趙 杰 徐靜茹 馬 立 陳佳雯 謝 昕 李璐鑫 楊克禮 馮士彬 李 玉 吳金節(jié) 王希春*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064)

我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年7月9日發(fā)布第194號(hào)公告，要求“自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑(中藥類(lèi)除外)的商品飼料”，標(biāo)志著我國(guó)全面進(jìn)入藥物限抗、飼料禁抗新時(shí)代，尋求綠色環(huán)保型無(wú)抗生產(chǎn)已成為一種必然的趨勢(shì)。微生態(tài)制劑是一種根據(jù)微生態(tài)理論，使用益生菌提高免疫力，保持體內(nèi)微生態(tài)平衡，進(jìn)而提高宿主健康水平的活菌制劑[1]。一種有效的微生態(tài)制劑不僅能夠降低動(dòng)物病死率，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，同時(shí)可以保障肉制品的質(zhì)量安全，維護(hù)生態(tài)安全[2]。微生態(tài)制劑可以改善動(dòng)物機(jī)體的健康水平，調(diào)節(jié)腸道菌群的紊亂，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，具有防治消化道疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)雙重作用，且體內(nèi)無(wú)殘留[3]。此外，微生態(tài)制劑還可以產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子和干擾素等免疫活性物質(zhì)，刺激局部免疫器官，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高動(dòng)物機(jī)體的抵抗力[4]。益生菌類(lèi)微生態(tài)制劑可在改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)的同時(shí)提高宿主健康水平和健康狀態(tài)。動(dòng)物胃腸道內(nèi)擁有豐富的菌群，乳酸菌是動(dòng)物胃腸道中一種固有優(yōu)勢(shì)菌群，已作為飼料添加劑應(yīng)用于生產(chǎn)中[5]。芽孢桿菌在腸道中主要通過(guò)微生物奪氧，維持腸道生態(tài)平衡[7]，在腸道短時(shí)間定植后，可以消耗大量的氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，增強(qiáng)腸道厭氧菌的定植，抑制病原微生物的同時(shí)促進(jìn)乳酸菌等有益微生物的生長(zhǎng)，具備提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、降低料重比和抑制致病菌生長(zhǎng)等較多優(yōu)點(diǎn)[8-9]。在養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展中，反芻動(dòng)物占據(jù)著重要的地位。微生態(tài)制劑能夠穩(wěn)定反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境，增加瘤胃微生物數(shù)量，促進(jìn)氮代謝，提高機(jī)體對(duì)飼料的利用率。楊華等[6]研究表明，微生態(tài)制劑進(jìn)入瘤胃后能激活奶牛瘤胃微生物的活性，促進(jìn)瘤胃內(nèi)有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，提高脂肪、蛋白質(zhì)和纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率。

有研究表明，菌株的定植能力具有宿主特異性，來(lái)源不同的菌株在不同的動(dòng)物胃腸道內(nèi)具有不同的定植能力[10]。目前，市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到的微生態(tài)制劑其菌株一般來(lái)源于體外環(huán)境，而在生產(chǎn)上應(yīng)用的大多數(shù)益生菌株主要來(lái)自土壤、水環(huán)境中，這種生態(tài)環(huán)境與動(dòng)物胃腸道生理環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，動(dòng)物胃腸道內(nèi)的酸性環(huán)境、膽鹽和厭氧環(huán)境在很大程度上制約了許多微生物的生長(zhǎng)，因此這些微生態(tài)制劑被應(yīng)用于動(dòng)物時(shí)往往得不到很好的效果[11]。與此相比，附著于胃腸道內(nèi)的微生物經(jīng)過(guò)胃腸道自身的篩選，能適應(yīng)胃腸道環(huán)境且能大量繁殖。為此，本研究擬從大別山黃牛腸道中針對(duì)性地篩選出具有益生菌潛質(zhì)的菌株，通過(guò)細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后制成復(fù)合微生態(tài)制劑，在飼糧中添加后飼喂大別山黃牛，探討復(fù)合微生態(tài)制劑與單一芽孢桿菌相比，對(duì)大別山黃牛免疫、抗氧化能力和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為復(fù)合微生態(tài)制劑在動(dòng)物健康養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采樣及臨床飼喂用大別山黃牛由安徽省安慶市望江縣小月山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。臨床飼喂用黃牛均在6月齡左右，共12頭，公母各占1/2。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

