邢媛媛 鄭彥楷 郭世偉 王俊麗 金 曉 徐元慶 史彬林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

畜禽的健康極易受到外界各種病原體或非病原體的侵害，促使機(jī)體通過(guò)一系列代謝行為和神經(jīng)內(nèi)分泌的改變來(lái)適應(yīng)新的環(huán)境以達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡。在此過(guò)程中，畜禽往往會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、食欲不振，使飼糧中部分用于生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)而用于維持動(dòng)物機(jī)體的免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，引起免疫應(yīng)激[1]。此外，過(guò)度的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一些有害代謝產(chǎn)物殘留在肉類及肉制品中，導(dǎo)致肉品質(zhì)嚴(yán)重下降[2]。由此可見(jiàn)，免疫應(yīng)激不僅影響肉仔雞生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)消費(fèi)者的健康也有一定的影響。因此，通過(guò)綠色無(wú)污染的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控措施來(lái)緩解免疫應(yīng)激引起的肉仔雞的機(jī)體損傷，從而發(fā)揮治療和緩解作用是較為理想的選擇。

黑沙蒿廣泛分布于我國(guó)內(nèi)蒙古和陜西等西北地區(qū)，是一種較為常見(jiàn)的可防風(fēng)固沙的菊科蒿屬植物。黑沙蒿在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用有著悠久的歷史，具有消炎散腫、寬胸利氣和止血的作用，在農(nóng)業(yè)方面還具有殺蟲等功效[3]。研究表明，在飼糧中添加750 mg/kg黑沙蒿多糖(AOP)可顯著改善肉仔雞的生長(zhǎng)性能，而這可能與其促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、改善腸黏膜形態(tài)、提高消化酶活性有關(guān)[4]。在反芻動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)，添加3% AOP可改善反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)酵，提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效降解，從而改善其生長(zhǎng)性能[5]。在嚙齒類動(dòng)物上也有類似發(fā)現(xiàn)，在大鼠飼糧中添加300 mg/kg AOP可提高大鼠平均日增重[6]。有研究者以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為載體評(píng)價(jià)了沙蒿多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙蒿多糖可激活巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞中氧自由基和一氧化氮(NO)的含量，并提高促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)-6的含量，其具體調(diào)控機(jī)制為沙蒿多糖被巨噬細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4(TLR4)識(shí)別后，將其信號(hào)轉(zhuǎn)到胞內(nèi)，隨后激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性[7]。

畜禽生長(zhǎng)(尤其是早期生長(zhǎng))由于受環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激等因素的影響，極易損傷腸道屏障，降低免疫機(jī)能，造成生長(zhǎng)阻滯，甚至導(dǎo)致死亡。研究表明，肉仔雞注射脂多糖(LPS)后激活了TLR4/NF-κB信號(hào)通路，并導(dǎo)致IL-1β、IL-6和TNF-α的過(guò)度產(chǎn)生[8]，而AOP是否可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路緩解由LPS引起的免疫應(yīng)激，還有待進(jìn)一步研究。因此，本研究從TLR4/NF-κB信號(hào)通路探究AOP對(duì)免疫應(yīng)激狀態(tài)下肉仔雞十二指腸中炎癥因子含量的影響，旨在為AOP在肉仔雞飼糧中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

