李 奕

（中國(guó)戲曲學(xué)院體育部，北京 100073）

襄荷（Zingiber mioga（Thunb.）Rosc）為姜科屬多年生草本植物，具有活血調(diào)經(jīng)、消腫解毒的功效，是保健食品的主要成分[1-2]，富含多糖、黃酮、氨基酸、維生素等化學(xué)物質(zhì)[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于襄荷的研究多集中于栽培繁殖、提取分離等方面，其中許遠(yuǎn)和張思頡等[5-6]曾利用乙醇超聲提取襄荷總黃酮，并發(fā)現(xiàn)其在體外對(duì)多數(shù)活性氧自由基具有較好的清除作用，但未深入探究其體內(nèi)活性?！斑\(yùn)動(dòng)性疲勞”主要源于劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)生成的大量活性氧或自由基導(dǎo)致肌肉組織的損傷和收縮能力的下降，進(jìn)而影響身體的持續(xù)運(yùn)動(dòng)[7-8]。目前某些天然化合物已被發(fā)現(xiàn)其體、內(nèi)外抗氧化活性高度相關(guān)[9]，本研究利用大孔樹脂具有機(jī)械篩分與吸附分離雜質(zhì)的特性[10-11]，采用其純化襄荷黃酮提取物，并考察純化產(chǎn)物對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響，從而為有關(guān)襄荷運(yùn)動(dòng)食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

新鮮襄荷采自湖北恩施市；西洋參：昆明邦宇制藥有限公司生產(chǎn)；蘆丁對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；乳酸（LA）、尿素氮（BUN）和乳酸脫氫酶（LDH）活力檢測(cè)試劑盒：泉州九邦生物科技有限公司；試驗(yàn)用水為去離子水；其余試劑均為分析純；試驗(yàn)動(dòng)物：雄性小鼠100只，體重18～25 g，喂養(yǎng)環(huán)境溫度：20～25℃、相對(duì)濕度：50%～70%，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000型紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；DT-J300型制樣粉碎機(jī)：湖南頂特科技有限公司；BSA124S型電子天平：賽多利斯公司；TL-ST250型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、FD-1A-50型冷凍干燥箱：江蘇天翎儀器有限公司；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海岐耀儀器設(shè)備有限公司；KH20R-II型高速離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；THD-200型恒溫振蕩器：北京亞泰科隆儀器有限公司；AB-8、H-103、D-101型大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；HPD 400、NKA-9型大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮提取液的制備

依照文獻(xiàn)[5]的方法制備襄荷黃酮提取液，最小提取量的具體操作如下：將襄荷根、葉、花苞洗凈后烘干、粉碎，取10.0 g過80目篩后樣品，加入至200 mL 80%乙醇溶液超聲提?。囟?0℃，功率100 W）。濾渣經(jīng)3次重復(fù)提取后，合并濾液，蒸發(fā)濃縮移至100mL容量瓶?jī)?nèi)，加入60%乙醇溶液定容、搖勻，即得黃酮提取液。

1.2.2 黃酮含量測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，平行6次測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中總黃酮含量[12]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.043x+0.011 7（r=0.993 6），其中橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值。隨后，不同洗脫液樣品通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程確定總黃酮含量，減壓蒸發(fā)，濃縮干燥后稱重，進(jìn)而得到產(chǎn)物的黃酮純度。

1.2.3 樹脂型號(hào)選擇

分別稱取5.0g預(yù)處理后的H-103、D-101、AB-8、HPD-400、NKA-9樹脂[13]，放入裝有6 mg/mL 60 mL黃酮提取液的錐形瓶?jī)?nèi)，在室溫下靜態(tài)吸附12 h后過濾。飽和吸附后的樹脂經(jīng)一定量水洗至無提取液殘留后，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入60%乙醇100 mL，室溫靜置12 h后過濾，按照下列公式計(jì)算不同類型樹脂的飽和吸附量、飽和吸附率、洗脫率及回收率[14]。

式中：me為吸附平衡后總黃酮質(zhì)量，mg；m0為樣液初始總黃酮質(zhì)量，mg；m為樹脂干重，g；md為洗脫液中總黃酮質(zhì)量，mg；τe為飽和吸附量，mg/g；Qe為飽和吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R為回收率，%。

