張亞麗,高海琴

(山西省太原市中心醫(yī)院,山西 太原 030009)

1 材料和方法

1.1 材料及試劑 80例腎癌組織和相應(yīng)的癌旁組織(距癌組織≥1 cm)樣本均取自我院2014年1月至2016年1月收治的手術(shù)患者,并經(jīng)病理診斷證實。腎癌患者中男57例,女23例;平均年齡(55.3±5.5)歲;根據(jù)2009年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]分類,Ⅰ期17例,Ⅱ期22例,Ⅲ期26例,Ⅳ期15例。Fuhrman分級[8]:1級35例,2級37例,3級8例。采用定期復(fù)查和電話相結(jié)合的方式隨訪3年且隨訪資料完整。統(tǒng)計患者的總生存期(OS)。OS定義為患者從病理學(xué)確診日期開始至死亡或末次隨訪日期。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:TYZZYY〔2014〕1802),患者及家屬均知情同意。

人腎癌786-O細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。慢病毒包裝的ANXA7和表皮生長因子受體(EGFR)過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒p HRi-ANXA7、p HRi-EGFR和短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒p HRi-sh-ANXA7均購自上海吉瑪有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司;Lipofectamine-3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Vector公司;Trizol試劑盒購自Ta KaRa公司;凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司;免疫共沉淀試劑盒Anti-HA Immunopreci-pitation Kit購自Sigma公司;Western Blot試劑盒購自美國BD公司;小鼠多克隆抗體Anti-Annexin-7、兔多克隆抗體Anti-EGFR均購自美國Abcam公司。

1.2 RT-qPCR檢測腎癌組織中ANXA7的表達(dá) 依據(jù)Trizol法提取各組樣本的總RNA,使用引物如下:ANXA7(FP:5＇-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3＇,RP:5＇-TGTAGCCATGTAGTTGAGGTCA-3＇)。反 應(yīng) 條件:75℃預(yù)變性,2 min,進(jìn)入以下循環(huán):90℃變性,5 min;60℃退火,60 s;72℃延伸,30 s;共40個循環(huán)。相對表達(dá)量用2-CT表示。每個樣本獨立重復(fù)實驗3次。

1.3 免疫組化檢測腎癌組織中ANXA7的表達(dá) 組織切片常規(guī)脫蠟和水化后置于PBS緩沖液中高壓修復(fù),然后用3%過氧化氫室溫下浸泡以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,封閉,分別加稀釋好的一抗4℃過夜孵育,次日復(fù)溫后PBS洗滌干凈,分別加稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,PBS洗滌。加適量DAB孵育5 min,去離子水終止反應(yīng),蘇木素復(fù)染5 min,無菌水沖洗后,依次用不同濃度梯度的乙醇脫水2 h,無菌濾紙吸凈表面殘存液體,使用二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察組織形態(tài)并拍攝。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色顆粒判斷為ANXA7陽性染色細(xì)胞,每張切片隨機(jī)選取5個視野,計算細(xì)胞陽性率后取平均值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人腎癌786-O細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),每2日換液1次,匯合率達(dá)90%左右傳代。取對數(shù)生長期髓核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,采用Lipofectamine 3000通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將慢病毒包裝的ANXA7、sh-ANXA7和EGFR質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 3000試劑說明書操作。細(xì)胞分為Control組(未轉(zhuǎn)染)、NC組(轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)?？蛰d)、ANXA7組(轉(zhuǎn)染p HRi-ANXA7)、sh-ANXA7組(轉(zhuǎn)染p HRi sh-ANXA7)、EGFR組(轉(zhuǎn)染p HRi-EGFR)、ANXA7＋EGFR 組(轉(zhuǎn)染p HRi-ANXA7和p HRi-EGFR)、sh-ANXA7＋EGFR組(轉(zhuǎn)染p HRi sh-ANXA7和p HRi-EGFR)。

1.5 平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)48 h,胰蛋白酶消化各組細(xì)胞并按每孔5×103個密度鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng),隔周更換新鮮培養(yǎng)液,2周后用考馬斯亮藍(lán)染色,以大于30個細(xì)胞的克隆記為一個菌落,在顯微鏡下觀察并拍照記錄菌落形成數(shù)量,每組設(shè)3個復(fù)孔,重復(fù)實驗3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測腎癌細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化各組細(xì)胞,用預(yù)冷的1×PBS清洗2次,buffer緩沖液重懸并輕柔吹打混勻,調(diào)整各組細(xì)胞量約為1×105個,加入Annexin V-FITC 5μL混勻后,再加入PI 5μL,室溫下靜置15 min后,用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 免疫共沉淀檢測ANXA7與EGFR的相互作用用1×PBS清洗細(xì)胞,加入裂解液于冰上裂解蛋白,將裂解液分為正向免疫沉淀和反向免疫沉淀兩組,分別加入ANXA7抗體和EGFR抗體,4℃孵育過夜;按照試劑盒說明書將HA瓊脂糖beads加入上述孵育好的裂解液中,4℃振蕩孵育1 h后,離心收集瓊脂糖beads,棄上清,并用1 m L裂解緩沖液清洗3次,Western Blot分析結(jié)果。