LB瓊脂培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基，杭州百思生物技術(shù)有限公司；商品枯草芽孢桿菌菌粉(活菌數(shù)≥1.0×1010CFU/g)，拜耳(墨西哥)有限公司；牛源酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒，上海晶抗生物工程有限公司；TGL-18R型冷凍高速離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；Smart Pure超純水儀，美國(guó)Thermo公司；AE224電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；可控硅控溫水浴鍋，金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器；DW-86L388A-80 ℃冰箱，青島海爾特種電器有限公司；微量移液器，Eppendaorf有限公司；BK-500全自動(dòng)生化分析儀，濟(jì)南鑫貝生物科技有限公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，澳大利亞帝肯TECAN公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 菌株分離

1.3.1 樣品采集

選擇未經(jīng)抗生素及微生態(tài)制劑處理過(guò)的健康成年大別山黃牛3頭，經(jīng)放血屠宰。無(wú)菌采集各腸段的內(nèi)容物，冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.3.2 菌株的分離與純化

將采集的腸道內(nèi)容物樣品置于80 ℃的水浴鍋中水浴處理20 min，采用稀釋平板法，無(wú)菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取不同形態(tài)菌落，反復(fù)劃線純化篩選芽孢桿菌。采用稀釋平板法，將采集的腸道內(nèi)容物分別無(wú)菌操作接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后挑取不同形態(tài)菌落，反復(fù)劃線純化篩選乳酸菌。

1.3.3 菌株的鑒定

根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、染色和菌落生長(zhǎng)情況進(jìn)行鑒定。將純化后的菌液送往擎科生物公司進(jìn)行16S rDNA基因序列測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用GenBank中的BLAST程序比對(duì)，對(duì)細(xì)菌種屬進(jìn)行鑒定。

1.3.4 酸耐受性試驗(yàn)

參考Guo等[12]的試驗(yàn)步驟進(jìn)行耐酸試驗(yàn)。將磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的pH分別調(diào)整為7.4、4.0、3.0、2.0，菌液按1∶10的體積比加入到上述配制好的PBS中，在37 ℃的搖床中孵育2 h后取出，倍比稀釋后涂板，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，每組重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算所測(cè)菌株的存活率，計(jì)算公式如下：

存活率(%)=(酸處理菌液活菌數(shù)/
未處理菌液活菌數(shù))×100。

1.3.5 膽鹽耐受性試驗(yàn)

參考宋獻(xiàn)藝[13]的試驗(yàn)步驟進(jìn)行耐膽鹽試驗(yàn)。用PBS將牛膽鹽稀釋成濃度分別為0、0.15%、0.30%和0.60%的膽鹽溶液，菌液按1∶10的體積比加入到上述配制好的膽鹽溶液中，在37 ℃的搖床中孵育2 h后取出，倍比稀釋后涂板，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，每組重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算所測(cè)菌株的存活率，計(jì)算公式如下：

存活率(%)=(牛膽鹽處理菌液活菌數(shù)/
未處理菌液活菌數(shù))×100。

1.4 微生態(tài)制劑的制備

將菌株接種于固體培養(yǎng)基上活化后接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)，制作一級(jí)種子液。以5%的接種量將一級(jí)種子液接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，將培養(yǎng)后的菌液搖勻后吸取100 μL，倍比稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，重復(fù)3次，培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)活菌數(shù)，根據(jù)結(jié)果稀釋菌液至1×108CFU/mL，作為二級(jí)種子液。將二級(jí)種子液送往南京阡晟源生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)。對(duì)所得菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測(cè)得芽孢桿菌菌液濃度約為0.96×108CFU/mL，乳酸菌菌液濃度約為1.24×108CFU/mL。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取12只體型相近的健康斷奶大別山黃牛犢牛，隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組(C組)、芽孢桿菌組(B組)、復(fù)合微生態(tài)制劑組(E組)，每組4頭，組與組之間隔離，與牛群隔離，采用栓系飼喂。C組飼喂正常的基礎(chǔ)飼糧，B組飼喂添加枯草芽孢桿菌菌粉的基礎(chǔ)飼糧，E組飼喂添加由牛源芽孢桿菌與乳酸菌制備的復(fù)合微生態(tài)制劑的基礎(chǔ)飼糧?？莶菅挎邨U菌菌粉和復(fù)合微生態(tài)制劑均按照每天活菌數(shù)不低于1×1011CFU的劑量進(jìn)行添加，根據(jù)菌液濃度計(jì)算得出每天牛源芽孢桿菌與乳酸菌的添加量各為500 mL?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。每日飼喂2次，每次飼喂后自由飲水。試驗(yàn)期為30 d。

