陳 帆 高 揚(yáng) 邊文玲 李玉潔

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院(453003)

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和病理生理學(xué)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的發(fā)病過(guò)程與活性氧(ROS)和抗氧化物質(zhì)的失衡密切相關(guān)[1]。Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路在維持機(jī)體氧化平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)屬于亮氨酸(CNC)調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一，是機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要的轉(zhuǎn)錄因子，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap1)是Nrf2的特異性受體。正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1偶聯(lián)形成聚合物，Nrf2處于相對(duì)失活狀態(tài)；在氧化應(yīng)激等狀態(tài)下時(shí)，Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變，Nrf2從二聚體上解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件，調(diào)控下游抗氧化基因如血紅素氧合酶-1( HO -1)等的表達(dá)，清除多余的氧自由基，從而發(fā)揮抗應(yīng)激作用[2-3]。蘿卜硫素(SFN)是從十字花科植物中提取得到的一類異硫氰酸鹽，具有抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)SFN可激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)HO-1等抗氧化蛋白的表達(dá)[5-6]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用SFN治療EMs大鼠，從Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的方面探討其治療EMs的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性健康未孕SD大鼠，鼠齡8～12周，體質(zhì)量200～250g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。光照與黑暗每12 h交替進(jìn)行，室內(nèi)溫度保持在(24±2)℃，相對(duì)濕度65%。

1.2 試劑與儀器

SFN(含量≥99%)購(gòu)自上海源葉生物有限公司；孕三烯酮膠囊購(gòu)自華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司；兔抗大鼠Nrf2、Keap1、HO-1及β-actin單克隆抗體、二抗山羊抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；大鼠 β-actin內(nèi)參引物購(gòu)自上海生物工程公司；Trizol(總RNA抽提試劑)、cDNA合成試劑盒RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒等購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。220型多通道PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；DYCZ-24DN 型垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；Invitrogen E-Gel Imager凝膠成像儀(美國(guó)Thermo公司)；7500型Real-time PCR儀(德國(guó)Eppenndorf Centrifuge公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore 公司)。

1.3 方法

1.3.1內(nèi)異癥動(dòng)物模型的建立造模組術(shù)前給予己烯雌酚0.02 mg/kg灌胃5 d，使大鼠處于動(dòng)情期。參照改良后的EMs造模方法[7-8]，麻醉并固定大鼠后，對(duì)腹部皮膚進(jìn)行脫毛并消毒，在尿道上端1～2 cm處，沿腹部中線縱向切開(kāi)皮膚及腹壁，暴露子宮，離卵巢1 cm處剪取2 cm長(zhǎng)子宮，斷端結(jié)扎。將所取子宮組織置于洛氏營(yíng)養(yǎng)液中，剪取5 mm ×5 mm內(nèi)膜固定并縫合在腹壁上。0.9%生理鹽水沖洗移植處，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。7 d后隨機(jī)挑選2只造模大鼠，開(kāi)腹顯示病灶處移植物體積增大，為直徑5～8 mm的半透明囊腫，內(nèi)有液體積聚，異位內(nèi)膜有血管形成，提示造模成功。

1.3.2動(dòng)物分組及給藥將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及SFN低、中、高劑量組，每組8只；此外，設(shè)立空白對(duì)照(假手術(shù))組，只進(jìn)行開(kāi)腹手術(shù)，不進(jìn)行子宮剪切及內(nèi)膜移植。利用0.9% NaCl溶液將SFN進(jìn)行稀釋，通過(guò)灌胃法對(duì)低、中、高劑量組大鼠每日分別給與5、10、15 mg/kg的SFN溶液。陽(yáng)性藥物組：給予0.5 mg/kg的孕三烯酮膠囊，每周2次。模型組及空白對(duì)照組：給與相同體積的0.9% NaCl溶液。各組均給藥8周后處死大鼠，計(jì)算子宮內(nèi)膜異位病灶體積和粘連評(píng)分[9]。

1.3.3 Real-time PCR檢測(cè)Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)在無(wú)菌低溫環(huán)境下將內(nèi)膜組織剪碎，采用Trizol一步法提取組織總RNA。利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，當(dāng)A260nm/A280nm的值為1.8～2.2，表示提取的RNA合格。取1500 ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。引物序列由上海生物工程公司根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)合成，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s；95 ℃退火5 s；60 ℃延伸30 s；進(jìn)行40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束獲取循環(huán)閾值，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有反應(yīng)均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，雙ΔCt法計(jì)算 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.4 Western Blot檢測(cè)Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達(dá)取適量RIPA 裂解液勻漿內(nèi)膜組織，12000 r/min 離心10 min，取上清液即為組織總蛋白溶液。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。各樣品取20 μg蛋白，在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳分離，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗在4℃下孵育PVDF膜過(guò)夜。洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:10000)室溫孵育1 h，滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察，目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白對(duì)照組術(shù)后4d活動(dòng)逐漸恢復(fù)正常，毛色光亮，爪甲呈粉紅色，舌頭呈紫紅色，飲食正常。而造模組術(shù)后活動(dòng)量及進(jìn)食減少，爪甲呈暗紅色，舌頭呈暗紫紅色，毛色暗淡雜亂。

