術(shù)包括對(duì)樣品不斷的稀釋來(lái)培養(yǎng)少數(shù)菌群，也稱為“稀釋到滅絕”技術(shù)，或使用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在一定程度上也能阻止優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)[24-25]。以上所用方法均是為了培養(yǎng)腸道中豐度較低或者在存活競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)的菌群，這些條件的使用有效避免了與傳統(tǒng)商業(yè)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的相同菌群，加快了腸道中一些低豐度新菌種的分離。

血培養(yǎng)瓶預(yù)培養(yǎng)是培養(yǎng)難培養(yǎng)微生物的另一個(gè)重要手段，通過(guò)此方法分離的新菌種達(dá)56%[19]。預(yù)培養(yǎng)可以將樣品中一些不易存活的菌種給予適宜條件使之生長(zhǎng)起來(lái)再進(jìn)行分離。Lagier 等[10，26]在將樣品接種到不同的瓊脂培養(yǎng)基之前，將糞便預(yù)先在有氧及厭氧血培養(yǎng)瓶中預(yù)培養(yǎng)1，5，10，14，21，26，30 d，采用此方法培養(yǎng)獲得了50 種新細(xì)菌。培養(yǎng)腸道細(xì)菌常用的是在培養(yǎng)基中加入綿羊血，還可依據(jù)樣品特點(diǎn)加入不同生長(zhǎng)因子。研究人員在培養(yǎng)環(huán)境微生物時(shí)盡量讓培養(yǎng)條件接近自然環(huán)境，分離發(fā)酵乳中的乳酸菌時(shí)會(huì)在培養(yǎng)基中加入無(wú)菌酸馬奶上清液，目的也是為了更接近細(xì)菌的原始生存環(huán)境[27]。故為了模擬腸道環(huán)境，在培養(yǎng)基中加入經(jīng)0.2 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾后的糞便上清，促進(jìn)了腸道中古細(xì)菌和厭氧菌的生長(zhǎng)，Goodman等[11]通過(guò)此方法極大提高了培養(yǎng)糞便樣品中細(xì)菌的效率。此外，還可在培養(yǎng)基中加入無(wú)菌瘤胃液、動(dòng)物組織液、脂類物質(zhì)和抗壞血酸或者是幾種促生長(zhǎng)物質(zhì)的混合物，這些方法實(shí)現(xiàn)了許多難培養(yǎng)微生物的體外培養(yǎng)[16]。研究表明，添加瘤胃液可分離的新菌種占40%，添加綿羊血可分離的新菌種占25%，加上血培養(yǎng)瓶預(yù)培養(yǎng)的方法被認(rèn)為是3個(gè)分離新細(xì)菌所必須的策略[19]。培養(yǎng)方法復(fù)雜多樣，且數(shù)量過(guò)多，嚴(yán)重限制了培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展，研究者需要不斷對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行歸類以減少數(shù)量，在培養(yǎng)腸道細(xì)菌時(shí)可以按照營(yíng)養(yǎng)豐富、寡營(yíng)養(yǎng)、特殊營(yíng)養(yǎng)以及不同菌種對(duì)不同物質(zhì)的耐受性（酸、鹽、乙醇和熱等）幾大類型來(lái)設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件，最終使培養(yǎng)組學(xué)更易操作，更加高效。

1.3 MALDI-TOF MS 用于微生物鑒定

最初微生物鑒定采用表型鑒定的方法，雖然鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但操作繁瑣，所花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，需要耗費(fèi)大量的人力、物力。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA 基因擴(kuò)增和測(cè)序成為細(xì)菌鑒定的黃金標(biāo)準(zhǔn)，特別是在沒(méi)有光譜的情況下[28]。然而采用分子手段鑒定細(xì)菌至少需要24 h，這種方法既耗時(shí)又昂貴，限制了它在高通量培養(yǎng)組學(xué)中的應(yīng)用。MALDI-TOF MS 在1980年發(fā)展起來(lái)，通過(guò)將細(xì)菌特定的蛋白質(zhì)質(zhì)譜與參考庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而確定菌株所屬的種屬，近年來(lái)這種依靠細(xì)菌本身特定生物標(biāo)記物來(lái)識(shí)別細(xì)菌逐漸成為鑒定的方法之一[29-30]。除了有較高的準(zhǔn)確性外，它最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠在很短時(shí)間內(nèi)完成細(xì)菌鑒定，具有操作簡(jiǎn)便、鑒定迅速、準(zhǔn)確率高和成本低的特點(diǎn)，尤其在價(jià)格上比16S rRNA 基因鑒定便宜100 倍。培養(yǎng)組學(xué)得以迅速發(fā)展很大原因基于MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)的支持。2009年，研究表明MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定細(xì)菌的正確率為95.4%，其中有84.1%可以鑒定到種水平，11.3%可以鑒定到屬水平[31]。該質(zhì)譜鑒定方法有效節(jié)省了時(shí)間和成本，鑒定結(jié)果的重復(fù)性較好，使得MALDI-TOF 質(zhì)譜成為培養(yǎng)組學(xué)中細(xì)菌鑒定的有效方法。如果沒(méi)有快速鑒定細(xì)菌的技術(shù)，培養(yǎng)組學(xué)獲得成千上萬(wàn)菌落的鑒定，對(duì)于時(shí)間、成本和人工都是巨大考驗(yàn)，這一突破使設(shè)計(jì)復(fù)雜培養(yǎng)方法、探索人類腸道微生態(tài)系統(tǒng)成為可能[32]。