1.8 Western Blot檢測PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá) 分別收集各組樣本,用裂解液裂解組織及細(xì)胞,提取總蛋白并測定蛋白濃度。制備蛋白樣品并上樣、電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,加含有5%BSA的封閉液室溫下封閉2 h。加入適宜濃度一抗,4℃封閉過夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次,加入二抗,室溫孵育1 h后,加入顯色液曝光顯影。

由于當(dāng)天云層非常厚，而村落中高高的屋檐下光線比較昏暗。在這種光線下拍攝，我換上了大光圈定焦鏡頭將光圈開到最大，此時快門速度依舊無法達(dá)到安全范圍。好在松下G9相機(jī)機(jī)內(nèi)搭載了5軸防抖技術(shù)，可以提供相當(dāng)于6.5擋的快門速度補(bǔ)償，與鏡頭光學(xué)防抖相互匹配，即便在邊走邊拍的手持拍攝情境下，依然可以得到清晰的圖像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗,Kaplan-Meier法繪制生存曲線,用Log-rank檢驗比較組間生存率。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANXA7在腎癌組織中的表達(dá) 采用RT-qPCR對腎癌組織及其癌旁組織中ANXA7 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測,免疫組化檢測ANXA7蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖1(見本期第125頁)所示,與癌旁組織相比,腎癌組織中ANXA7的mRNA表達(dá)量明顯下降(P＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示,ANXA7在腎癌組織中以陰性表達(dá)為主,而在癌旁組織中以陽性表達(dá)為主。在腎癌組織中ANXA7陽性表達(dá)率為31.25%(25/80),顯著低于癌旁組織的80.00%(64/80),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 ANXA7在腎癌組織中的表達(dá)

2.2 ANXA7蛋白與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系A(chǔ)NXA7蛋白的表達(dá)在不同年齡、性別和不同腫瘤大小的患者組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而在不同F(xiàn)uhrman分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期的患者癌組織中表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 ANXA7的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析(n＝80)

2.3 ANXA7蛋白與腎癌患者預(yù)后生存分析 Kaplan-Meier生存分析顯示,ANXA7陽性表達(dá)組生存率為80.00%(20/25),陰性表達(dá)組生存率為50.91%(28/55),陽性表達(dá)組生存率高于陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2(見本期第125頁)。

圖2 ANXA7表達(dá)與腎癌患者預(yù)后生存分析

2.4 平板克隆實驗檢測ANXA7對786-O細(xì)胞增殖的影響 平板克隆實驗結(jié)果如圖3(見本期第125頁)所示,過表達(dá)ANXA7后,與NC組相比,ANXA7組細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少(P＜0.05);敲低ANXA7后,與NC組相比,sh-ANXA7組細(xì)胞克隆數(shù)明顯增多(P＜0.05),提示ANXA7能夠抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖。

圖3 ANXA7的表達(dá)對786-O細(xì)胞增殖能力的影響

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測ANXA7對786-O細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖4(見本期第125頁)所示,過表達(dá)ANXA7后,與NC組相比,ANXA7組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05);敲低ANXA7后,與NC組相比,sh-ANXA7組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.05),提示ANXA7能夠促進(jìn)腎癌786-O細(xì)胞的凋亡。

圖4 ANXA7的表達(dá)對786-O細(xì)胞凋亡的影響

2.6 ANXA7與EGFR的相互作用關(guān)系 通過GENEMANIA網(wǎng)站預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),ANXA7與EGFR存在相互作用關(guān)系,分別用ANXA7和EGFR抗體進(jìn)行正向和反向免疫共沉淀實驗,結(jié)果如圖5所示,EGFR蛋白能與含ANXA7的抗體磁珠結(jié)合;相反,ANXA7蛋白也能與含EGFR的抗體磁珠結(jié)合,表明兩者在腎癌786-O細(xì)胞中存在結(jié)合作用。

