張 偉，金庭飛，黎 旭 *，張凱莉

（1.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 511356；2.廣東益可維生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510520；3.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱[1]。乳酸菌廣泛存在于人體腸道中，并對人體具有重要的益生功能[2-3]，包括維持腸道粘膜的屏障功能，調(diào)節(jié)免疫力，改善腸道炎癥性疾病等。另外，乳酸菌被廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪、馬奶酒[4]、果蔬汁及谷物發(fā)酵中[5]。乳酸菌含有豐富的蛋白水解酶系[6]，是重要的蛋白酶生產(chǎn)來源之一，通過發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶可在食品加工中將蛋白質(zhì)分解為功能多肽及游離氨基酸，起到提高食物消化效率、產(chǎn)生食品獨(dú)特風(fēng)味、生成功能性成分并進(jìn)一步增加發(fā)酵底物附加值等作用[7]。另外，高產(chǎn)蛋白酶乳酸菌能夠應(yīng)用于皮革加工[8]、絲綢加工[9]、食品[10]、釀造[11]、醫(yī)藥[12]等方面。

產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選在國內(nèi)外仍然有很高的研究價(jià)值；彈性蛋白酶可由動物胰臟提取或由微生物發(fā)酵制得，其可用于生產(chǎn)治療高血脂癥、防止動脈粥樣硬化的藥物[13]，另外，彈性蛋白酶在肉的嫩化和動物蛋白質(zhì)的水解等方面也有應(yīng)用[14]。張?zhí)m等[15]采用酪蛋白平板法從雞糞中篩選出一株短小芽孢桿菌，并對該菌所產(chǎn)蛋白酶酶學(xué)特性進(jìn)行分析。于豪杰[16]采用發(fā)酵的方法對豆粕中大分子蛋白進(jìn)行酶解處理，篩選出的產(chǎn)蛋白酶乳酸菌菌種有發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌等。國外有研究表明[17]，短乳桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可以增強(qiáng)非洲山藥豆的營養(yǎng)價(jià)值，并證明對白化病大鼠的生長和血液指標(biāo)有改善作用。微生物生長中所需能量和構(gòu)建細(xì)胞骨架所需原料主要由培養(yǎng)基中碳源提供，碳源不同，蛋白酶的活力也有所不同[18]。氮源主要為菌體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及菌體內(nèi)的含氮代謝物（如核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等）提供合成原料，氮源種類可以影響蛋白水解后的氨基酸回收率[19]。金屬離子在蛋白酶生物催化過程中，可作為酶的輔因子或輔基產(chǎn)生作用，可以控制蛋白酶水解反應(yīng)，有研究表明，不同金屬離子對胰蛋白酶活性有影響[20]。磷酸鹽能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，培養(yǎng)環(huán)境的氫離子濃度可以影響蛋白酶的活性[21]。于宏偉等[22]篩選出了一株產(chǎn)中性蛋白酶的菌株，并對其產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)牛肉膏作為碳源時(shí)效果最好，其次是玉米粉和小麥淀粉，氮源的效果為玉米漿＞豆餅粉＞氯化銨＞硝酸鉀，金屬離子中對酶有顯著激活作用的為鐵離子。方芳等[23]對產(chǎn)耐熱蛋白酶乳酸菌的篩選和產(chǎn)酶特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌在以葡萄糖為碳源，蛋白胨＋牛肉膏＋酵母粉為復(fù)合氮源，碳氮比為0.8，pH值為7.0的培養(yǎng)基下，篩選的乳酸菌具有最大產(chǎn)酶量，產(chǎn)酶量為13.13 U/mL，并指出K2HPO4、MgSO4有促進(jìn)蛋白酶含量增加作用。

本研究采用福林-酚法與酪蛋白透明圈法對新疆傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌進(jìn)行分離篩選，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA序列對菌株進(jìn)行鑒定，并以蛋白酶活作為評價(jià)指標(biāo)，以碳源、氮源、金屬鹽、磷酸鹽的種類和添加量作為影響因素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化高產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的產(chǎn)酶條件?？蔀楦弋a(chǎn)蛋白酶乳酸菌的應(yīng)用提供參考與支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新疆少數(shù)民族傳統(tǒng)乳制品（奶疙瘩、酸牛奶、非蒸餾型馬奶酒）樣品：奶疙瘩采自新疆伊犁地區(qū)；酸牛奶采自新疆石河子市南山牧場；馬奶酒采自新疆塔城地區(qū)額敏縣。