2 培養(yǎng)組學(xué)在人體腸道微生物研究中的應(yīng)用

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)的增加

近10年，隨著宏基因組學(xué)在微生物研究中的應(yīng)用，人類對(duì)腸道微生物區(qū)系的認(rèn)識(shí)似乎已經(jīng)到了平臺(tái)期，隨著培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展，腸道中的一些“暗物質(zhì)”逐漸被揭開。一些通過(guò)分子手段鑒定不到的“Unclassified”逐漸被培養(yǎng)鑒定，不斷有新培養(yǎng)得到的細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)被收入人類腸道細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2018年，通過(guò)培養(yǎng)方式首次分離得到的菌種已經(jīng)由2015年統(tǒng)計(jì)的2 172 種增加到2 776 種，所增加的604 種細(xì)菌中，有372 種分離自腸道[6，33]。Lagier 等[3]在2012年首次采用培養(yǎng)組學(xué)分離鑒定到174 個(gè)以前在人類腸道中從未培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌，并對(duì)其中31 個(gè)新細(xì)菌的基因組測(cè)序，產(chǎn)生了約1 萬(wàn)個(gè)新的未知基因，這不僅擴(kuò)充了細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)有助于細(xì)菌基因功能的深入發(fā)掘。該團(tuán)隊(duì)從2012年到2015年共發(fā)現(xiàn)新種121種，其中有91 種是通過(guò)培養(yǎng)得到，占比達(dá)75%。假設(shè)細(xì)菌與最接近它的標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性小于98.65%則被定義為疑似新種，那么使用培養(yǎng)方法每周就能確定1～25 個(gè)疑似新種[16，32]。到2017年，該團(tuán)隊(duì)共從人體中分離培養(yǎng)出329 個(gè)新細(xì)菌，使已知的人類細(xì)菌庫(kù)增加了29%，且首次從人體內(nèi)分離到4 種古生菌，其中包括2 個(gè)新菌種。通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)增加人類微生物資源庫(kù)，有助于研究人員從發(fā)現(xiàn)的新細(xì)菌中開發(fā)安全有效的適用于人體的益生菌[34]。人體腸道細(xì)菌參考基因組對(duì)于分析細(xì)菌基因功能十分重要，華大基因Zou 等[35]收集了來(lái)自健康人糞便中分離出的6 000 多個(gè)細(xì)菌中產(chǎn)生的基因組數(shù)據(jù)，并將其命名為可培養(yǎng)基因組參考集（Culturable genome reference），這是一個(gè)由1 520 個(gè)非冗余的、高質(zhì)量的基因組草圖組成的集合，覆蓋人類腸道所有主要細(xì)菌門和屬，其中還包括了264 個(gè)現(xiàn)有參考基因組目錄中沒(méi)有的基因組。可培養(yǎng)參考基因組數(shù)量的增加很大程度依賴于高通量的微生物培養(yǎng)，增加的數(shù)量越多使測(cè)序獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的速度越快，同時(shí)也提高了對(duì)人體腸道微生物基因組的分辨率，進(jìn)而能更加準(zhǔn)確剖析單個(gè)菌株的基因功能?？膳囵B(yǎng)基因組參考集的建立，極大的推動(dòng)了基因組學(xué)在腸道微生物中的應(yīng)用。

2.2 與人體腸道細(xì)菌療法相關(guān)菌群的培養(yǎng)

