秦存梅

摘? 要：目的? 探討Xpert MTB/RIF檢測(cè)法在支氣管肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法? 選取2018年5月～2019年5月山東省棗莊市腫瘤醫(yī)院收治的150例疑似肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，以支氣管肺泡灌洗液作為病原學(xué)檢測(cè)標(biāo)本，分別以病原學(xué)診斷活動(dòng)性結(jié)核病和臨床診斷活動(dòng)性結(jié)核病為金標(biāo)準(zhǔn)，以Xpert MTB/RIF為待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，分析Xpert MTB/RIF對(duì)病原學(xué)和臨床診斷結(jié)核的診斷價(jià)值。結(jié)果? 在150例灌洗液標(biāo)本中確診肺結(jié)核130例，離心涂片抗酸染色法抗酸桿菌陽(yáng)性45例，陽(yáng)性率為34.62%;Xpert MTB/RIF檢測(cè)法抗酸桿菌陽(yáng)性57例，陽(yáng)性率為43.85%;Xpert MTB/RIF檢測(cè)法抗酸桿菌陽(yáng)性率明顯高于離心涂片抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。130例肺結(jié)核患者中，病原學(xué)診斷結(jié)核57例（43.95%），臨床診斷結(jié)核67例（51.54%）;肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核102例（78.46%），單純肺結(jié)核107例（82.31%）。Xpert MTB/RIF在病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核的敏感度分別為77%（95%CI：63%～88%）和52%（95%CI：41%～63%）（P<0.05）;肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核的敏感度為81%（95%CI：67%～89%），單純肺結(jié)核的敏感度46%（95%CI：35%～59%）;病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核、合并支氣管結(jié)核和單純肺結(jié)核特異度均為100%（95%CI：98%～100%）。Xpert MTB/RIF檢測(cè)病原學(xué)診斷結(jié)核敏感度高于臨床診斷結(jié)核，肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核敏感度高于單純肺結(jié)核（P<0.05）;支氣管肺泡灌洗液的MTB核酸檢出載量病原學(xué)診斷結(jié)核高于臨床診斷結(jié)核（P<0.05）。結(jié)論? 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中具有較高的價(jià)值和敏感性，有助于提高肺結(jié)核病因的檢出率。

關(guān)鍵詞：支氣管肺泡灌洗液;Xpert MTB/RIF檢測(cè);肺結(jié)核;診斷價(jià)值

中圖分類號(hào)：R373.9? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1009-8011（2021）-3-0014-04

Abstract： Objective? To explore the application value of Xpert MTB/RIF detection method in the detection of Mycobacterium tuberculosis in bronchoalveolar lavage fluid. Methods 150 cases of suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to Zaozhuang Cancer Hospital in Shandong Province from May 2018 to May 2019 were selected as the research objects. Bronchoalveolar lavage fluid was used as the pathogenic test specimens to diagnose active tuberculosis and clinical diagnosis respectively. Active tuberculosis is the gold standard， and Xpert MTB/RIF is used as the test standard to analyze the diagnostic value of Xpert MTB/RIF in the etiological and clinical diagnosis of tuberculosis. Results Among 150 lavage fluid specimens， 130 cases of tuberculosis were diagnosed， 45 cases were positive for acid-fast bacilli by centrifugal smear acid-fast staining， the positive rate was 34.62%; 57 cases were positive for acid-fast bacilli by Xpert MTB/RIF detection， and the positive rate was 43.85 %; The positive rate of Xpert MTB/RIF detection method of acid-fast bacilli was significantly higher than that of centrifugal smear acid-fast staining method， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Among the 130 cases of pulmonary tuberculosis， 57 cases（43.95%） were diagnosed pathogenically， 67 cases（51.54%） were diagnosed clinically; 102 cases（78.46%） of pulmonary tuberculosis complicated with bronchial tuberculosis， and 107 cases（82.31%） of simple pulmonary tuberculosis. The sensitivity of Xpert MTB/RIF in the pathogenic diagnosis and clinical diagnosis of tuberculosis was 77%（95%CI： 63%～88%） Sum 52%（95%CI： 41%～63%）（P<0.05）; the sensitivity of pulmonary tuberculosis combined with bronchial tuberculosis was 81%（95%CI：67%～89%），the sensitivity of simple tuberculosis is 46%（95%CI：35%～59%）; the specificity of pathogenic diagnosis and clinical diagnosis of tuberculosis， combined bronchial tuberculosis and simple pulmonary tuberculosis are all 100% （95%CI： 98%～100%）. Xpert MTB/RIF detection is more sensitive to the pathogenic diagnosis of tuberculosis than the clinical diagnosis of tuberculosis， and the sensitivity of pulmonary tuberculosis combined with bronchial tuberculosis is higher than that of simple pulmonary tuberculosis（P<0.05）; the detection load of MTB nucleic acid in bronchoalveolar lavage fluid is higher In the clinical diagnosis of tuberculosis（P<0.05）. Conclusion Xpert MTB/RIF detection of bronchoalveolar lavage fluid has high value and sensitivity in the diagnosis of pulmonary tuberculosis， which helps to improve the detection rate of the cause of pulmonary tuberculosis.