1.1.2 化學(xué)試劑

F8060福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：德國默克公司；DP302脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種篩選固體培養(yǎng)基：南京信帆生物技術(shù)有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R離心機(jī)：德國艾本德公司；Alpha1500紫外分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司；ZXSD-1160全自動生化培養(yǎng)箱：上海智誠儀器有限公司；BX43顯微鏡：日本奧林巴斯公司；T-100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-SubCell核酸電泳儀：美國Bio Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的富集與分離

取約1 g奶疙瘩中部樣品于生理鹽水中37 ℃浸泡軟化，移液器吹打均勻并進(jìn)行100倍稀釋，采用劃線法蘸取稀釋樣品液進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)；酸牛奶、馬奶酒樣本旋渦混勻后各取1 mL進(jìn)行梯度稀釋，取合適梯度，采用傾注法進(jìn)行培養(yǎng)，獲得單菌落。

培養(yǎng)完成后觀察菌落形態(tài)，挑取形態(tài)學(xué)特征不同的單菌落進(jìn)行多次培養(yǎng)劃線，直至鏡檢視野下菌株形態(tài)一致，從而得到純化的菌株。將純化后的乳酸菌接種至液體MRS培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)18h至對數(shù)生長期后，進(jìn)行甘油管保藏。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的復(fù)篩

取保藏的菌株甘油管，按2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～18 h，3 500×g、4 ℃離心10 min，得到菌泥后用生理鹽水再次重懸獲得菌懸液，將菌懸液按2%接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，35 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，取500 μL菌液（108CFU/mL）離心（3 500×g、4 ℃）10 min，取離心后的10 μL上清液加入牛津杯中，在脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)24 h，當(dāng)培養(yǎng)基中的酪蛋白被微生物分泌的蛋白酶分解后，在牛津杯的周圍形成透明圈，挑選HE值較大的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，測定透明圈的HE值，其計(jì)算公式如下：

式中：ΦA(chǔ)為透明圈直徑，mm；ΦB為菌落直徑，mm。

1.3.3 目標(biāo)菌株的篩選

采用福林-酚法測定蛋白酶活性。研究表明[24-25]透明圈直徑大小以及透明圈與菌落直徑的比值與蛋白酶活力高低無顯著正相關(guān)，蛋白酶水解酪蛋白，其產(chǎn)物酪氨酸能在堿性條件下使福林-酚試劑還原，生成組藍(lán)與鎢藍(lán)，以比色法在波長680 nm處測定OD680nm值，每個(gè)樣品做3次平行。乳酸菌于35 ℃的溫度下在液體發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，將1 mL發(fā)酵液離心，所收集的上清液即為粗酶液，測定蛋白酶活性。

蛋白酶活力定義：1 g 酶粉或1 mL酶液，在40 ℃、pH=7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.4 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定

將分離純化獲得的菌接種在MRS平板上充分培養(yǎng)，待菌落形態(tài)成型時(shí)，觀察其單個(gè)菌落的形狀、顏色、光滑度、透明度及邊緣整齊度。從MRS培養(yǎng)基挑選出的過氧化氫陰性菌經(jīng)革蘭染色后，若細(xì)胞在顯微鏡下呈藍(lán)紫色，則為乳酸菌，若呈紅色，則將其排除。

乳酸菌DNA的提?。罕驹囼?yàn)采用試劑盒法對乳酸菌菌株中的DNA進(jìn)行了提取，具體提取步驟按照生產(chǎn)商說明書進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增：乳酸菌使用引物27F和1492R[26]，PCR擴(kuò)增體系均為50μL，先加入引物及菌株DNA各2.0μL，然后加入25μL的2×TaqMaster Mix（Dye Plus）和19 μL的雙蒸水（ddH2O）搖勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)步驟參考TARTORY等[27]的方法。

PCR產(chǎn)物檢測：取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入到1%的瓊脂糖凝膠[28]（含0.01%的goldview Ⅱ染料）孔中，將電泳儀的電壓和電流分別設(shè)置為100 V和90 mA，在1×TAE 電泳緩沖液中電泳40 min，待條帶跑至距膠孔另一端1/3處，即可將膠板取出用凝膠成像儀進(jìn)行觀察。

菌株序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：在測序公司完成測序后，將所得的16Sr DNA序列提交到美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）Gen Bank數(shù)據(jù)庫中與標(biāo)準(zhǔn)菌序列進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[29]。