結(jié)合宏基因組分析結(jié)果，目前發(fā)現(xiàn)的一些可能涉及到定植、急性或慢性感染的微生物被培養(yǎng)的比例很低[34]。雖然測(cè)序能認(rèn)識(shí)到復(fù)雜的腸道微生態(tài)，卻不能明確微生物在宿主中發(fā)揮作用的機(jī)制，也無(wú)法拿到單菌株做驗(yàn)證試驗(yàn)。培養(yǎng)組學(xué)通過(guò)培養(yǎng)健康與患病個(gè)體腸道中的差異生物標(biāo)志物，獲得細(xì)菌活體樣本，進(jìn)而深入剖析細(xì)菌與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系機(jī)制[32]。

腸道微生物區(qū)系的一個(gè)主要功能是提供抗定殖能力，其中病原體細(xì)菌被抑制或控制在感染水平以下。糞菌移植（FMT）已被廣泛用于治療由于致病或條件致病微生物過(guò)多而引起的胃腸道疾病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等[36-37]。這得益于腦腸軸的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT 還被證實(shí)可以有效緩解自閉癥[38]。而目前此方法仍存在很多問(wèn)題，糞便捐獻(xiàn)者在捐贈(zèng)糞便過(guò)程中可能將自身一些潛在致病菌傳染給被移植者，這是治療中很難避免的問(wèn)題。一些腸道細(xì)菌與結(jié)直腸癌或肥胖相關(guān)[39-40]，據(jù)報(bào)道，F(xiàn)MT 治療后患者體重指數(shù)無(wú)故增加了8.5 個(gè)點(diǎn)[41]。人們希望確切地知道在治療過(guò)程中具體有哪些細(xì)菌被轉(zhuǎn)移給了患者。通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)可以獲得健康人與患者腸道的關(guān)鍵差異細(xì)菌群，服用混合菌的方式有效避免了患者受捐贈(zèng)者帶來(lái)的潛在致病菌的影響。艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile）是由于患者在服用抗生素后，導(dǎo)致腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)從輕度腹瀉到偽膜性結(jié)腸炎的腸道疾病，該病具有高發(fā)病率、高致死率，老年人易患此類疾病。目前比較有效的治療方式是通過(guò)FMT 來(lái)抑制腸道中艱難梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)[42-43]，Amrane 等[44]通過(guò)對(duì)糞便捐贈(zèng)者與艱難梭狀芽孢桿菌感染者的糞便進(jìn)行培養(yǎng)，得到了3 株已經(jīng)被證明可以有效抑制艱難梭狀芽孢桿菌感染的細(xì)菌。Ghimire 等[45]通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)分離得到102 種細(xì)菌，采用共培養(yǎng)法篩選出66 種對(duì)艱難梭狀芽孢桿菌有抑制作用的菌株，并依據(jù)表型數(shù)據(jù)（生長(zhǎng)速率，短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，甘露醇、山梨醇或琥珀酸的利用） 選取66 種細(xì)菌中的部分菌株組成256 種組合，用以評(píng)估對(duì)艱難梭狀芽孢桿菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)菌種組成和比例對(duì)抑制效果都有影響，必須深入研究混合物中細(xì)菌之間以及其與宿主之間的相互作用，才能研制出有效抑制艱難梭狀芽孢桿菌的細(xì)菌混合制劑。無(wú)論是研究細(xì)菌表型還是獲得不同細(xì)菌的混合物都依賴于培養(yǎng)，此外培養(yǎng)物還可提供用于體外實(shí)驗(yàn)的菌株，并通過(guò)動(dòng)物模型確認(rèn)特定細(xì)菌在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用?？傊?，加快培養(yǎng)腸道中難培養(yǎng)的細(xì)菌，積極開展臨床治療試驗(yàn)，是細(xì)菌療法治愈與人體腸道微生物相關(guān)疾病的關(guān)鍵。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

培養(yǎng)組學(xué)的研究主要是基于培養(yǎng)方法的摸索，雖然菌落的鑒定已經(jīng)有MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)助力，但復(fù)雜策略培養(yǎng)得到的大量菌落的選取仍帶來(lái)很大工作量，與宏基因組測(cè)序技術(shù)相比，此研究確實(shí)是既耗費(fèi)人工又耗費(fèi)金錢的一項(xiàng)工作，但它仍是值得的。對(duì)于探明人體腸道微生物區(qū)系，明確疾病與腸道菌群的內(nèi)在關(guān)系，以及新型益生菌的開發(fā)都具有重要作用，培養(yǎng)組學(xué)是未來(lái)腸道微生物研究的發(fā)展方向。