祝雪麗 熊尚全 陳懷宇 褚劍鋒 吳翔 何紹吾 李瑋

摘要 目的：研究丹參飲通過(guò)介導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體γ（PPAR-γ）/肝X受體α（LXR-α）/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）信號(hào)通路減輕大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。方法：選取無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)40只健康Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為空白組、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組（對(duì)照組）、丹參飲低劑量觀察組（低劑量組）和丹參飲高劑量觀察組（高劑量組），比較各組大鼠的炎癥介質(zhì)水平、ICAM-1水平、脂代謝水平、PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。結(jié)果：對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的TG、TC和LDL-C均低于對(duì)照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05），但4組的HDL-C表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05）;對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)均高于空白組（P<0.05），且低劑量組和高劑量組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），高劑量組明顯高于低劑量組（P<0.05）。結(jié)論：丹參飲可以通過(guò)對(duì)PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號(hào)通路的介導(dǎo)，發(fā)揮出抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

關(guān)鍵詞 丹參飲;冠狀動(dòng)脈粥樣硬化;過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體γ;肝X受體α;三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1;丹參;檀香;砂仁;冠心病預(yù)防

Abstract Objective：To study on Danshen Drink by mediating peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPAR-γ）/liver X receptor α（LXR-α）/adenosine triphosphate binding cassette transporter A1（ABCA1） signaling pathway to alleviate the mechanism of coronary atherosclerosis of rats.Methods：A total of 40 healthy Wistar rats of SPF-free grade were selected as the experimental animals，and were randomly divided into a blank group，a coronary atherosclerosis group（control group），Danshen Drink low-dose treatment group（low-dose group） and Danshen Drink high Dose treatment group（high-dose group）.The levels of inflammatory mediators，ICAM-1，lipid metabolism，PPAR-γ，LXR-α and ABCA1 mRNA expression and protein expression in each group of rats were compared.Results：The triacylglycerol（TG），cholesterol（TC），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C） and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） of the control group，low-dose group and high-dose group were all higher than those of the blank group（P<0.05），the TG，TC and LDL-C of the low-dose group and the high-dose group were lower than those of the control group（P<0.05），and the high-dose group was lower than the low-dose group（P<0.05），but there was no statistically significant difference in the HDL-C expression of 4 groups（P>0.05）; the expressions of inflammatory mediators and ICAM-1 in the control group，low-dose group and high-dose group were higher than those in the blank group（P<0.05），low-dose group and high-dose group The expressions of inflammatory mediators and ICAM-1 in the control group were lower than those in the control group（P<0.05）.The protein expressions of PPAR-γ、LXR-α and ABCA1 mRNA were higher than those of the blank group（P<0.05）.And the low-dose and high-dose groups were significantly higher than those of the control group（P<0.05），and the high-dose group was significantly higher than the low-dose group（P<0.05）.Conclusion：Danshen Drink can play an anti-coronary atherosclerosis effect by mediating the PPAR-γ-LXR-α-ABCA1 signaling pathway.

Keywords Danshen Drink; Coronary atherosclerosis; PPAR-γ; ABCA1; LXR-α; Radix Salviae Miltiorrhizae; Lignum Santali Albi; Fructus Amomi Villosi; Prevention of coronary heart disease

中圖分類號(hào)：R289.5;R541.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.010

冠狀動(dòng)脈是動(dòng)脈粥樣硬化的主要累及血管，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)管腔閉塞或破裂、出血，增加了患者的心血管疾病發(fā)生率，威脅到了患者的身體健康[1-3]。近年來(lái)，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體γ（PPAR-γ）/肝X受體α（LXR-α）/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）信號(hào)通路與機(jī)體的動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[4]。其中PPAR-γ的活化可以減少機(jī)體內(nèi)趨化因子受體的表達(dá)，從而減少了斑塊周圍產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮出了對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用[5-6]?；诖耍狙芯康嬐ㄟ^(guò)介導(dǎo)PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號(hào)通路減輕大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

本研究于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司內(nèi)購(gòu)進(jìn)了40只無(wú)特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)健康Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為250～310 g，平均體質(zhì)量為（283.55±34.48）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（閩）：2016-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心環(huán)境衛(wèi)生清潔符合標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照要求進(jìn)行喂食，控制溫度（24±2）℃，濕度控制在50%左右。

1.1.2 藥物

丹參飲（丹參30 g、檀香4.5 g、砂仁4.5 g），購(gòu)進(jìn)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房，浸泡30 min后，按照W/V=1/8的比例加水煎煮2次（檀香后下），藥液經(jīng)1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min后去除雜質(zhì)，將其濃縮為含生藥量1 g/mL。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：PPAR-γ（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SC-7273）;LXR-α（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：sc-377360）;ABCA1（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：sc-58219）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號(hào)：c-23169）;羊抗鼠IgG（北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號(hào)：c-33365）;羊抗兔IgG（北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號(hào)：c-50243）;RIPA裂解液（北京康為世紀(jì)生物有限公司，貨號(hào)：ps0013）;Trizon（北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號(hào)：39es50）;BCA試劑盒（北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號(hào)：c-44123）。

儀器：小動(dòng)物呼吸機(jī)（北京北瑞未來(lái)科技公司，型號(hào)：DW-3000B）;高速小型臺(tái)式離心機(jī)（上海貝曼生物科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：1-13型）;Realtime-PCR儀（ABI公司，美國(guó)，型號(hào)：7900型）;水平電泳槽（山東鑫貝西科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DYCP-31DN型）;電泳儀（北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心，型號(hào)：170-3920型）;電轉(zhuǎn)儀及附件（伯樂(lè)BIO-RAD公司，美國(guó)，型號(hào)：170-3930型）;NC膜Whatman硝酸纖維素膜（上海柏絲特生物公司，型號(hào)：10401396）;濾紙（沃特曼Whatman公司，英國(guó)，型號(hào)：3MMCHR型）;高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司，型號(hào)：1260Ⅱ型）;微量加樣槍（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：3114）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

