唐藝旻， 李英杰， 高立娣， 秦世麗， 趙 冰， 靳鳳龍

(1.齊齊哈爾大學 化學與化學工程學院, 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾市場監(jiān)督管理局食品藥品檢驗檢測中心, 齊齊哈爾 161005)

0 引 言

手性廣泛存在于自然界中，手性藥物對映體三維空間結構之間的差異可導致不同的藥理學和毒理學差異[1-2]。手性藥物約占全球藥物銷售量的1/3，這些手性藥物對映體中的一種對映體可能產(chǎn)生預期的藥理學反應，而相反的一種可能只表現(xiàn)出拮抗或毒性反應[3]。正是對映體藥理活性的重要差異，使得手性藥物對映體的拆分逐漸受到重視。

高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)[4-6]、氣相色譜(Gas chromatography, GC)[7-8]、毛細管電泳(Capillary electrophoresis, CE)[9]和毛細管電色譜(Capillary electrochromatography, CEC)[10]等經(jīng)常用于對映體分離。但HPLC與GC所使用的手性柱價格昂貴，且大多數(shù)情況下，一個特定的手性柱只能分析某一類物質(zhì)，應用往往受限。CEC不僅具有CE的高效性，而且兼具HPLC的高選擇性，成為一種選擇性好、分離效率高、消耗試劑量小的分離分析技術[10]。β-環(huán)糊精(β-CD)及其衍生物由于空腔大小適中、良好的柔韌性和天然的手性已被廣泛使用在CEC和CE領域中[11]。Zhou等開發(fā)了一種溶膠-凝膠“一步法”來制備SBE-β-CD-二氧化硅雜化整體柱，整體柱內(nèi)固定相具有均一的結構。優(yōu)化色譜條件后，在CEC中共分離了26種外消旋分析物，其中17種達到了基線對映體分離[12]。Deng等首次通過一鍋法制備了羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)功能化的毛細管整體柱，通過NMR和拉曼光譜確認了HP-β-CD在整體柱上成功鍵合，在CEC上成功分離外消旋化合物，包括外消旋抗膽堿能藥物、甲哌嗪醇及其中間體等[13]。

本文旨在合成一種具有多個作用位點、制備簡單的β-CD衍生物，6-EA-β-CD在β-CD基礎上引入雙鍵和胺基等基團，不僅克服了β-CD水溶性差的缺點，而且增強了氫鍵和包結等作用。利用CEC的高效性和高選擇性，對手性化合物進行拆分，為手性拆分領域提供一些基礎數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7100 CE毛細管電泳儀(美國安捷倫公司)、6230 TOF MS-質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；S-4300 SEM(日本日立公司)；Nicolet 380 FTIR傅立葉變換紅外光譜儀(美國熱電公司)；DMBA 200 光學顯微鏡(麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司)；石英毛細管柱(75 μm i.d.， 365 μm o.d.， 中國銳豐色譜器材公司)。

β-環(huán)糊精、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、1,3-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)(天津科密歐化學試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN)、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)(分析純，阿拉丁試劑)；鹽酸班布特羅(中國天津中央藥業(yè)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 單6-丙烯酰乙二胺-β-環(huán)糊精(6-EA-β-CD)的合成

首先合成磺?；?β-環(huán)糊精(6-OTs-β-CD)[14]和單6-乙二胺-β-環(huán)糊精(6-en-β-CD)[15],然后稱取2 g 6-en-β-CD和0.36 g DCC，溶解于20 mL DMF中，控制反應溫度15 ℃下滴加0.34 g丙烯酸，30 min后，室溫下反應8 h。反應結束后真空抽濾,濾液用一定量的丙酮析出沉淀，真空干燥，得淺黃色固體產(chǎn)物 6-EA-β-CD。

1.2.2 整體柱的制備

1.3 電色譜柱性能研究

以D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅為分析物，對6-EA-β-CD整體柱的手性拆分性能進行了研究。在毛細管電色譜運行過程中，以20 mmol·L-1醋酸銨作為緩沖液，50 mbar×3 s壓力進樣，紫外檢測波長為200 nm。

同時采用單一變量法以分離度為考察指標，優(yōu)化考察影響分離的主要因素，包括緩沖溶液的pH值、電壓和柱溫，如表1所示，從而得出最佳電色譜分離條件。

2 結果與討論

2.1 6-EA-β-CD的表征

2.1.1 紅外光譜分析

表1 CEC分離條件的影響因素

圖1 紅外光譜圖: (a)磺?；?β-環(huán)糊精; (b)乙二

圖2 6-EA-β-CD 的質(zhì)譜圖

2.1.2 質(zhì)譜分析

采用ESI-TOF/MS對合成產(chǎn)物進一步驗證，結果如圖2所示。6-EA-β-CD分子量為1 230，圖2中m/z為1 231.453 63的離子峰對應6-EA-β-CD的[M+H]+峰，m/z為1 253.483 71的離子峰對應[M+Na]+峰，m/z為1 269.398 5是6-EA-β-CD的 [M+K]+峰，從而可以斷定合成的環(huán)糊精衍生物為6-EA-β-CD。

2.2 整體柱制備條件的優(yōu)化

采用一步鍵合法制備的整體柱制備簡單、環(huán)保，具有較好的重現(xiàn)性以及較大的固定相承載能力[16]。當6-EA-β-CD單體溶液的濃度為0.15 g·mL-1、EDMA功能單體的量為0.060 g時，保證總體系中致孔劑質(zhì)量百分數(shù)為 86%。分別采用光學顯微鏡和甲醇經(jīng)高壓恒流泵流入整體柱中的流速為指標評價整體柱的鍵合情況和通透性，結果如表2所示。