1.2.4 等溫吸附試驗(yàn)

向裝有5.0 g AB-8大孔樹脂的錐形瓶?jī)?nèi)分別加入濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的黃酮提取液60 mL，于25、35、45℃振蕩吸附，測(cè)得樹脂的飽和吸附量，繪制等溫吸附線，并利用Langmuir與Freundlich模型擬合[15]。

式中：Qm為黃酮飽和吸附量，mg/g；Qe為黃酮吸附量，mg/g；Kb為L(zhǎng)angmuir方程常數(shù)；Ce為濾液黃酮濃度，mg/mL；Kf為Freundlich方程常數(shù)。

1.2.5 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

向裝有6 mg/mL襄荷黃酮提取液60 mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入5.0 g AB-8大孔樹脂，于25℃振蕩吸附，在不同時(shí)間取樣檢測(cè)上清液中黃酮含量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線[16]。

1.2.6 動(dòng)態(tài)吸附與洗脫條件考察

固定上樣濃度6 mg/mL、上樣液pH為6、上樣流速3 mL/min和上樣液體積60 mL，考察不同上樣濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）、不同上樣液pH（3、4、5、6、7）對(duì)樹脂的吸附率影響，繪制不同上樣流速（1、3、5 mL/min）時(shí)樹脂泄漏曲線；固定洗脫液乙醇濃度60%、洗脫液體積150 mL、洗脫流速2 mL/min，考察不同洗脫液濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)黃酮化合物洗脫率的影響及1、2、3 mL/min洗脫流速下的洗脫曲線。

1.2.7 抗運(yùn)動(dòng)性疲勞實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組，根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)》要求，低、中、高劑量組分別灌胃純化后的黃酮化合物0.10、0.20、0.30 mg/（g·d），陽(yáng)性對(duì)照組給予西洋參灌胃0.10 mg/（g·d），空白對(duì)照組則采用生理鹽水灌胃，全部動(dòng)物每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[17-18]。

1.2.7.2 負(fù)重游泳試驗(yàn)

最后一次灌胃結(jié)束后，各組隨機(jī)抽取10只小鼠，并在鼠尾綁定5%體重重物，放入泳池游泳，記錄其入水到沉入水底超過10 s的時(shí)間[19]。

1.2.7.3 體內(nèi)生化指標(biāo)檢測(cè)

剩余小鼠游泳運(yùn)動(dòng)60 min后，放入鼠籠休息10 min，處死采取血清，按照相關(guān)試劑盒使用說明，檢測(cè)各組小鼠運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)LA、BUN濃度和LDH活力[20]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，比較組間差異，當(dāng)P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型樹脂吸附與解吸性能比較

表1為不同型號(hào)樹脂對(duì)襄荷黃酮的吸附與解吸性能，從表1可見，各類樹脂對(duì)襄荷黃酮的吸附率與洗脫率差異明顯，究其原因在于各類樹脂的比表面積與極性不同。AB-8大孔樹脂對(duì)襄荷黃酮的吸附率最高，達(dá)到89.2%，且回收率超過80%，其他樹脂對(duì)其回收率從高到底依次為：HPD-400＞H-103＞D-101＞NKA-9，這可能源于黃酮化合物的結(jié)構(gòu)中存在較多羥基衍生物，具有一定極性，因此與弱極性樹脂的相互作用較好[21]，因而確定采用AB-8樹脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同樹脂的吸附率、洗脫率及回收率比較Table 1 Comparison of adsorption rate,elution rate and recovery rate of different resins(n=6)

2.2 等溫吸附試驗(yàn)

圖1為AB-8大孔樹脂于不同溫度對(duì)襄荷黃酮的等溫吸附曲線，隨著提取液濃度的增大，樹脂的飽和吸附量逐漸增大，然而隨著溫度升高，其飽和吸附量卻不斷減小，分別利用Langmuir和Freundlich吸附模型對(duì)其等溫吸附線擬合，見表2。從表2可知，在不同溫度下，AB-8大孔樹脂的吸附曲線符合Langmuir模型特征，各方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.95。