1.3.5 乳酸菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

碳源及最佳碳源添加量對菌株產(chǎn)蛋白酶活力影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%[30]的碳源（葡萄糖、蔗糖、D-果糖、低聚半乳糖、可溶性淀粉），最佳碳源添加量（1.0%、2.0%、4.0%），將篩選出來的目標(biāo)菌株在35 ℃培養(yǎng)24 h，測定蛋白酶活力。

氮源及最佳氮源添加量對菌株產(chǎn)蛋白酶活力影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%的氮源（蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀、硫酸銨、檸檬酸三銨），最佳氮源添加量（1.0%、2.0%、4.0%），測定蛋白酶活力。

金屬鹽及最佳金屬鹽添加量對菌株產(chǎn)蛋白酶活力影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.01%的金屬鹽（NaCl、CuSO4·7H2O、BaCl2、MgSO4·7H2O、MnSO4），最佳金屬鹽添加量（0.01%、0.02%、0.04%），測定蛋白酶活力。

磷酸鹽及最佳磷酸鹽添加量對菌株產(chǎn)蛋白酶活力影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%的磷酸鹽（K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4），最佳磷酸鹽添加量（0.5%、0.7%、0.9%），同上條件培養(yǎng)，測定蛋白酶活力。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛋白酶酶活為評價(jià)指標(biāo)，分別選取葡萄糖添加量（A）、牛肉膏添加量（B）、MgSO4·7H2O添加量（C）、K2HPO4添加量（D）添加量為影響因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for proteaseproducing conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017作圖，利用SPSS 25.0進(jìn)行差異性分析；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)分析過程中，當(dāng)P＜0.05，表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的分離與初篩

以菌落透明圈直徑作為依據(jù)對菌株進(jìn)行初篩，篩選菌株的菌落形態(tài)及透明圈直徑見表2。由表2可知，16株菌有10株菌產(chǎn)蛋白酶。

表2 產(chǎn)蛋白酶菌株的菌落形態(tài)及透明水解圈直徑Table 2 Colony morphology and hydrolysis circle of protease-producing strains

將初篩的16株乳酸菌菌株接種于脫脂牛乳培養(yǎng)基后，測定其透明圈直徑。將透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株定義為目標(biāo)菌株，最終得到4株菌株，編號為A1～A4，4株菌的脫脂牛乳平板培養(yǎng)基透明圈見圖1。測量各菌株的HE值大小，依次排序?yàn)锳2＞A4＞A3＞A1。

圖1 脫脂牛乳平板培養(yǎng)基上篩選菌株的透明圈Fig.1 Transparent circle of screened strains on the skimmed milk plate medium

2.2 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的復(fù)篩

初篩獲得的菌株產(chǎn)蛋白酶酶活力值結(jié)果見表3。不同菌株所產(chǎn)蛋白酶活性存在顯著差異（P＜0.05），其中菌株A2的蛋白酶活力最高，為14.85 U/mL。因此，挑選菌株A2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 篩選菌株產(chǎn)蛋白酶酶活測定結(jié)果Table 3 Determination results of enzyme activities of screened strains

2.3 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的菌種鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對初步篩選得到的4株菌進(jìn)行劃線培養(yǎng)，4株菌的菌落與菌體形態(tài)見圖2。

圖2 篩選菌株的菌落（A）與菌體形態(tài)（B）Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphologies of screened strains

由圖2A可知，菌落表面光滑，顏色為乳白色，表面光滑、突起。由圖2B可知，4株菌的革蘭氏染色均為陽性，菌株A1、A4細(xì)胞形態(tài)為球菌，菌株A2、A3細(xì)胞形態(tài)為桿狀或短棒狀。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

對篩選出來的4株菌使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S rDNA序列篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of screened strains based on 16S rDNA sequence

由圖3可知，菌株A2與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株A1、A3、A4分別與戊糖片球菌（Peciococcus pentosaceus）、短乳桿菌（Lactobacillxus brevis）、乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）的同源性為100%。因此，菌株A1、A2、A3、A4分別被鑒定為戊糖片球菌（Peciococcus pentosaceus）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、短乳桿菌（Lactobacillxus brevis）、乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）。

2.4 菌株A2產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.4.1 不同碳源對菌株A2產(chǎn)蛋白酶的影響