圖5 ANXA7相互作用于EGFR

2.7 ANXA7經(jīng)EGFR參與對PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié) Western Blot檢測結(jié)果如圖6所示,與NC組相比,過表達(dá)EGFR后,786-O細(xì)胞中PI3K和P-AKT表達(dá)升高(P＜0.05);EGFR與ANXA7共表達(dá)后,細(xì)胞比僅表達(dá)EGFR的細(xì)胞PI3K和P-AKT表達(dá)水平降低(P＜0.05);相反,在EGFR表達(dá)的基礎(chǔ)上抑制ANXA7的表達(dá),會進(jìn)一步升高PI3K和P-AKT的表達(dá),表明ANXA7可通過EGFR抑制PI3K/AKT細(xì)胞信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

圖6 EGFR和ANXA7的表達(dá)對PI3K/AKT信號通路蛋白的影響

3 討論

目前,多數(shù)類型的腎癌由于其多重耐藥性,對放療和化療均不敏感[9],而現(xiàn)有的治療手段較難獲得良好的治療效果,因此研究腎癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制,尋找有效的分子靶點成為近年來研究的重點。

ANXA7編碼基因位于人類染色體10q21,是膜聯(lián)蛋白家族中的一員[10]。研究表明,ANXA7作為一種腫瘤抑制因子,其表達(dá)水平下調(diào)與多種腫瘤的惡性程度、侵襲能力及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力等密切相關(guān)[11-13],可能成為進(jìn)一步探索腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究通過對腎癌患者癌組織及其癌旁組織進(jìn)行RT-qPCR和免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比,ANXA7在腎癌組織中陽性表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。將ANXA7蛋白表達(dá)情況與我院80例腎癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ANXA7的表達(dá)與不同F(xiàn)uhrman分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期均顯著相關(guān)(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明,ANXA7陽性表達(dá)組生存率顯著高于陰性表達(dá)組,提示ANXA7的陽性表達(dá)能夠抑制腎癌的發(fā)展,提高腎癌患者的生存率。

ANXA7的低表達(dá)可在腫瘤細(xì)胞中通過影響細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達(dá),造成基因組不穩(wěn)定,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[14-15]。本研究分別在腎癌786-O細(xì)胞中過表達(dá)和敲低ANXA7的表達(dá),通過克隆形成實驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測ANXA7對786-O細(xì)胞增殖和凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ANXA7能明顯抑制786-O細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而敲低ANXA7則得到相反的結(jié)果,表明ANXA7可能通過抑制癌細(xì)胞增殖,甚至促進(jìn)其凋亡而抑制腎癌的發(fā)展。

EGFR是細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體,具有酪氨酸激酶活性,當(dāng)與配體表皮生長因子結(jié)合,可使酪氨酸殘基磷酸化,激活EGFR[16],EGFR二聚化后激活Ras蛋白,產(chǎn)生磷酸化級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而激活PI3 K/AKT信號通路,使腫瘤細(xì)胞無法啟動程序性死亡,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制凋亡[17]。MAULE等[18]研究發(fā)現(xiàn),ANXA7能夠通過下調(diào)EGFR的活化,進(jìn)而抑制PI3 K信號通路的活化,從而負(fù)向調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)展。NAIR[19]等研究表明ANXA7的缺失會激活EGFR信號而促進(jìn)致癌性,而恢復(fù)ANXA7的表達(dá)會降低EGFR水平,激活下游通路,降低致癌性。本研究首先通過GENEMANIA網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)ANXA7與EGFR存在相互作用,并通過正向和反向免疫共沉淀驗證ANXA7與EGFR在786-O細(xì)胞內(nèi)能相互結(jié)合,表明ANXA7與EGFR存在相互作用關(guān)系。通過Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)EGFR在腎癌中能激活PI3K/AKT信號通路,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了ANXA7是否通過EGFR參與對PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示在EGFR存在的情況下,過表達(dá)ANXA7能夠抑制PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá),而敲低ANXA7能夠進(jìn)一步促進(jìn)PI3K的表達(dá)及AKT的磷酸化,提示ANXA7在腎癌中能夠通過抑制EGFR的表達(dá)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路,進(jìn)一步實現(xiàn)對腎癌的抑制作用。

綜上所述,ANXA7的陽性表達(dá)有利于延長腎癌患者的生存期,并初步探討了其對腎癌影響的分子機(jī)制,為腎癌的研究找到新的分子靶點。后續(xù)研究將對EGFR進(jìn)行干預(yù),深入研究ANXA7與EGFR的作用關(guān)系,以期為腎癌的臨床治療提供更有效的理論依據(jù)。