1.6 樣品采集

在試驗(yàn)第0、15和30天，分別對(duì)各組牛進(jìn)行空腹頸靜脈采血，分離血清，于-20 ℃凍存待測(cè)。在試驗(yàn)第30天上午對(duì)各組牛進(jìn)行無(wú)菌糞便采集，采集糞便樣品放入無(wú)菌凍存管內(nèi)，立即放入液氮中淬滅并保存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.7 指標(biāo)測(cè)定

1.7.1 血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性與丙二醛(MDA)含量。

1.7.2 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定

采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量。

1.7.3 血清細(xì)胞因子的測(cè)定

通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。

1.7.4 腸道高通量測(cè)序

將糞便樣品送往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，主要流程包括樣本檢測(cè)、DNA提取與檢測(cè)、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫(kù)制備與庫(kù)檢、Illumina NovaSeq測(cè)序等。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。血清細(xì)胞因子、免疫與抗氧化指標(biāo)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA基因序列的測(cè)定與細(xì)菌鑒定

從大別山黃牛各段腸道內(nèi)容物中分離出的菌落經(jīng)革蘭氏染色后，選擇6株革蘭氏陽(yáng)性菌，分別編號(hào)為B1～B6；分離出5株疑似乳酸菌，分別編號(hào)為L(zhǎng)1～L5。將反饋的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性均在99%～100%，結(jié)果如表2所示。

表2 各菌株16S rDNA基因序列同源性比較

2.2 酸耐受性試驗(yàn)

由圖1可知，隨著PBS pH的降低，所有菌株的存活率整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中B1、B4表現(xiàn)出對(duì)酸環(huán)境較為敏感，分別在pH為4和3時(shí)存活率降至0，因此選擇B2、B3、B5、B6這4株芽孢桿菌進(jìn)行下一步膽鹽耐受性的篩選；同理，在pH為2時(shí)，L2的存活率降至0，因此選擇L1、L3、L4、L5這4株乳酸菌作為進(jìn)一步膽鹽耐受性試驗(yàn)的菌株。

圖A表示孵育2 h后各芽孢桿菌菌株在不同pH PBS中的存活率；圖B表示孵育2 h后各乳酸菌菌株在不同pH PBS中的存活率。

2.3 膽鹽耐受性試驗(yàn)

由圖2可知，牛膽鹽對(duì)所有菌株均呈現(xiàn)抑制生長(zhǎng)的作用，隨著膽鹽濃度的升高，各菌株的存活率整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。4株芽孢桿菌中，B6在0.3%的膽鹽溶液中存活率降至0，而B(niǎo)5的存活率則達(dá)到了68.16%，明顯高于B2、B3，因此最終選取B5(枯草芽孢桿菌)作為制作復(fù)合微生態(tài)制劑的芽孢桿菌菌株；4株乳酸菌中，L5對(duì)牛膽鹽的耐受力最差，在0.3%的膽鹽溶液中存活率已降至0，L1在0.6%的膽鹽溶液中存活率降至0，而L3在0.6%的膽鹽溶液中存活率最高，達(dá)到了50.57%，因此最終選擇L3(乳酸乳球菌)作為制作復(fù)合微生態(tài)制劑的乳酸菌菌株。

圖A表示孵育2 h后各芽孢桿菌菌株在不同濃度膽鹽溶液中的存活率；圖B表示孵育2 h后各乳酸菌菌株在不同濃度膽鹽溶液中的存活率

2.4 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，第0和15天時(shí)，所測(cè)血清抗氧化指標(biāo)各組間差異均不顯著(P>0.05)。第30天時(shí)，與C組相比，B組與E組血清T-AOC及GSH-Px、CAT活性均顯著升高(P<0.05)，B組與E組間差異均不顯著(P>0.05)；B組和E組血清MDA含量顯著低于C組(P<0.05)；E組血清SOD活性極顯著高于C組(P<0.01)，B組顯著高于C組(P<0.05)，B組與E組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