本課題組前期綜合生長(zhǎng)性能、血清免疫和抗氧化指標(biāo)確定AOP在肉仔雞飼糧中的適宜添加量為750 mg/kg[4]，以此作為本研究試驗(yàn)飼糧中AOP的添加量。通過(guò)腹腔注射LPS構(gòu)建肉仔雞的免疫應(yīng)激模型。采用2×2雙因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取192只1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞。試驗(yàn)期為42 d，分為預(yù)試期(第1～14天)、應(yīng)激Ⅰ期(第15～28天，包括7 d的LPS注射期和7 d的恢復(fù)期)和應(yīng)激Ⅱ期(第29～42天，包括7 d的LPS注射期和7 d的恢復(fù)期)。處理1和2飼喂基礎(chǔ)飼糧，處理3和4飼喂試驗(yàn)飼糧(在基礎(chǔ)飼糧中添加750 mg/kg AOP)。分別在應(yīng)激Ⅰ期(試驗(yàn)第15、17、19、21天)和應(yīng)激Ⅱ期(試驗(yàn)第29、31、33、35天)給處理1和3的肉仔雞腹腔注射5 mL/kg BW的LPS溶液(LPS溶液濃度為100 μg/mL生理鹽水)，處理2和4的肉仔雞腹腔注射等量的生理鹽水。在應(yīng)激Ⅰ期(第21天)和應(yīng)激Ⅱ期(第35天)每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只雞，進(jìn)行屠宰、剖腹，迅速取十二指腸組織樣品，用于測(cè)定組織中免疫指標(biāo)及其相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期內(nèi)人工控制舍內(nèi)光照和溫度，并自然通風(fēng)。試驗(yàn)第1周的舍內(nèi)溫度設(shè)定在32～34 ℃，然后每周降低3 ℃，直至21 ℃。試驗(yàn)第1～3天每天保持23 h光照，第4～21天每天保持10 h光照，第22～42天每天保持23 h光照。舍內(nèi)相對(duì)濕度保持在50%～60%，氨氣濃度為5.1～6.2 mg/m3，風(fēng)速約為0.5 m/s。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制玉米-豆粕型粉狀基礎(chǔ)飼糧(表1)，飼養(yǎng)過(guò)程中肉仔雞自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

在試驗(yàn)第1天記錄1日齡肉仔雞的初始體重，于第14、21、28、35和42天對(duì)各處理肉仔雞進(jìn)行稱重、結(jié)料，計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 十二指腸中免疫指標(biāo)

稱取0.5 g十二指腸組織，按1∶9(質(zhì)量體積比)的比例在冰冷的0.9%生理鹽水中用手持式勻漿器勻漿，隨后離心(4 000×g)15 min，取上清保存于-80 ℃。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定勻漿液上清的蛋白濃度，免疫球蛋白(Ig)G、IgM和IgA及IL-1β、IL-2、IL-4和IL-6含量采用泉州市睿信生物科技有限公司研發(fā)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3.3 十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子的基因表達(dá)

表2 引物序列

1.3.4 十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

采用組織或細(xì)胞總蛋白提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]按照說(shuō)明書提取全細(xì)胞蛋白。隨后采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(北京Beyotime生物技術(shù)研究所)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蛋白濃度。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用Western Blot法測(cè)定十二指腸中的TLR4、NF-κB激酶抑制因子復(fù)合體β(IKKβ)、NF-κB的抑制物α(IκBα)、NF-κB p65、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平。主要操作步驟如下：將蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液中(V∶V=4∶1)，煮沸10 min，使蛋白變性，待冷卻后離心收集上清。在各膠孔中加入等量的蛋白質(zhì)(100 μg)后在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離[依次經(jīng)濃縮膠(80 V，30 min)和分離膠(120 V，90 min)]，然后轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜上(100 V，50 min)。轉(zhuǎn)膜完成后，用1×TBST洗滌膜，隨后使用封閉液于室溫下避光封閉1 h。封閉完成后再次洗膜。將膜分別在4 ℃條件下過(guò)夜進(jìn)行一抗孵育：兔抗β-actin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗TLR4多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗IKKβ多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗IκBα單克隆抗體(1∶200稀釋)、兔抗NF-κB p65多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗IL-1β多克隆抗體(1∶10稀釋)和兔抗IL-6多克隆抗體(1∶10稀釋)。次日進(jìn)行相應(yīng)的二抗孵育，將山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶(HPR)(1∶1 000稀釋)室溫?fù)u床孵育1 h。用ECL超敏發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，然后利用凝膠成像系統(tǒng)(VILBER FUSION FX7 Spectra，法國(guó))拍照并對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2分析軟件系統(tǒng)的GLM模型進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，此外，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行2×2雙因素方差分析，模型中的因素包括LPS(應(yīng)激與不應(yīng)激)和AOP(0和750 mg/kg)以及兩者之間的交互效應(yīng)。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)表3。在應(yīng)激前(第1～14天)，飼糧中添加AOP對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。由雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知：在應(yīng)激Ⅰ期(第15～21天)和應(yīng)激Ⅱ期(第29～35天)，以AOP為主效應(yīng)分析，飼糧中添加AOP顯著增加了肉仔雞的ADG(P<0.05)，并顯著降低了F/G(應(yīng)激Ⅰ期，P<0.05)；以LPS為主效應(yīng)分析，注射LPS顯著降低了肉仔雞ADG(應(yīng)激Ⅰ期)和ADFI(P<0.05)；AOP和LPS對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著的互作效應(yīng)(P>0.05)。多重比較結(jié)果顯示：在應(yīng)激Ⅰ期和應(yīng)激Ⅱ期，非應(yīng)激狀態(tài)下，AOP有增加肉仔雞ADG和ADFI的趨勢(shì)，而應(yīng)激狀態(tài)下，AOP顯著緩解了由LPS導(dǎo)致的肉仔雞ADG的下降(P<0.05)。