Keywords： bronchoalveolar lavage fluid; Xpert MTB/RIF detection; pulmonary tuberculosis; diagnostic value

結(jié)核病由于細(xì)菌數(shù)量少等原因，往往難以獲得陽(yáng)性結(jié)果，臨床上常對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷。研究資料顯示[1]，結(jié)核病病原學(xué)診斷準(zhǔn)確率不到40%，對(duì)于疑似結(jié)核患者涂片陽(yáng)性率更低。在我國(guó)近期頒布的結(jié)核病診斷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，分子生物學(xué)方法也被作為病原學(xué)診斷的依據(jù)之一。因此，尋找新的分子生物學(xué)方法并評(píng)價(jià)其在我國(guó)結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于提高臨床診斷結(jié)核病檢測(cè)的敏感性具有重要意義。Xpert MTB/RIF方法是一種基于全自動(dòng)實(shí)時(shí)半巢式核酸擴(kuò)增為主的技術(shù)，主要用于結(jié)核病的快速檢測(cè)和利福平耐藥性的同時(shí)檢測(cè)[2]?；诖?，本文選取2018年5月～2019年5月我院收治的150例疑似肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，旨在探討Xpert MTB/RIF檢測(cè)法在支氣管肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

選取2018年5月～2019年5月山東省棗莊市腫瘤醫(yī)院收治的150例疑似肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，有疑似活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，行纖維支氣管鏡檢查并留取支氣管肺泡灌洗液。其中男78例，女72例。入選的年齡在18～65歲之間，其中18～50歲31例，20～60歲50例，20～65歲69例。所有患者既往均無(wú)肺結(jié)核治療史。本研究經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者家屬均自愿簽署知情同意書。

1.2? 選取標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1? 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合病原學(xué)診斷結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)[3]：有疑似活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，涂片抗酸桿菌檢測(cè)陽(yáng)性和/或分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性且經(jīng)菌種鑒定為MTB復(fù)合群。（2）臨床診斷結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)。有疑似活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰2周，或咯血者，同時(shí)有典型的肺結(jié)核影像學(xué)改變者，免疫學(xué)檢查（結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)或γ干擾素釋放試驗(yàn)）陽(yáng)性，PPD硬結(jié)平均直徑15mm或局部出現(xiàn)水泡、壞死及淋巴管炎者，抗結(jié)核治療有效，經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病。（3）符合本文病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)：存在支氣管鏡下典型的氣管、支氣管內(nèi)膜結(jié)核病變和典型的組織病理學(xué)改變;胸部影像學(xué)檢查符合氣管、支氣管結(jié)核影像學(xué)改變。（4）符合非結(jié)核呼吸道感染性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)滿足以下條件：①存在確切的其他病原感染證據(jù)（如其他細(xì)菌、病毒、支原體感染等）;②常規(guī)抗炎治療后病情好轉(zhuǎn)或治愈;③存在呼吸系統(tǒng)感染癥狀，且除外結(jié)核病診斷;④診斷為其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病。（5）具有支氣管鏡檢查的適應(yīng)證。

1.2.2? 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）排除合并白血病、先心病等重大疾病及長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑治療者。（2）排除支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本量不足以同時(shí)完成本研究多種方式的病原學(xué)檢測(cè)，或雖行支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本采集但住院時(shí)間少于2d的患者。

1.3? 研究方法

以支氣管肺泡灌洗液作為病原學(xué)檢測(cè)標(biāo)本，以病原學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，以臨床診斷活動(dòng)性結(jié)核病和抗酸染色為相對(duì)金標(biāo)準(zhǔn)，以Xpert MTB/RIF為待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，考察支氣管肺泡灌洗液的Xpert MTB/RIF對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值。

1.3.1? 灌洗液采集

局麻后，患者取仰臥位，纖維支氣管鏡經(jīng)鼻腔進(jìn)入，檢查各部分病變情況后，在病灶部位注入適量生理鹽水，收集灌洗液。將灌洗液分為3份，分別用于離心涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF檢測(cè)。

1.3.2? 離心涂片抗酸染色法

依據(jù)《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008年版）》進(jìn)行[4]。取2mL灌洗液加入一次性試管中，在4℃下以3000r/min離心15min，棄掉上清液，混勻試管底部沉渣進(jìn)行涂片，涂布面積1cm×2cm，均勻抹成10mm×20mm的卵圓形液膜，固定后滴加石炭酸復(fù)紅染液，染色10～15min，3%鹽酸酒精脫色1min，美藍(lán)復(fù)染0.5～1.0min，流水沖洗后待干鏡檢。