續(xù)表3項(xiàng)目 Items時(shí)間 Time組別 GroupsCBE谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px/(U/mL)第0天 Day 0644.68±69.78649.86±58.96646.85±70.16第15天 Day 15656.79±45.86713.78±76.24699.99±61.08第30天 Day 30624.10±41.96b729.11±55.52a726.38±64.74a過(guò)氧化氫酶CAT/(U/mL)第0天 Day 091.31±14.0490.91±14.6091.73±11.83第15天 Day 1592.14±12.6896.10±11.7596.74±10.34第30天 Day 3091.32±14.86b113.53±11.97a115.54±14.46a丙二醛 MDA/(nmol/mL)第0天 Day 06.09±0.916.14±0.956.02±0.93第15天 Day 156.41±1.965.90±0.995.32±1.07第30天 Day 306.23±0.98a4.80±0.60b4.50±0.88b

2.5 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，第15、30天時(shí)，與C組相比，B組、E組的血清IgG含量極顯著提高(P<0.01)，且第30天時(shí)E組血清IgG含量顯著高于B組(P<0.05)。第15、30天時(shí)，E組血清IgM含量極顯著高于C組與B組(P<0.01)；與C組相比，B組血清IgM含量雖有升高趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。第0、15和30天時(shí)，B組與E組血清IgA含量與C組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表4 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清免疫指標(biāo)的影響

2.6 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清細(xì)胞因子的影響

由表5可知，第0、15和30天時(shí)，B組與E組血清IL-1含量與C組均差異不顯著(P>0.05)。第30天時(shí)，E組血清IL-2含量顯著升高(P<0.05)，B組具有上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。第30天時(shí)，B組和E組血清IL-6含量較C組顯著升高(P<0.05)。在第15和30天時(shí)，B組與E組血清IFN-γ含量顯著高于C組(P<0.05)。第0、15和30天時(shí)，各組間血清TNF-α含量差異不顯著(P>0.05)。

表5 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清細(xì)胞因子的影響

2.7 牛源微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.7.1 樣品操作分類(lèi)單元(OTU)統(tǒng)計(jì)結(jié)果及基于OTU的Venn圖

以97%的一致性閾值進(jìn)行OTU聚類(lèi)，每一個(gè)OTU都表示出一種微生物物種，OTU的豐度能夠初步表達(dá)物種的豐富程度。由表5可以看出，12個(gè)樣品通過(guò)拼接共產(chǎn)生1 065 589條Tag，Tag的平均長(zhǎng)度為253nt，連接率均達(dá)到了99%以上，表明數(shù)據(jù)具有可靠性，3組樣品共產(chǎn)生16 397個(gè)OTU，其中C組有5 284個(gè)，B組有5 971個(gè)，E組有5 139個(gè)，表明3組之間的菌群豐度差異不明顯。

表6 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果及樣品OTU統(tǒng)計(jì)

Venn圖能夠直觀看出各組特有的OTU數(shù)目和不同組之間共有的OTU數(shù)目。由圖3可知，3組共含有2 604個(gè)OTU，3組共有1 471個(gè)OTU，C組特有65個(gè)OTU，B組特有647個(gè)OTU，E組特有69個(gè)OTU，C組與B組共有1 614個(gè)OTU，C組與E組共有1 547個(gè)OTU，E組與B組共有1 604個(gè)OTU。3組之間特有OTU數(shù)目存在一定的差異，且B組的OTU數(shù)目較多。

圖3 各組樣品基于OTU的Venn圖

2.7.2 基于OTU的α多樣性分析

由表7可知，B組的Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Shao1指數(shù)、ACE指數(shù)高于C組與E組，C組與E組的Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)基本一致，Simpson指數(shù)與Goods coverage指數(shù)3組表現(xiàn)基本一致，且Goods coverage指數(shù)均≥0.997，表明基本覆蓋到樣品中所有的物種。

表7 各組樣品的α多樣性分析

2.7.3 物種累積箱型圖分析

物種累積箱型圖主要是用來(lái)描述隨著樣本量增加對(duì)物種多樣性的影響。由圖4可知，橫坐標(biāo)為樣本量；縱坐標(biāo)為抽樣后OTU數(shù)目。在樣本量為1～4時(shí)，OTU數(shù)目急劇上升，表明送檢樣本中有大量物種被發(fā)現(xiàn)，隨著樣本量繼續(xù)增加，OTU數(shù)目逐漸趨于平緩，說(shuō)明物種數(shù)目不會(huì)隨著樣本數(shù)量繼續(xù)增加而急劇增加，表明樣本量充分，能夠用于估算物種豐富度。

圖4 物種累積箱形圖

2.7.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)