表3 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

由雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知：在恢復(fù)Ⅰ期(第22～28天)和恢復(fù)Ⅱ期(第36～42天)，以AOP為主效應(yīng)分析，飼糧中添加AOP顯著增加了肉仔雞的ADG和ADFI(P<0.05)；LPS作為主效應(yīng)單獨(dú)作用及LPS與AOP的互作效應(yīng)對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響均不顯著(P>0.05)。多重比較結(jié)果顯示：恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期，非應(yīng)激狀態(tài)下，AOP顯著增加肉仔雞ADG和ADFI(恢復(fù)Ⅰ期)(P<0.05)，應(yīng)激狀態(tài)下，AOP有增加肉仔雞ADG的趨勢(shì)。

2.2 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中免疫指標(biāo)的影響

AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中免疫指標(biāo)的影響見(jiàn)表4。由雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知：以AOP作為主效應(yīng)，飼糧中添加AOP顯著降低了肉仔雞十二指腸中IL-1β(第35天)、IL-6(第21和35天)和IL-4(第21天)的含量(P<0.05)，但卻顯著增加了肉仔雞十二指腸中sIgA(第21天)和IgM(第35天)的含量(P<0.05)；以LPS為主效應(yīng)，注射LPS顯著增加了肉仔雞十二指腸中IL-1β(第21和35天)、IL-6(第21和35天)和IL-4(第21天)的含量(P<0.05)，卻顯著降低了十二指腸中sIgA(第21天)的含量(P<0.05)；LPS與AOP的互作效應(yīng)對(duì)肉仔雞十二指腸中IL-1β(第35天)、IL-6(第21和35天)、IL-2(第21天)、IL-4(第21和35天)、sIgA(第21天)和IgM(第21和35天)的含量有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示：非應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP有提高肉仔雞十二指腸中IL-1β(第35天)和IL-6(第35天)的含量的趨勢(shì)，同時(shí)顯著升高了十二指腸中sIgA(第21天)和IgM(第35天)的含量，而在應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP顯著緩解了由LPS導(dǎo)致的肉仔雞十二指腸中IL-1β(第21和35天)、IL-6(第21和35天)和IL-4(第21天)的過(guò)度產(chǎn)生，且顯著緩解了IgM(第21天)含量的過(guò)度下降(P<0.05)。

表4 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中免疫指標(biāo)的影響

續(xù)表4項(xiàng)目Items-AOP-LPS+LPS+AOP-LPS+LPSP值P-valueSEMP值 P-valueAOPLPSAOP×LPS白細(xì)胞介素-4 IL-4/(pg/mg prot)2.51b3.77a2.27b2.62b<0.010.18<0.01<0.010.04分泌型免疫球蛋白A sIgA/(ng/mg prot)2.67b2.62b4.45a3.13b<0.010.19<0.01<0.010.01免疫球蛋白G IgG/(μg/mg prot)48.0151.5751.7561.170.113.500.100.090.43免疫球蛋白M IgM/(μg/mg prot)11.91ab9.99b11.41b14.16a0.020.810.050.720.01第35天 Day 35白細(xì)胞介素-1β IL-1β/(pg/mg prot)4.01c16.50a6.64bc8.90b<0.010.740.04<0.01<0.01白細(xì)胞介素-6 IL-6/(pg/mg prot)0.45c2.69a0.71bc1.19b<0.010.170.03<0.01<0.01白細(xì)胞介素-2 IL-2/(pg/mg prot)3.364.875.265.060.100.540.170.210.18白細(xì)胞介素-4 IL-4/(pg/mg prot)2.053.662.852.610.060.370.940.080.03分泌型免疫球蛋白A sIgA/(ng/mg prot)3.354.062.963.460.550.450.390.260.85免疫球蛋白G IgG/(μg/mg prot)45.3558.0359.0753.740.335.460.380.500.14免疫球蛋白M IgM/(μg/mg prot)11.37b14.73ab17.62a14.11ab0.041.400.040.850.04