2.2 不同劑量SFN對(duì)大鼠病灶體積和粘連評(píng)分影響

相比于模型組，SFN 能有效抑制 EMs大鼠病灶體積和粘連評(píng)分，并呈劑量依賴趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表 2。

表2 各組中大鼠病灶體積和粘連評(píng)分比較

2.3 各組內(nèi)膜組織中Nrf2和HO-1mRNA表達(dá)

模型組 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組(P<0.05)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠內(nèi)膜組織 Nrf2 和 HO-1 mRNA的表達(dá)水平升高(P<0.01) ；此外，與模型組相比，低、中、高劑量SFN組中Nrf2 和 HO-1 mRNA的表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)，并隨藥物濃度升高 Nrf2 和 HO-1 mRNA表達(dá)水平也隨之上調(diào)。見(jiàn)表3。

表3 不同組別內(nèi)膜組織中Nrf2 和HO-1mRNA的表達(dá)水平

2.4 各組內(nèi)膜組織中Nrf2、Keap1和HO-1 蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠內(nèi)膜組織中核蛋白Nrf2及Keap1、HO-1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量SFN組中 Nrf2、Keap1和HO-1蛋白則呈濃度依賴式上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組內(nèi)膜組織中Nrf2、Keap1和HO-1 蛋白表達(dá)水平

從左至右依次是空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組

3 討論

EMs是臨床上常見(jiàn)的良性病變的婦科疾病，不僅有較高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，而且有著如浸潤(rùn)生長(zhǎng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的表現(xiàn)，具有一定的惡變率[10-12]。目前對(duì)于EMs的病因尚不明確，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其是在免疫、內(nèi)分泌、遺傳及內(nèi)、外環(huán)境等多種因素的綜合作用下發(fā)生發(fā)展[13-14]。臨床上針對(duì)EMs的治療主要包括手術(shù)治療和藥物治療。手術(shù)治療主要是直接切除EMs病灶，但這對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能存在影響且術(shù)后易復(fù)發(fā)[15]。藥物治療是通過(guò)避孕藥和孕激素的聯(lián)合口服，從而抑制內(nèi)膜組織異常增生，但其不僅存在相關(guān)激素副作用，而且在用藥期間也并沒(méi)有解決患者的不孕問(wèn)題[16]。因此，尋找治療EMs的新藥物成為亟待解決的問(wèn)題。

研究表明氧化應(yīng)激在促進(jìn)EMs相關(guān)炎癥介質(zhì)(如細(xì)胞因子、活性氧、前列腺素等)的生成中起到了關(guān)鍵作用[17]。辛伐他汀、阿托伐他汀等抗氧化劑均能夠顯著減少EMs基質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而減少子宮內(nèi)膜異位病灶[18-19]。SFN作為一種天然活性物質(zhì)，與細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路都有相互作用，使其具有多種生理活性。其中較為重要的便是SFN可激活Nrf2信號(hào)通路[20]。Nrf2是一種與氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)的組織損傷中的氧化還原的敏感轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于全身各組織器官[21-23]。本實(shí)驗(yàn)將大鼠子宮內(nèi)膜移植于腹壁建造自體內(nèi)膜異位癥模型，模擬臨床上較常見(jiàn)的EMs。通過(guò)灌胃給藥SFN，證明其確實(shí)對(duì)于EMs具有較好的治療效果，使得模型大鼠病灶體積和粘連評(píng)分均顯著降低。此外，SFN還可激活Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路，可明顯刺激 Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平及使Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)?？寡趸窰O-1屬于熱休克蛋白家族，具有明顯的抗炎抗氧化作用，可促進(jìn)失衡的氧化還原反應(yīng)恢復(fù)平衡，減輕自由基損傷[24-25]。

本實(shí)驗(yàn)證明SFN可能通過(guò)激活Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路，上調(diào)HO-1等抗氧化蛋白的表達(dá)而起到治療EMs的效果。但本研究?jī)H證明了SFN的作用與激活Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路有關(guān)，未能得到Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路參與EMs發(fā)生發(fā)展及SFN發(fā)揮治療作用的直接證據(jù)，今后可進(jìn)一步在動(dòng)物及細(xì)胞水平上，使用SFN聯(lián)合信號(hào)通路抑制劑驗(yàn)證該通路在SFN治療EMs中的作用。