所有SD大鼠自由飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)將其分為空白組、對(duì)照組和觀察組，空白組10只喂飼普通飼料，對(duì)照組10只和觀察組20只喂飼高脂飼料，每日高脂飼料（膽固醇：豬油：丙硫氧嘧啶：基礎(chǔ)飼料=4∶10∶0.2∶86的比例配制）喂養(yǎng)，并灌胃脂肪乳劑10 mL/（kg·d），脂肪乳劑配制方法：將豬油20 g融化后，加入10 g膽固醇、2 g膽酸鈉，攪勻后加入20 mL吐溫，蒸餾水加至100 mL充分混勻，使用時(shí)使用37 ℃水浴融化，連續(xù)喂養(yǎng)6周。

1.2.2 給藥方法

觀察組及對(duì)照組在喂食開(kāi)始時(shí)一次性腹腔注射維生素D60萬(wàn)IU/kg，觀察組分為低劑量組和高劑量組各10只。按大鼠與人的體質(zhì)量及體表面積比值換算公式得到大鼠每天灌胃7.74 g/（kg·d），其中低劑量組在高脂飼料基礎(chǔ)上添加濃縮液一半的劑量（計(jì)算量=0.5×7.74 g/（kg·d）×大鼠的體質(zhì)量）灌胃治療，1次/d，于中午喂食，高劑量組在高脂飼料基礎(chǔ)上添加全部濃縮液的劑量（計(jì)算量=7.74 g/（kg·d）×大鼠的體質(zhì)量）灌胃治療，1次/d，于中午喂食。所有大鼠均飼養(yǎng)6周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）經(jīng)大鼠尾靜脈取空腹血液標(biāo)本，使用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)大鼠的脂代謝指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。2）采用脊柱脫臼法處死大鼠，在冰浴條件下纖維操作分離冠狀動(dòng)脈標(biāo)本，采用PCR法和Western Blotting法檢測(cè)大鼠的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、核因子κB和黏附因子（ICAM-1）的表達(dá)情況。3）采用熒光定量PCR法對(duì)大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，按照Tirzol試劑盒的相關(guān)操作說(shuō)明提取總RNA，同時(shí)按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，于95 ℃的條件下預(yù)變性10 min，隨后在95 ℃條件下15 s，60 ℃條件下60 s反復(fù)循環(huán)40次。4）采用Western Blotting法對(duì)大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，取大鼠主動(dòng)脈血管，使用液氮研磨后將0.5 mL的RIPA裂解液加入，并進(jìn)行逆超聲破碎，離心取上清后采用BCA法對(duì)蛋白水平進(jìn)行測(cè)定。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多組間計(jì)量資料使用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的脂代謝水平比較

對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的TG、TC、HDL-C和LDL-C均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的TG、TC和LDL-C均低于對(duì)照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05），但各組的HDL-C表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 各組大鼠的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)比較

對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 各組大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達(dá)比較

對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達(dá)均高于空白組（P<0.05），且低劑量組和高劑量組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），高劑量組明顯高于低劑量組（P<0.05）。見(jiàn)表4。

2.4 各組大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表達(dá)比較

對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表達(dá)均高于空白組（P<0.05），且低劑量組和高劑量組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），高劑量組明顯高于低劑量組（P<0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化作為心腦血管疾病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，其與機(jī)體的血脂異常密切相關(guān)，合理的使用降脂藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療具有積極作用[7-9]。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ與LXR-α均屬于和轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，在機(jī)體的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮出了重要的作用，同時(shí)也是目前高血脂藥物的治療新靶點(diǎn)[10-14]。丹參作為一種傳統(tǒng)中藥，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等功效[15-17]。有報(bào)道指出，丹參中具有多種抗氧化活性成分，其與山楂等中藥是目前臨床中心血管疾病的常用預(yù)防和治療藥物，并發(fā)揮出了較好的療效[18-19]。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，丹參中的主要成分為丹參酮，而其可以通過(guò)對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改善，發(fā)揮出舒張血管的功效，可以有效調(diào)節(jié)患者的血脂水平[20]。

本研究通過(guò)對(duì)各組大鼠脂代謝表達(dá)的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的TG、TC、HDL-C和LDL-C均高于空白組，低劑量組和高劑量組的TG、TC和LDL-C均低于對(duì)照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組，但各組的HDL-C表達(dá)并無(wú)顯著差異，表明高劑量的丹參飲可以有效降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血脂表達(dá)。對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)均高于空白組，低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達(dá)均低于對(duì)照組，且高劑量組低于低劑量組，說(shuō)明丹參飲有利于降低大鼠的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)均高于空白組，且低劑量組和高劑量組明顯高于對(duì)照組，高劑量組明顯高于低劑量組，說(shuō)明丹參飲可以通過(guò)對(duì)PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號(hào)通路的介導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的治療，主要是因?yàn)榈嬛械牡⒕哂谢钛龅墓π?，藥劑中的砂仁可以通過(guò)與檀香的配伍，發(fā)揮出活血行氣、止痛通絡(luò)的功效[21]。

綜上所述，丹參飲作為一種傳統(tǒng)的中藥制劑，其可以通過(guò)對(duì)PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號(hào)通路的介導(dǎo)，發(fā)揮出抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的作用，應(yīng)在臨床廣泛應(yīng)用及推廣。

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（2021-04-28收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）