1.3.3? Xpert MTB/RIF檢測(cè)

取2mL灌洗液標(biāo)本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液混合，在渦旋震蕩器上震蕩15～30s，室溫靜置15min。取混合液2mL轉(zhuǎn)移至一次性多室塑料反應(yīng)盒中，然后將反應(yīng)盒放置到檢測(cè)模塊，采用Xpert MTB/RIF檢測(cè)儀（美國(guó)Cepheid公司）進(jìn)行自動(dòng)化分析，使用試劑盒內(nèi)提供的專用無(wú)菌移液管，取2mL處理后樣本由檢測(cè)匣的加樣孔緩慢加入，關(guān)閉檢測(cè)匣的蓋子，置于檢測(cè)模塊，儀器開始自動(dòng)檢測(cè)。Xpert MTB/RIF檢測(cè)到MTB目標(biāo)DNA后，基于樣本中MTB的Ct值，間接反映所檢測(cè)樣本中MTB的載量，以高、中、低、極低來(lái)顯示。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比進(jìn)行描述，分別以病原學(xué)診斷和臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)四格表計(jì)算Xpert MTB/RIF檢測(cè)方法的診斷性參數(shù)指標(biāo)，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 離心涂片抗酸染色法與Xpert MTB/RIF檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果比較

在150例灌洗液標(biāo)本中確診肺結(jié)核130例，離心涂片抗酸染色法抗酸桿菌陽(yáng)性45例，陽(yáng)性率為34.62%;Xpert MTB/RIF檢測(cè)法抗酸桿菌陽(yáng)性57例，陽(yáng)性率為43.85%;Xpert MTB/RIF檢測(cè)法抗酸桿菌陽(yáng)性率明顯高于離心涂片抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.282，P<0.05）。見表1。

2.2? Xpert MTB/RIF在肺結(jié)核的診斷參數(shù)

病原學(xué)診斷+臨床診斷結(jié)核敏感度60%（95%CI：50%～70%），特異度100%（95%CI：97%～100%），陰性預(yù)測(cè)值81%（95%CI：78%～88%）;敏感度病原學(xué)診斷結(jié)核高于臨床診斷結(jié)核（77% vs 52%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.184，P=0.002），特異度均為100%，陰性預(yù)測(cè)值均>85%;肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核敏感度高于單純肺結(jié)核（81% vs 46%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.631，P<0.001），特異度均為100%，陰性預(yù)測(cè)值均>85%。

病原學(xué)診斷結(jié)核中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性34例，其中極低MTB載量14例（41.2%）、低載量11例（32.4%）、中等載量7例（20.6%）、高載量2例（5.9%）。臨床診斷結(jié)核中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性57例，其中極低MTB載量20例（47.6%）、低載量20例（47.6%）、中等載量2例（4.8%）。根據(jù)Xpert MTB/RIF檢測(cè)的半定量結(jié)果等級(jí)進(jìn)行比較，支氣管肺泡灌洗液的MTB核酸檢出載量病原學(xué)診斷結(jié)核高于臨床診斷結(jié)核，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.657，P=0.025）。

3? 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2015年報(bào)告，世界上每年每100萬(wàn)肺結(jié)核患者中就有14萬(wàn)死于該病。我國(guó)結(jié)核病患者數(shù)量居世界第三位，是結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。目前結(jié)核病疫情不容樂(lè)觀，給社會(huì)帶來(lái)巨大安全隱患。由于患者個(gè)體的特殊性，結(jié)核病感染時(shí)缺乏典型癥狀，疾病往往隱蔽性強(qiáng)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，加上抽痰困難，肺結(jié)核易誤診為呼吸道感染，因此早期實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病尤為重要。傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌（MTB）培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足臨床早期、快速診斷的需要，患者不能得到及時(shí)的診斷和治療，延誤治療[5]?？顾崛旧科ú荒軈^(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。同時(shí)，由于患者結(jié)核帶菌量低、標(biāo)本采集困難等特點(diǎn)，很難獲得患者結(jié)核病病原學(xué)診斷的臨床證據(jù)。因此，需要建立一種新的、更準(zhǔn)確的診斷方法以有效地提高結(jié)核病的診斷效率。