表2 反應溫度及時間對柱性能的影響

從表2光學顯微鏡觀察到的結果可以看出，當反應時間不變時，隨著反應溫度的升高,柱內(nèi)固定相的鍵合情況從稀疏變得緊密。結合甲醇流速可以看出，當溫度為45 ℃時，甲醇流速適中，柱內(nèi)通透性較好，從而確定最佳反應溫度為45 ℃。反應時間也是整體柱內(nèi)固定相鍵合情況的重要影響因素，一方面反應時間過少，固定相鍵合不緊密，溶質(zhì)的保留較小；另一方面，若反應時間太長，柱內(nèi)的團聚現(xiàn)象明顯，柱子通透性下降。當反應溫度均為45 ℃、反應時間為6和8 h時，柱內(nèi)固定相鍵合量較多且相對均勻，結合甲醇流速可以看出，反應時間為8 h時，甲醇流速較慢，柱子通透性差，而反應時間為6 h時甲醇流速適中，通透性良好，最終確定反應時間6 h為最佳條件。與呂仁江等制備的丙烯酰胺-β-CD毛細管電色譜整體柱[17]相比，兩種整體柱均采用一步鍵合法制備，本文通過改變反應溫度和時間，在更短的時間內(nèi)制得了具有良好性能的整體柱。

2.3 整體柱的掃描電鏡表征

整體柱內(nèi)部固定相形貌采用SEM進行表征，結果如圖3所示。圖3(a)和圖3(b)分別為在最佳制柱條件(6-EA-β-CD單體溶液的濃度為0.15 g·mL-1、EDMA為0.060 g、總體系中致孔劑質(zhì)量百分數(shù)為 86%、反應溫度為45 ℃、反應6 h)下制得的整體柱橫截面和局部截面掃描電鏡圖?？梢钥闯?，柱內(nèi)形成了孔徑較均勻的網(wǎng)狀結構，其中，大中孔徑保證了一定的通透性。固定相與柱內(nèi)壁鍵合緊密，柱內(nèi)固定相不會輕易被流動相沖出柱外，整體柱穩(wěn)定性得以提高。當其他制柱條件不變，控制反應時間為4 h時制得的整體柱橫截面如圖3(c)所示，柱內(nèi)固定相鍵合量較少，柱內(nèi)稀疏，通透性好；反應時間為8 h時制得的整體柱橫截面如圖3(d)所示，柱內(nèi)鍵合緊密，有明顯的團聚現(xiàn)象，柱內(nèi)孔徑較小，通透性差。由此驗證，在最佳制柱條件下制得的整體柱具有較好的形貌，柱性能良好，可用于進一步的應用研究。

2.4 整體柱的性能研究

柱效是色譜柱分離能力的度量，通過計算有效塔板數(shù)對該整體柱的柱效進行評價。整體柱長度一定時，有效塔板數(shù)越大，表明物質(zhì)在整體柱中分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利。本文在最佳制柱條件下制備三根電色譜整體柱，以硫脲為中性標記物，對所制備整體柱的柱效進行評價，結果如表3所示。三根柱子平均柱效達到64 251 plates·m-1以上，并且單根柱子柱效的相對標準偏差(RSD)分別為0.728%、0.151%和0.895%。表明該整體柱柱效較高，有一定的分離能力，且柱子相對穩(wěn)定。

表3 整體柱柱效評價

以D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅為分析物,對6-EA-β-CD整體柱的手性拆分性能進行進一步考察。手性化合物拆分過程會受緩沖溶液pH、電壓及溫度的影響，故采用控制單一變量法對這些條件進行了考察，結果如圖4所示。圖4(a)～圖4(c)分別為緩沖溶液pH值、電壓和溫度對分析物分離度的影響，從圖4中可以看出，當pH值為8.5、電壓為20 kV、分離溫度為20 ℃時，D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅的分離度均達到最大值，故確定兩種分析物的最佳CEC運行條件為pH=8.5、20 mmol·L-1醋酸銨緩沖溶液、電壓為20 kV、溫度為20 ℃、50 mbar×3 s壓力進樣、紫外檢測波長為200 nm。在最佳CEC分離條件下，D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅均達到基線分離，分離圖如圖5和圖6所示。利用本文自制的6-EA-β-CD電色譜整體柱，在最佳CEC運行條件下，鹽酸班布特羅對映體在7 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，與劉樹仁等制備的整體柱對鹽酸班布特羅對映體拆分結果[18]相比，兩整體柱均能實現(xiàn)對鹽酸班布特羅對映體的拆分，但本文的6-EA-β-CD電色譜整體柱能在更短時間內(nèi)實現(xiàn)對鹽酸班布特羅對映體的基線分離，更加高效快速。

圖4 CEC運行條件對分離度的影響

圖5 丙氨酸電色譜分離圖

3 結 論

采用簡單的制備方法成功制備了一種新型毛細管電色譜整體柱，即6-EA-β-CD毛細管電色譜整體柱。在優(yōu)化的CEC運行模式下，D,L-丙氨酸及鹽酸班布特羅均在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)基線分離。該整體柱具有試劑消耗少和分離能力強的特點，為今后研究提供一定的基礎。