表2 等溫吸附線擬合方程Table 2 The fitting equations of adsorption isotherms

圖1 等溫吸附曲線Fig.1 Adsorption isothermsin different temperatures

2.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

從圖2可知，在0～3 h內(nèi)，樹脂對(duì)黃酮的吸附率迅速升高，隨后緩慢于6 h達(dá)到平衡，表明AB-8大孔樹脂對(duì)襄荷黃酮的吸附速率較快，具有實(shí)際應(yīng)用前景。

圖2 AB-8大孔樹脂對(duì)襄荷黃酮的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The static adsorption kinetics curve of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavonoid by AB-8 macroporousresin

2.4 吸附條件選擇

2.4.1 上樣濃度對(duì)吸附率的影響

圖3為不同上樣濃度對(duì)AB-8樹脂吸附襄荷黃酮的影響，當(dāng)上樣濃度為6 mg/mL時(shí)，吸附率達(dá)到最高為87.8%，上樣濃度過高時(shí)，黃酮溶解度下降，容易導(dǎo)致樹脂的堵塞或泄露，同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)也越來越多，致使黃酮吸附率進(jìn)一步降低，因此襄荷黃酮最適宜上樣濃度為6 mg/mL。

圖3 上樣濃度對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sampleconcentration on the adsorption rate

2.4.2 上樣液pH對(duì)吸附率的影響

圖4為不同上樣液pH對(duì)AB-8樹脂吸附襄荷黃酮的影響，從圖4可見，吸附率隨pH的升高出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH為6時(shí)，吸附率達(dá)到最高，為88.4%，這可能源于黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有1-氧原子，存在未共用電子對(duì)，表現(xiàn)出堿性，因而在強(qiáng)酸下易形成“徉鹽”，不利于樹脂的吸附，這與黃酮純化相關(guān)研究結(jié)果一致[22-23]，因此考慮最適宜上樣液pH為6。

圖4 上樣液pH對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of sample pH on the adsorption rate

2.4.3 不同上樣流速下樹脂泄漏曲線

圖5為不同上樣流速下樹脂的泄露曲線，從圖中可知，隨著上樣液體積的增加，泄露液中黃酮化合物的濃度逐漸增大至完全等于上樣液初始濃度，這歸因于若上樣液體積過多且流速過快時(shí)，黃酮化合物不能與樹脂充分接觸發(fā)生吸附作用，且樹脂易于過載。通常認(rèn)為泄漏液中黃酮濃度約為10%上樣濃度時(shí)，樹脂開始泄漏，考慮實(shí)際吸附效率，選擇最適宜上樣流速為3 mL/min，上樣液體積60 mL。

圖5 不同上樣流速下樹脂的泄漏曲線Fig.5 The leakagecurve of resin at different loading flow rates

2.5 洗脫條件選擇

2.5.1 洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響

圖6為不同濃度洗脫液對(duì)樹脂洗脫率的影響，當(dāng)洗脫液乙醇濃度超過60%時(shí)，樹脂的洗脫率開始逐漸降低，這是由于洗脫液濃度越大，其極性愈低，易于洗脫黃酮，但濃度過高時(shí)，其與黃酮化合物的極性差異明顯，洗脫難度變大，因此洗脫液乙醇的最適宜濃度為60%。

圖6 洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響Fig.6 Effect of eluent concentration on theelution rate

2.5.2 不同洗脫流速的解吸曲線

若洗脫流速過快，洗脫劑與樹脂內(nèi)吸附的黃酮作用力變?nèi)?，為此考察不同洗脫流速下的解吸曲線，結(jié)果見圖7。隨著洗脫流速增大，完全洗脫吸附在樹脂內(nèi)的襄荷黃酮所消耗的洗脫劑用量越來越多，當(dāng)以2 mL/min流速洗脫吸附樹脂時(shí)，洗脫曲線單一、對(duì)稱、尖銳且無明顯拖尾，因此選擇最宜洗脫流速為2 mL/min，洗脫液體積150 mL。

圖7 三種洗脫流速下的解吸曲線Fig.7 Thedesorption curveat three eluent flow rate

2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

綜上所述，確定大孔樹脂純化襄荷黃酮提取物的最佳純化工藝為：60 mL上樣濃度為6 mg/mL襄荷黃酮（pH 6.0），上樣流速3 mL/min，洗脫流速為2 mL/min，洗脫液乙醇濃度60%，洗脫液體積為150 mL，飽和吸附率與洗脫率分別達(dá)到87.5%和90.3%，產(chǎn)物的總黃酮純度由11.25%±0.46%提高至47.52%±1.37%，約為4.2倍，表明通過AB-8大孔樹脂純化后，襄荷黃酮提取物中的蛋白、色素等雜質(zhì)被有效去除，因此該樹脂適于襄荷黃酮提取物的純化。