Xpert MTB/RIF檢測(cè)法是以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以利福平耐藥相關(guān)rpob基因?yàn)榘谢?，自?dòng)提取DNA后擴(kuò)增rpob基因的192bp片段進(jìn)行檢測(cè)，2h同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥情況，它的應(yīng)用提高巢式PCR的靈敏度2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，減少非特異性擴(kuò)增。世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的《結(jié)核病管理指南》建議將其用于結(jié)核病的診斷，建議將其作為結(jié)核病疑似患者腦脊液抗酸染色或細(xì)菌培養(yǎng)前的初步篩查，耐多藥結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎。對(duì)于懷疑為肺外結(jié)核的非呼吸道標(biāo)本，在條件允許的情況下，可作為傳統(tǒng)抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)或組織病理學(xué)的替代方法。世界衛(wèi)生組織還指出，由于患者方面的數(shù)據(jù)較少，一些建議的證據(jù)水平較低[6]。因此，開展Xpert MTB/RIF方法在患者不同體液和組織標(biāo)本中的臨床價(jià)值研究，對(duì)于推動(dòng)結(jié)核病的早期診斷具有非常重要的臨床意義。本研究在150例灌洗液標(biāo)本中確診肺結(jié)核130例，離心涂片抗酸染色法抗酸桿菌陽(yáng)性45例，陽(yáng)性率為34.62%;Xpert MTB/RIF檢測(cè)法抗酸桿菌陽(yáng)性57例，陽(yáng)性率為43.85%;Xpert MTB/RIF檢測(cè)法抗酸桿菌陽(yáng)性率明顯高于離心涂片抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.282，P<0.05）。目前，Xpert MTB/RIF測(cè)試儀器價(jià)格昂貴。然而，該系統(tǒng)具有較高的封閉性和自動(dòng)化程度。技術(shù)人員只需將處理后的樣品加入反應(yīng)孔，即可自動(dòng)完成樣品純化、離心、DNA提取、DNA特異序列檢測(cè)和自動(dòng)讀取結(jié)果。它不僅快速，而且降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，被世衛(wèi)組織推薦用于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)。此外，研究指出，檢測(cè)Xpert MTB/RIF的標(biāo)本有多種，包括咳痰或誘導(dǎo)痰、胃液、支氣管肺泡灌洗液、腦脊液、鼻咽分泌物、組織等。本研究采用纖維支氣管鏡檢查技術(shù)，不僅可以直接觀察病變部位，而且通過(guò)標(biāo)本對(duì)病變部位進(jìn)行肺泡灌洗，解決問(wèn)題，提高診斷效率。較多的研究提示，支氣管肺泡灌洗液的敏感度較高。本研究中，Xpert MTB/RIF在病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核的敏感度分別為77%（95%CI：63%～88%）和52%（95%CI：41%～63%）（P<0.05）;肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核的敏感度為81%（95%CI：67%～89%），單純肺結(jié)核的敏感度46%（95%CI：35%～59%）;病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核、合并支氣管結(jié)核和單純肺結(jié)核特異度均為100%（95%CI：98%～100%）。Xpert MTB/RIF檢測(cè)病原學(xué)診斷結(jié)核敏感度高于臨床診斷結(jié)核，肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核敏感度高于單純肺結(jié)核（P<0.05）;支氣管肺泡灌洗液的MTB核酸檢出載量病原學(xué)診斷結(jié)核高于臨床診斷結(jié)核（P<0.05）。

本研究病原學(xué)診斷結(jié)核患者中，Xpert MTB/RIF的敏感度為79%。盡管分子生物學(xué)原則上具有較高的靈敏度，但在本研究中相對(duì)于培養(yǎng)和抗酸染色，仍有假陰性存在。原因主要有，①對(duì)病原學(xué)陽(yáng)性的肺結(jié)核患兒，均采集各類標(biāo)本（痰、胃液、支氣管肺泡灌洗液等），連續(xù)多次采樣進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)病原學(xué)診斷為結(jié)核。Xpert MTB/RIF試驗(yàn)僅收集支氣管肺泡灌洗液，僅進(jìn)行一次試驗(yàn)。②Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB的下限為112.6CFU·mL-1，靈敏度有待進(jìn)一步提高。因此，Xpert MTB/RIF陰性試驗(yàn)不能排除活動(dòng)性肺結(jié)核，應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。除了現(xiàn)有的試劑盒外，第二代產(chǎn)品Xpert MTB/RIF-Ultra已經(jīng)用于結(jié)核病的診斷。同樣，以支氣管肺泡灌洗液為供試品，Xpert MTB/RIF比培養(yǎng)4周以上的檢測(cè)周期，可在2～3h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，對(duì)臨床早期診斷非常有幫助。如果將Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果作為結(jié)核病診斷的依據(jù)，可顯著提高結(jié)核病的診斷率，有助于解決結(jié)核病樣本細(xì)菌載量低的問(wèn)題。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測(cè)法快速、簡(jiǎn)便、陽(yáng)性率高，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)抗酸染色法。對(duì)于患者早期肺結(jié)核診斷有重大意義。

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