物種分布柱狀圖能夠直觀的看出每個(gè)門(mén)水平物種在樣品中的占比。由圖5可知，12個(gè)樣品中都羅列了豐度最高的10個(gè)菌門(mén)，其中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)的豐度較高，這些微生物占據(jù)牛直腸微生物的94.24%以上。物種豐度聚類(lèi)熱圖顯示物種分類(lèi)豐度數(shù)據(jù)中每個(gè)樣品在屬水平的物種比例，圖中深紅色表示該OTU對(duì)樣品總OTU有較高比例貢獻(xiàn)值，高亮綠色表示該OTU對(duì)樣品總OTU有較低比例貢獻(xiàn)值。由圖6可知，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其中厚壁菌門(mén)的乳酸菌屬(Lactobacillus)在E組占優(yōu)，可調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，說(shuō)明復(fù)合微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)大別山黃牛腸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中。

Others：其他；Melainabacteria：黑水仙菌門(mén)；Acidobacteria：酸桿菌門(mén)；Verrucomicrobia：疣微菌門(mén)；Tenericutes：軟壁菌門(mén)；Spirochaetes：螺旋體門(mén)；Actinobacteria：放線菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)。

Alistipes：另枝菌屬；Oscillibacter：螺旋菌屬；Anaerosporobacter：厭氧孢桿菌屬；Alloprevotella：普雷沃氏菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；unidentified_Ruminococcaceae：未鑒定瘤胃菌科；Ruminobacter：反芻桿菌屬；unidentified_Spirochaetaceae：未鑒定螺旋體科；Sphingomonas：鞘脂單胞菌屬；Variovorax：貪噬菌屬；Chitinophaga：鞘氨醇菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Dubosiella：杜氏桿菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；unidentified_Clostridiales：未鑒定梭菌目；Blautia：布勞特氏菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Roseburia：羅氏菌屬；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Odoribacter：氣味桿菌屬；unidentified_Lachnospiraceae：未鑒定毛螺旋菌科；Lactobacillus：乳桿菌屬；Butyrivibrio：丁酸弧菌屬；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Spirochaetes：螺旋體門(mén)；Verrucomicrobia：疣微菌門(mén)。

由表8可知，厚壁菌門(mén)的豐度，B組與E組基本一致，較C組略有降低；擬桿菌門(mén)的豐度，E組和B組比C組有所升高；變形菌門(mén)的豐度，E組和B組比C組有所降低。

表8 腸道菌群在門(mén)水平上的多樣性比較

3 討 論

已有研究表明，微生態(tài)制劑對(duì)反芻動(dòng)物具體營(yíng)養(yǎng)和疾病防治等功能，但市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到的微生態(tài)制劑其菌株一般來(lái)源于體外環(huán)境，由于缺乏針對(duì)性而無(wú)法得到良好的應(yīng)用效果[2,11]。因此，本試驗(yàn)將從大別山黃牛各段腸道內(nèi)容物中分離出的菌落經(jīng)革蘭氏染色、耐酸耐膽鹽篩選后，最終選取枯草芽孢桿菌與乳酸乳球菌為制作復(fù)合微生態(tài)制劑的菌株，并通過(guò)測(cè)定大別山黃牛血清細(xì)胞因子、抗氧化與免疫指標(biāo)及腸道菌群，探究該牛源微生態(tài)制劑在大別山黃牛上的應(yīng)用效果。

3.1 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px、CAT，機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力與這些酶的活性有直接關(guān)系。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其含量的高低能夠反映機(jī)體過(guò)氧化損傷的程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)第30天時(shí)，與C組相比，B組和E組血清T-AOC及GSH-Px、CAT活性均顯著升高，B組血清SOD活性顯著高于C組；E組血清SOD活性極顯著高于C組。秦順義等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊飼糧中加入富硒益生菌能夠使血清T-AOC與SOD活性顯著或極顯著升高，同時(shí)使血清MDA含量顯著或極顯著降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明微生態(tài)制劑能夠幫助機(jī)體提高抗氧化能力，且復(fù)合微生態(tài)制劑的效果要略好于單一菌株的微生態(tài)制劑。