考察不同種類碳源在不同添加量下對A2菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的影響，結(jié)果如表4所示，3個(gè)不同添加量下，葡萄糖均為最佳碳源，蛋白酶活力隨添加量的增加而增加；以4%葡萄糖作為碳源時(shí)，蛋白酶活力最高，酶活力值達(dá)到16.25 U/mL。而乳酸菌對低聚半乳糖的利用率最低，蛋白酶活僅為6.17 U/mL。D-果糖和可溶性淀粉對蛋白酶活的影響較為相近。因此，選擇最佳碳源添加量為4%葡萄糖。

表4 不同碳源對乳酸菌A2產(chǎn)蛋白酶活力的影響Table 4 Effect of different carbon sources on protease activity produced by strain A2 U/mL

2.4.2 氮源對乳酸菌A2產(chǎn)蛋白酶的影響

以蔗糖作為碳源，測定菌株A2在1%氮源（牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸三銨、硝酸鉀、硫酸銨）下發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力，結(jié)果見表5。由表5可知，牛肉膏在4%添加量條件下，菌株A2產(chǎn)生的蛋白酶活力最高，可達(dá)到16.98 U/mL，并且隨著牛肉膏添加量的上升，酶活力不再上升。因此，最佳碳源添加量為4%牛肉膏。

表5 不同氮源對菌株A2產(chǎn)蛋白酶活力的影響Table 5 Effect of different nitrogen sources on protease activity produced by strain A2 U/mL

2.4.3 金屬鹽對乳酸菌A2產(chǎn)蛋白酶的影響

以蔗糖為碳源，以蛋白胨為氮源，加入含量為0.01%的5種金屬鹽，考察對蛋白酶活力的影響，結(jié)果見表6。由表6可知，金屬鹽MgSO4·7H2O添加量為0.02%時(shí)，蛋白酶活力最大，為14.98 U/mL。且蛋白酶活力依次為MgSO4·7H2O＞BaCl2＞CuSO4·7H2O＞MnSO4＞NaCl，顯示出鎂離子在菌株A2代謝蛋白酶過程中起到關(guān)鍵作用。因此，最佳金屬鹽MgSO4·7H2O添加量為0.02%。

表6 不同金屬鹽對乳酸菌A2產(chǎn)蛋白酶活力的影響Table 6 Effect of different metal salts on protease activity produced by strain A2 U/mL

2.4.4 磷酸鹽對乳酸菌A2產(chǎn)蛋白酶的影響

以蔗糖為碳源，以蛋白胨為氮源，MgSO4·7H2O為金屬鹽，結(jié)果見表7。由表7可知，添加K2HPO4時(shí)菌株A2產(chǎn)蛋白酶活力最大，不同添加量比較下，K2HPO4添加量為0.7%時(shí)所有組的蛋白酶活力最高，磷酸鹽排序?yàn)椋篕2HPO4＞Na2HPO4＞KH2PO4＞NaH2PO4。因此，最佳磷酸鹽K2HPO4添加量為0.7%。

表7 不同磷酸鹽對產(chǎn)蛋白酶活力的影響Table 7 Effect of different phosphates on protease activity produced by strain A2 U/mL

2.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛋白酶酶活為評價(jià)指標(biāo)，分別選取葡萄糖添加量（A）、牛肉膏添加量（B）、MgSO4·7H2O添加量（C）、K2HPO4添加量（D）為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化菌株A2產(chǎn)酶條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表8，方差分析結(jié)果見表9。

由表8可知，各因素對產(chǎn)蛋白酶影響順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即牛肉膏添加量＞葡萄糖添加量＞K2HPO4添加量＞MgSO4·7H2O添加量，最優(yōu)產(chǎn)酶條件組合為A2B2C1D2，即葡萄糖添加量4%、牛肉膏添加量4%、MgSO4·7H2O添加量0.02%、K2HPO4添加量0.7%。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株A2產(chǎn)蛋白酶最高為65.92 U/mL。由表9可知，4種因素對蛋白酶活的影響均極顯著（P＜0.01）。

表8 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic production conditions optimization

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests results

3 結(jié)論

本研究通過初篩與復(fù)篩，從傳統(tǒng)乳制品中篩選出產(chǎn)蛋白酶活力好的菌株4株，（編號為A1～A4），分別被鑒定為戊糖片球菌（Peciococcus pentosaceus）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、短乳桿菌（Lactobacillxus brevis）、乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）。在以4.0%葡萄糖為碳源、4.0%牛肉膏為氮源、0.02%的鎂離子為金屬鹽、0.7%的K2HPO4為磷酸鹽的條件下，菌株A2產(chǎn)蛋白酶活最高為65.92 U/mL。