2.3 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子基因表達(dá)的影響見(jiàn)表5。由雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知：以AOP為主效應(yīng)，飼糧中添加AOP顯著降低了肉仔雞十二指腸中IL-1β(第21天)的基因表達(dá)量(P<0.05)；以LPS為主效應(yīng)，注射LPS顯著促進(jìn)了肉仔雞十二指腸中TLR4(第35天)、NF-κBp65(第21和35天)和IL-1β(第21和35天)的基因表達(dá)量(P<0.05)；LPS與AOP的互作效應(yīng)顯著影響肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第35天)及IL-1β(第21天)的基因表達(dá)量(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示：非應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP有提高肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第21天)和IL-1β(第35天)的基因表達(dá)量的趨勢(shì)，而在應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP顯著緩解了由LPS導(dǎo)致的肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第35天)和IL-1β(第21天)基因的過(guò)表達(dá)(P<0.05)。

表5 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

2.4 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖1和表6。由雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知：以AOP為主效應(yīng)，飼糧中添加AOP顯著降低了肉仔雞十二指腸中IKKβ(第21和35天)、NF-κB p65(第35天)、IL-1β(第21和35天)和IL-6(第35天)的蛋白表達(dá)量，顯著升高了十二指腸中IκBα(第21和35天)的蛋白表達(dá)量(P<0.05)；以LPS為主效應(yīng)，注射LPS顯著上調(diào)了肉仔雞十二指腸中TLR4(第35天)、IKKβ(第21和35天)、NF-κB p65(第21和35天)、IL-1β(第21和35天)、IL-6(第21和35天)的蛋白表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低了十二指腸中IκBα(第21和35天)的蛋白表達(dá)量(P<0.05)；LPS與AOP的互作效應(yīng)顯著影響除TLR4(第21天)和IκBα(第35天)外的肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)量(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示：非應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP顯著促進(jìn)了NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子[TLR4(第35天)、IKKβ(第21和35天)、NF-κB p65(第21天)、IL-1β(第21和35天)和IL-6(第35天)]的蛋白表達(dá)(P<0.05)，而在應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP顯著緩解了由LPS導(dǎo)致的肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白(NF-κB p65、IL-1β和IL-6，第21和35天)的過(guò)表達(dá)(P<0.05)，且顯著促進(jìn)了IκBα(第21和35天)的蛋白表達(dá)(P<0.05)。

表6 AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

-：不添加或不注射；+：添加或注射；AOP：黑沙蒿多糖；LPS：脂多糖。-: no addition or no injection; +: addition or injection; AOP: Artemisia ordosica polysaccharide; LPS: lipopolysaccharide.

3 討 論

經(jīng)腹腔或者肌肉注射LPS能夠建立肉仔雞免疫應(yīng)激模型，處于免疫應(yīng)激狀態(tài)下的肉仔雞生長(zhǎng)發(fā)育緩慢[1]，而相關(guān)研究表明添加植物多糖可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[9-10]。然而針對(duì)AOP對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能影響的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，AOP對(duì)LPS刺激前肉仔雞的生長(zhǎng)性能并沒(méi)有顯著影響。在應(yīng)激期，非應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP促進(jìn)了肉仔雞的生長(zhǎng)。此外，飼糧中添加AOP可緩解由LPS導(dǎo)致的肉仔雞生長(zhǎng)的阻滯。在恢復(fù)期，飼糧中添加AOP更有助于肉仔雞從免疫應(yīng)激中恢復(fù)。研究表明，植物提取物可通過(guò)緩解由LPS導(dǎo)致的小腸消化酶活性降低、腸道形態(tài)損傷和腸道菌群改變等途徑來(lái)提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率[11]，進(jìn)而促進(jìn)肉仔雞的生長(zhǎng)發(fā)育，而這也可能是AOP緩解LPS導(dǎo)致的肉仔雞生長(zhǎng)阻滯的主要原因，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