3.2 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清免疫指標(biāo)的影響

IgG、IgA、IgM均是血清中常見(jiàn)的免疫球蛋白，也是反映機(jī)體中體液免疫強(qiáng)弱的3個(gè)重要指標(biāo)。趙鵬等[15]在羔羊的微生態(tài)制劑應(yīng)用試驗(yàn)中得出，添加復(fù)合微生態(tài)制劑能夠顯著提高羔羊血清IgG、IgM含量。屈圣富等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在豬飼糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑能夠使血清IgG含量顯著增加，但對(duì)血清IgA含量無(wú)顯著影響。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，血清IgG含量在第15天時(shí)B組和E組極顯著高于C組，且在第30天時(shí)E組顯著高于B組；血清IgM含量在第15和30天時(shí)E組比C組和B組極顯著升高，B組血清IgM含量隨飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果保持一致。試驗(yàn)過(guò)程中大別山黃犢牛無(wú)感染疾病情況，可能是復(fù)合微生態(tài)制劑刺激腸道上皮細(xì)胞促使機(jī)體產(chǎn)生IgG和IgM，導(dǎo)致二者的含量升高，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力[17]。與B組相比，添加復(fù)合微生態(tài)制劑的E組提升血清IgG和IgM含量的能力要比單一菌株枯草芽孢桿菌的效果要好，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)制備的牛源復(fù)合微生態(tài)制劑中的2種菌在腸道內(nèi)能夠發(fā)揮協(xié)同作用，從而對(duì)機(jī)體免疫力的提升更加明顯。

3.3 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛血清細(xì)胞因子的影響

細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞被免疫原刺激進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的小分子蛋白質(zhì)，能夠參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)相關(guān)。鮑玉林等[18]研究發(fā)現(xiàn)，給犢牦牛應(yīng)用微生態(tài)制劑能夠顯著提高血清IL-2和IFN-γ含量。本試驗(yàn)中，第30天時(shí)，與C組相比，B組與E組血清IL-6和IFN-γ含量顯著升高，同時(shí)E組血清IL-2含量也顯著升高，而B(niǎo)組雖呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但差異不顯著，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，這說(shuō)明復(fù)合微生態(tài)制劑進(jìn)入腸道后作用于宿主的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)了宿主體內(nèi)免疫細(xì)胞的活性，進(jìn)而提高了動(dòng)物機(jī)體的免疫力。

3.4 牛源復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大別山黃牛腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化一般通過(guò)糞便菌群結(jié)構(gòu)的變化來(lái)反映[19]，動(dòng)物腸道內(nèi)有超過(guò)100萬(wàn)億的細(xì)菌等微生物，這些微生物具有抵御病原體侵襲、維持腸道黏膜體系的屏障作用。良好的腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)動(dòng)物的健康生長(zhǎng)至關(guān)重要，益生菌能夠幫助宿主消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體發(fā)育與維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[20]。Rey等[21]研究指出，犢牛瘤胃內(nèi)的菌群會(huì)隨著日齡增長(zhǎng)發(fā)生變化，隨著日齡增長(zhǎng)，擬桿菌門(mén)會(huì)逐漸替代變形菌門(mén)，厚壁菌門(mén)中含有大量能夠?qū)w維起到消化作用的細(xì)菌。杜琪等[22]研究發(fā)現(xiàn)，犢牛胃腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌群。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)以及變形菌門(mén)構(gòu)成犢牛腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，且從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，E組和B組擬桿菌門(mén)所占比例增加，且添加復(fù)合微生態(tài)制劑的E組比B組擬桿菌門(mén)豐度增加的更為顯著，而擬桿菌門(mén)能夠促進(jìn)機(jī)體對(duì)多糖的消化吸收，提高纖維的利用率；同時(shí)，E組和B組變形菌門(mén)所占比例有所降低，且添加復(fù)合微生態(tài)制劑的E組厚壁菌門(mén)中乳酸菌屬占優(yōu)，同時(shí)比B組變形菌門(mén)豐度降低的更為顯著，變形菌門(mén)中含有大腸桿菌及沙門(mén)氏菌等多種致病菌，說(shuō)明復(fù)合微生態(tài)制劑能夠調(diào)節(jié)大別山黃牛腸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，抑制有害微生物的繁殖。綜上所述，本試驗(yàn)所制備的牛源復(fù)合微生態(tài)制劑能夠改善大別山黃牛的腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌群數(shù)量，同時(shí)降低有害菌群數(shù)量。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)通過(guò)耐酸與耐膽鹽試驗(yàn)，從大別山黃牛腸道內(nèi)篩選出對(duì)酸和膽鹽耐受性都較高的枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌，并將這2株菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成牛源復(fù)合微生態(tài)制劑。

② 該牛源復(fù)合微生態(tài)制劑能夠增強(qiáng)大別山黃牛的免疫功能和抗氧化能力，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，且其應(yīng)用效果優(yōu)于單一菌株的微生態(tài)制劑。