2.7 抗運(yùn)動(dòng)性疲勞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 襄荷黃酮對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

負(fù)重游泳時(shí)間可真實(shí)反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力。從表3可知，在設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，隨著純化產(chǎn)物劑量的增大，動(dòng)物負(fù)重游泳時(shí)間呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組動(dòng)物的負(fù)重時(shí)間均有延長(zhǎng)，具有極顯著性差異（P＜0.01），表明中、高劑量的襄荷黃酮有助于提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，而低劑量組雖有延長(zhǎng)，但差異不顯著，這可能與劑量選擇或小鼠的個(gè)體差異有關(guān)，但陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的游泳時(shí)間較高劑量組延長(zhǎng)1.79 min，差異具有極顯著性（P＜0.01）。

表3 襄荷黃酮對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table 3 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavonesonexhaustive swimming time of mice

2.7.2 襄荷黃酮對(duì)乳酸相關(guān)指標(biāo)的影響

機(jī)體過度運(yùn)動(dòng)，易造成細(xì)胞缺氧，使得部分血糖轉(zhuǎn)化成乳酸，從而影響肌肉張力，而乳酸脫氫酶有利于催化乳酸脫氫，加快其代謝排出[24]。運(yùn)動(dòng)后不同組別小鼠體內(nèi)的乳酸濃度與乳酸脫氫酶活力結(jié)果見表4。從表4可知，與空白對(duì)照組相較，襄荷黃酮低、中、高劑量組小鼠的體內(nèi)乳酸濃度均明顯偏低，且乳酸脫氫酶活力均有一定幅度的增強(qiáng)，表明襄荷黃酮有助于改善運(yùn)動(dòng)后小鼠體內(nèi)的乳酸與乳酸脫氫酶水平，高劑量小鼠的乳酸濃度較陽(yáng)性對(duì)照組高1.08 mmol/L，乳酸脫氫酶活力較陽(yáng)性對(duì)照組低413 U/L，具有極顯著差異（P＜0.01）。

表4 襄荷黃酮對(duì)小鼠BLA濃度和LDH活力的影響Table 4 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavoneson BLA concentration and LDH activity in mice

2.7.3 襄荷黃酮對(duì)尿素氮濃度的影響

機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致血糖供應(yīng)不足，容易造成體內(nèi)蛋白質(zhì)或氨基酸的分解利用，致使代謝產(chǎn)物尿素氮濃度增大[25]。表5為運(yùn)動(dòng)后不同組別動(dòng)物體內(nèi)尿素氮濃度，從表5可知，空白對(duì)照組的尿素氮濃度與低劑量組相較無顯著性差異，而中、高劑量組小鼠的尿素氮濃度均明顯低于空白對(duì)照組，表明機(jī)體在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，中、高劑量的襄荷黃酮有利于減少體內(nèi)蛋白質(zhì)分解，高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組均與空白對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01）。

表5 襄荷黃酮對(duì)小鼠BUN濃度的影響Table5 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavoneson BUN concentration in mice

3 結(jié)論

本研究探討了大孔樹脂純化襄荷黃酮的最佳工藝條件，并分析純化產(chǎn)物對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響。通過單因素試驗(yàn)得到最佳純化工藝條件為：60 mL上樣濃度為6 mg/mL襄荷黃酮（pH 6.0），上樣流速3 mL/min，洗脫流速為2 mL/min，洗脫液乙醇濃度60%，洗脫液體積為150 mL，產(chǎn)物的總黃酮純度由11.25%提高至47.52%，約為4.2倍。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，襄荷黃酮可明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，增強(qiáng)乳酸脫氫酶的活性，降低了機(jī)體的尿素氮含量，從而減小運(yùn)動(dòng)過程中乳酸的生成及蛋白質(zhì)或氨基酸的分解，因此該研究可為襄荷黃酮的抗疲勞功能性食品的開發(fā)提供參考，有利于促進(jìn)該資源的開發(fā)利用。