研究表明，LPS是最常用的研究免疫應(yīng)激的細(xì)菌毒素之一，它會(huì)引起全身炎癥和敗血癥[12]。LPS又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分，當(dāng)其進(jìn)入宿主后，會(huì)刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終活化NF-κB信號(hào)通路。而NF-κB信號(hào)通路的主要功能之一是調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α等)的過(guò)度產(chǎn)生與釋放，這些生物活性分子通過(guò)“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生細(xì)菌感染癥狀，引發(fā)動(dòng)物免疫應(yīng)激。本研究表明，飼糧中添加AOP可緩解由LPS導(dǎo)致的肉仔雞十二指腸中IL-1β、IL-6和IL-4的過(guò)度產(chǎn)生，且可緩解IgM的過(guò)度下降，這說(shuō)明AOP可緩解LPS對(duì)肉仔雞十二指腸的免疫應(yīng)激。

如前所述，LPS會(huì)導(dǎo)致TLR4/NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活，而植物多糖可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控免疫細(xì)胞因子的表達(dá)[13]，進(jìn)而緩解由LPS導(dǎo)致的免疫應(yīng)激。其中，腸上皮細(xì)胞TLR4是植物多糖的特異性受體，可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4的轉(zhuǎn)錄水平激活NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而改善LPS引起的機(jī)體損傷[14]。此外，NF-κB作為動(dòng)物免疫應(yīng)答中細(xì)胞因子的調(diào)控通路，既能夠直接調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，還能夠抵抗細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，維持細(xì)胞正常的生理功能，此外，它對(duì)維持動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞屏障的完整性也有一定的作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過(guò)抑制TLR4的基因轉(zhuǎn)錄和NF-κB的抑制物(IκB)的降解，來(lái)減弱NF-κB的激活，進(jìn)而下調(diào)促炎因子表達(dá)，抑制由LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)[16]。據(jù)報(bào)道，人參多糖和黑莓多糖也可降低由LPS刺激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表達(dá)量的提高，從而降低促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌及表達(dá)，減少機(jī)體免疫應(yīng)激反應(yīng)[17-18]。本研究也得出相似的結(jié)論，飼糧中添加AOP緩解了由LPS導(dǎo)致的肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第21天)和IL-1β(第35天)基因的過(guò)表達(dá)，以及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白(NF-κB p65、IL-1β和IL-6)的過(guò)表達(dá)，且促進(jìn)了IκBα的蛋白表達(dá)。這提示AOP可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活來(lái)抑制LPS導(dǎo)致的促炎因子的過(guò)度釋放，從而緩解肉仔雞的免疫應(yīng)激。

此外，本研究表明，非應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加AOP有提高肉仔雞十二指腸中IL-1β、IL-6和IL-4含量的趨勢(shì)，同時(shí)顯著升高了十二指腸中IgA(第21天)和IgM(第35天)的含量，這可能與AOP有提高NF-κBp65(第21天)和IL-1β(第35天)基因表達(dá)的趨勢(shì)，且增加了NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因及其下游靶基因的蛋白表達(dá)有關(guān)，這也揭示了AOP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控是雙向的，即AOP能激活正常靜息狀態(tài)的免疫系統(tǒng)，可輕微刺激肉仔雞十二指腸中促炎因子的表達(dá)。但當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)處在過(guò)度激活狀態(tài)時(shí)，AOP又能下調(diào)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量促炎因子的表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活，這和前人對(duì)云芝糖肽的免疫調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果[19]相一致。據(jù)此推斷，AOP對(duì)不同狀態(tài)下(應(yīng)激與不應(yīng)激)動(dòng)物機(jī)體NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控之所以呈現(xiàn)出看似矛盾的結(jié)果，一方面與其雙向調(diào)控作用有關(guān)，另一方面與其和其他信號(hào)通路的相互作用有關(guān)，故此AOP對(duì)不同信號(hào)通路究竟是發(fā)揮協(xié)同作用、抑制作用還是拮抗作用仍需大量的研究。

4 結(jié) 論

綜上可知，飼糧中添加750 mg/kg AOP可緩解由LPS導(dǎo)致的肉仔雞生長(zhǎng)性能的下降，并通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活來(lái)抑制LPS導(dǎo)致的十二指腸中促炎因子的過(guò)度釋放。